Protokoll för europeisk ål mognad och spermier frysförvaring har förbättrats de senaste åren. Denna artikel beskriver det bästa protokollet som är tillgängliga med hjälp av humant koriongonadotropin (hCG) för att inducera mognad och metanol som frysskyddmedel.
Under de senaste åren har har flera forskargrupper arbetat med utveckling och förbättring av nya protokoll för europeisk ål hantering och mognad. Som av ännu, har veckovisa injektioner av humant koriongonadotropin (hCG) visat för att cyter hanar efter bara 5-6 veckors behandling, producerar stora volymer av hög kvalitet spermier under flera veckor. Dessutom har spermier frysförvaring protokoll använder olika förlängare, cryoprotectants, kylning och upptining gånger tidigare beskrivits för europeisk ål. Här visar vi att Tanaka´s extender lösning kan användas direkt för befruktning eller för frysförvaring, att göra onödiga användningen av olika typer av lösningar och spädningar. Dessutom, användning av metanol som en frysskyddmedel gör detta protokoll lättanvänd eftersom metanol har låg toxicitet och aktiverar inte spermier. Spermierna behöver inte förvaras i fryst tillstånd omedelbart efter tillsats av frysskyddmedel och den kan användas länge efter att vara tinade. Dessutom är spermierörlighet fortfarande hög efter upptining även om det är lägre än för färsk sperma. Syftet med detta arbete är att visa de bästa tillgängliga protokollet för europeisk ål hantering, mognad och spermier frysförvaring.
De senaste 25 åren har har antalet europeiska ålen (Anguilla anguilla) anländer till den europeiska kusten minskat stadigt med 90% 1,2,3. I området i närheten finns det flera faktorer som förklarar denna drastiska minskning inklusive föroreningar, infektioner, överfiske och livsmiljö förstörs. Allt detta har haft en djupgående effekt på denna art, vilket ledde till införandet av den europeiska ålen på den internationella unionen för naturvårdsunionen (IUCN) lista som kritiska utrotningshotade 4. Utvecklingen av tekniker och protokoll för reproduktion i fångenskap är således nödvändig.
Mognaden av den europeisk ål i fångenskap uppnås genom hormonell behandling 5,6,7 , men produktionen av könsceller hos båda könen är svårt att synkronisera 8. Även om utvecklingen av nya androgen implantat har visat för att påskynda oogenes i ål 9,är10, tidpunkten för slutliga mognad hos kvinnor fortfarande mycket varierande och svårt att kontrollera 11. Därför är kortvarig förvaring av sperma 12,13,14 och frysförvaring tekniker krävs för reproduktion förvaltning, att göra könsceller synkronisering onödiga 8.
Frysförvaring av europeisk ål spermier har utvecklats sedan 2003 15,16. Flera forskare konstruerade framgångsrika protokoll med hjälp av dimetyl sulfoxid (DMSO) eller metanol som cryoprotectants 16,17,18,19,20. Även om båda protokollen har använts framgångsrikt, är den erhållna cellviabiliteten tinade spermier fryst tillstånd med DMSO lägre än med metanol 20,21. Dessutom ål spermier aktiveras vid kontakt med DMSO och kräver mer tråkiga spermier manipulation 19, metanol är därför en mer passande frysskyddmedel för europeisk ål spermier än DMSO.
Här, kommer protokollet för optimal hantering och hormonell behandling av den europeiska ålen att beskrivas nedan. Utöver detta kommer också det bästa europeiska ål spermier frysförvaring protokoll använder metanol som en frysskyddmedel och ett protokoll för bedömning av spermiekvalitet hos denna art beskrivas.
Det här protokollet beskriver hela processen för europeisk ål mognad, hantering och spermier frysförvaring. Om djurhållning villkoren här är optimal för snabb mognad och produktion av stora volymer av hög kvalitet sperma i denna art 6,7,25. Framgången för frysförvaring protokollet och dess potentiella användning för befruktning efter upptining är kraftigt beroende av kvaliteten på färsk sperma …
The authors have nothing to disclose.
Denna publikation har finansierats av EU: s Horizon 2020 forskning och innovation-programmet under Marie Sklodowska-Curie bidragsavtalet ingen 642893 (IMPRESS), det COST-kontoret (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) och Research Centre of Excellence- 1476-4/2016/FEKUT.
AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
NaCl | Avantor | 3624-19 | |
Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |