Summary
Protokoll för europeisk ål mognad och spermier frysförvaring har förbättrats de senaste åren. Denna artikel beskriver det bästa protokollet som är tillgängliga med hjälp av humant koriongonadotropin (hCG) för att inducera mognad och metanol som frysskyddmedel.
Abstract
Under de senaste åren har har flera forskargrupper arbetat med utveckling och förbättring av nya protokoll för europeisk ål hantering och mognad. Som av ännu, har veckovisa injektioner av humant koriongonadotropin (hCG) visat för att cyter hanar efter bara 5-6 veckors behandling, producerar stora volymer av hög kvalitet spermier under flera veckor. Dessutom har spermier frysförvaring protokoll använder olika förlängare, cryoprotectants, kylning och upptining gånger tidigare beskrivits för europeisk ål. Här visar vi att Tanaka´s extender lösning kan användas direkt för befruktning eller för frysförvaring, att göra onödiga användningen av olika typer av lösningar och spädningar. Dessutom, användning av metanol som en frysskyddmedel gör detta protokoll lättanvänd eftersom metanol har låg toxicitet och aktiverar inte spermier. Spermierna behöver inte förvaras i fryst tillstånd omedelbart efter tillsats av frysskyddmedel och den kan användas länge efter att vara tinade. Dessutom är spermierörlighet fortfarande hög efter upptining även om det är lägre än för färsk sperma. Syftet med detta arbete är att visa de bästa tillgängliga protokollet för europeisk ål hantering, mognad och spermier frysförvaring.
Introduction
De senaste 25 åren har har antalet europeiska ålen (Anguilla anguilla) anländer till den europeiska kusten minskat stadigt med 90% 1,2,3. I området i närheten finns det flera faktorer som förklarar denna drastiska minskning inklusive föroreningar, infektioner, överfiske och livsmiljö förstörs. Allt detta har haft en djupgående effekt på denna art, vilket ledde till införandet av den europeiska ålen på den internationella unionen för naturvårdsunionen (IUCN) lista som kritiska utrotningshotade 4. Utvecklingen av tekniker och protokoll för reproduktion i fångenskap är således nödvändig.
Mognaden av den europeisk ål i fångenskap uppnås genom hormonell behandling 5,6,7 , men produktionen av könsceller hos båda könen är svårt att synkronisera 8. Även om utvecklingen av nya androgen implantat har visat för att påskynda oogenes i ål 9,är10, tidpunkten för slutliga mognad hos kvinnor fortfarande mycket varierande och svårt att kontrollera 11. Därför är kortvarig förvaring av sperma 12,13,14 och frysförvaring tekniker krävs för reproduktion förvaltning, att göra könsceller synkronisering onödiga 8.
Frysförvaring av europeisk ål spermier har utvecklats sedan 2003 15,16. Flera forskare konstruerade framgångsrika protokoll med hjälp av dimetyl sulfoxid (DMSO) eller metanol som cryoprotectants 16,17,18,19,20. Även om båda protokollen har använts framgångsrikt, är den erhållna cellviabiliteten tinade spermier fryst tillstånd med DMSO lägre än med metanol 20,21. Dessutom ål spermier aktiveras vid kontakt med DMSO och kräver mer tråkiga spermier manipulation 19, metanol är därför en mer passande frysskyddmedel för europeisk ål spermier än DMSO.
Här, kommer protokollet för optimal hantering och hormonell behandling av den europeiska ålen att beskrivas nedan. Utöver detta kommer också det bästa europeiska ål spermier frysförvaring protokoll använder metanol som en frysskyddmedel och ett protokoll för bedömning av spermiekvalitet hos denna art beskrivas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden för att arbeta med ål som beskrivs i detta protokoll godkändes av kommittén för etik av djur experimenterandet på Universitat Politècnica de València, efter spanska lagar och förordningar som styr experiment och förfaranden på levande djur.
1. fisk underhåll
- Föra de europeiska ålen till en forskningsanläggning och sätta dem i en 200 L akvarier med ett recirkulerande system. Använd termostater och kylare för att upprätthålla en konstant 20 ° C temperatur.
- Håll fisken i mörka förhållanden att undvika stress22 och med ingen mat under experimentet.
- Håll fisken i sötvatten under de första 3 dagarna. Sedan ändra 1/3 av vattnet och fyll på med havsvatten varannan dag tills de når en salthalt på 37,0 ± 0,3 g/L.
2. hormonell behandling
Obs: Hormonella behandlingen består av veckovisa injektioner av humant koriongonadotropin (hCG) hela experimentet hela löptid (nio veckor).
- Förbereda hCG hormonet i förväg med en koncentration på 1 IU/µL genom spädning av hormonet i saltlösning (0,9% NaCl).
Obs: Hormonet kan bevaras utspätt till denna koncentration för över en vecka vid-18 ° C. - För att söva fisken, förbereda en 40 L flexibla hink med 5 L system vatten.
- I en 250 mL mätkolv, späd 300 mg bensokain i 100 mL 70% etanol.
- Häll den utspädda bensokain i hinken (slutlig koncentration 0,36 mM) och blanda ordentligt. Detta är för en sista bensokain koncentration av 60 mg/L.
- Överför fisken, individuellt, i vattnet med bensokain och vänta några sekunder tills bensokain tar effekt och fisken ordentligt är sövd.
Obs: För att bekräfta att fisken är sövd, placera fisken i ryggläge och kontrollera att det stannar kvar i den positionen.
- Att administrera hormonet, väga fisken och förbereda hCG hormonet vid en dos på 1,5 IE per g fisk, i en 1,5 mL plaströr.
- Fyll en 1 mL spruta med hCG hormonet från plast röret.
- Placera sövda fisken i ryggläge och med hjälp eller sprutan, injicera hormonet noggrant i området intraperitoneal.
- Tillbaka fisken på aquaria och övervaka det tills återhämtat sig helt.
Obs: Hormonella administrationen måste genomföras varje vecka under experimentet. Europeisk ål börjar normalt, spermating efter 6-7 veckors hormonell behandling.
3. spermier provtagning
- För att få bästa kvalitet prov, extrahera spermier 24 h efter den hormonella administration6,23.
- Söva fisken med bensokain som beskrivs i steg 2.2.
- Placera sövda fisken i ryggläge, rengöra underlivet med en skvätt destillerat vatten och torka noga med papper, att undvika avföring kontaminering närvarande i underlivet eller oavsiktlig spermier aktivering genom kontakt med havsvatten från aquaria.
- Att placera fingrarna på båda laterala sidorna av fisken, massera försiktigt trycka sidled från bröstfenorna till underlivet att tvinga spermier ut.
- Upprepa massagen tills inga fler spermier kommer ut från genitala öppningen.
- Samla in spermier i 15 mL plaströr med hjälp av en vakuumpump.
- Späd den extraherade spermier 1:10 i modifierad Tanaka´s extender lösning24 (137 mM NaCl, 76,2 mM NaHCO3, i destillerat vatten) vid 4 ° c.
Obs: Spermier i Extender-lösningen bör bibehållas vid 4 ° c.
4. spermier kvalitetsbedömning
- Förbereda konstgjorda havsvatten13 (i mM: NaCl 354,7, MgCl2 52,4, CaCl2 9,9, Na2SO4 28,2, KCl 9,4, i destillerat vatten) med 2% bovint serumalbumin (BSA) (w:v), justera pH till 8,2, osmolalitet till 1100 mOsm/kg och underhålla det vid 4 ° c att undvika bakterietillväxt.
- Öppna programvaran för datorstödd spermier analys (CASA) och välj modulen fisk spermier.
- Klicka på Egenskaper att öppna systemet installationen av programvaran. Där, ange alternativen fånga vid 60 bilder per sekund. Välj negativa fas optik, Makler kammare och 10 X skala.
- Sedan på analys värdena, väljer du fisk som arter och partiklar område större än 2 µm2 och mindre än 20 µm2.
- På parametrarna som hastighet, inställd på långsam när celler flytta mellan 10 och 45 µm/s, inställd på medium när du flyttar mellan 45 och 100 µm/s och inställd på snabb när du flyttar snabbare än 100 µm/s.
Obs: Spermier med hastighet långsammare än 10 µm/s ansågs orörliga. - Välj de progressiva värderingar som 80% av rakhet (STR) och spara egenskaperna.
- Klicka på Fånga fältet (ett fönster med live-bilder från kameran kommer att öppnas).
Obs: Datorstödd spermier analys systemet bildas genom ett mikroskop, en kamera och en bild analys programvara.
- Räknande kammaren, sätta 4 µL av konstgjorda havsvatten och Lägg till 0,5 µL spermier lösning (spermier utspätt i Extender-lösning).
- Fokusera bilden med lupp med 10 X förstoring i den negativa fasen. 15 s efter aktivering, klicka på Capture - från video i datorstödd spermier analys programvara.
- Analysera varje prov i tre exemplar och välj prover med en högre än 70% för frysförvaring motilitet.
Obs: Det är mycket viktigt att välja endast högkvalitativa spermier för att lyckas med detta frysförvaring protokoll.
5. spermier frysning metod
- Förbered i förväg flytande kväve (ca 2,5 L) i en 34 x 34 cm x 30 cm och 5 cm tjock frigolitlåda.
Obs: Upprätthålla en nivå av flytande kväve för 4-5 cm höjd hela tiden.- Bygga en flytande struktur att pre frysa spermier. Använda 2 bitar av polystyren (20 x 5 cm), binda dem med 2 plaströr och placera strukturen på det flytande kvävgasen. Denna struktur måste flyta över det flytande kvävgasen på en ungefärlig höjd 3 cm över ytan (figur 1).
Figur 1 . Schematisk ritning av flytande struktur används för före frysning över flytande kväve. Strukturen består av två bitar av låg densitet frigolit 20 cm x 4 cm x 5 cm ansluten med plaströr på 14 cm. Sugrören är placerade över plaströren på 3 cm över det flytande kvävgasen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förbered frysförvaring lösningen genom att blanda spermier, Extender-lösning och metanol på förhållandet 1:8:1 i 1,5 mL plast rör och rör om försiktigt.
- Med hjälp av en pipett, tillsätt 480 µL av frysförvaring lösningen i 500 µL stråna och om nödvändigt, markera dem genom att stänga ena änden med modellera.
- Lägga halm på flytande enheten på en höjd av 3 cm över det flytande kvävgasen för 3 min. Placera sedan, halm i det flytande kvävgasen.
- Efter 10-15 min, överföra stråna i en tank för lagring av flytande kväve som använder lång pincett och hålla dem nedsänkt i flytande kväve vid alla tidpunkter. Här kan spermierna lagras på obestämd tid.
6. upptining metod
- Förbereda en frigolitlåda med flytande kväve som beskrivs i steg 5.1 och Förbered ett vattenbad med en 3 L bägare med kranvatten vid 40 ºC.
- Överföra sugrören med fryst sperma från lagertanken i en frigolitlåda med flytande kväve med lång pincett.
- Sätta varje strå i ett vattenbad vid 40 ºC för 13 s.
- Häll spermier i ett 1,5 mL plaströr genom att skära de slutna ändarna av halm med sax.
- Analysera spermierörlighet använda datorstödd spermier analyssystem som förklaras i steg 4.1.
- Hålla 100 µL av spermier att analysera lönsamheten för spermier med en flödescytometer.
7. flödescytometri
- Använd en fluorescerande kit innehåller propidium jodid (PI), som är en röd fluorescerande förening som fläckar atomkärnor av döda celler och en membran-diffusionskoefficient nukleära fluorescerande förening, att gröna fläckar atomkärnor av levande celler.
- Laga grönt fluorescerande färglösningen genom att späda ut det från stamlösning (1 mM) 1:10 i Tanaka´s medium till en fungerande lösning 100 µm.
- Späd inte PI lösningen. Stamlösningen är på 2,4 mM.
- För varje prov, ta 50 µL av färska eller tinade spermier och tillsätt 0,5 µL av grön fluorescerande färgning arbetslösning (slutlig koncentration 1 µM) och 2 µL PI lösning (slutlig koncentration 100 µM).
- Inkubera i prover som innehåller färgämnena (PI och grön fluorescerande färgning) i mörkret för 5 min.
- Späd ut proverna i 500 µL Tanaka´s extender lösning och analysera med en flödescytometer.
- Slå på flödescytometer och skapa ett nytt protokoll som innehåller minst 2 tomter: SS logga vs FS logga och FL1 vs FL3.
Obs: Båda, grön fluorescerande färgning och propidium jodid kan vara upphetsad med synliga våglängd ljuset. När bunden till DNA, maximal fluorescens utsläpp av dessa färgämnen är 516 nm och 617 nm, respektive.- Justera spänningarna av olika lasrar: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372
- Ställa in förvärv inställningar accord till maximal händelser = 5000 eller 15 s (den slutliga koncentrationen i provet bör vara cirka 1 miljoner celler/ml). Läs provet med ett lågt flöde.
- Välj läsläge enda tube fast positionsfunktionen.
- Placera provet i rätt antal karusellen
- Läs provet (trycka på F9) och spara data till en excel-fil (trycka på F7) för ytterligare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spermier från 18 ål med en spermierörlighet 70% eller högre, valdes ut för denna studie. Resultaten visade en minskning i alla parametrar efter upptining jämfört med de från färsk sperma (tabell 1 och figur 2). Motilitet resultaten (menar ± S.E.M., n = 18) visade en högre totala motilitet och en progressiv motilitet i färsk sperma än den totala motilitet och progressiv motilitet hittade i efter blidvädret spermier prover.
Samma mönster kunde hittas i analysen av snabba spermier celler, där frysta-tinade prover presenterade en lägre procentsats på snabb celler än färska prover. Dessutom sänktes också spermie hastigheterna mätt efter upptining proverna.
Resultaten visade också, att cellernas viabilitet efter upptining fram en minskning av levande spermier på 23 ± 3,1% (menar ± S.E.M., n = 18) från färsk till frysta-tinade prover (tabell 1 och figur 2).
Figur 2 . Motilitet, krökt hastighet och livskraft celldata av färsk sperma och tinade spermier (efter frysförvaring). Spermier var fryst tillstånd 24 h innan att vara tinade. De värden som presenteras är medel ± S.E.M. av spermier från 18 prover. Asteriskerna visar signifikanta skillnader mellan tinade och fräsch prover (t-test, p < 0,05). Den parametern motiliteten anges andelen totala motila spermier, krökt hastighet anges den genomsnittliga hastigheten på spermier längs en krökt bana och cellernas viabilitet anges andelen levande spermier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Snabb + medium celler1 (%) | 70,7 ± 2,8 | 27.5 ± 2.1* |
| Krökt velocity (VCL; µm/s) | 118,8 ± 2,8 | 101,5 ± 1.8* |
| Rak linje hastighet (VSL; µm/s) | 53,3 ± 1,9 | 45,6 ± 1.3* |
| Genomsnittliga sökvägen velocity (VAP; µm/s) | 73,3 ± 2,1 | 62,0 ± 1.3* |
| Slå kors frekvens (Hz) | 27,9 ± 0,3 | 27,1 ± 0,6 |
| Cellernas viabilitet (% av levande celler) | 97,7 ± 0,3 | 73,8 ± 2,8 |
| 1 Celler visar krökt hastighet över 40 µm/s. | ||
Tabell 1. Sammanfattning av resultaten av de olika parametrar som analyseras med datorstödd spermier analyssystem från färska och tinade prover. Tinade prover var tidigare fryst tillstånd 24 h. Alla värden som presenteras som menar ± S.E.M. (n = 18). Asteriskerna visar signifikanta skillnader mellan tinade och fräsch prover (t-test, p < 0,05). De analyserade parametrar: motila spermier definieras som andelen av totala motila celler; Progressivt rörliga definieras som procentandel av spermier som simmar framåt i en i huvudsak rak linje; snabb och medelstora celler definieras som andelen spermier med en genomsnittlig krökt hastighet över 40 µm/s; krökt hastighet definieras som genomsnittlig hastighet av en spermie genom dess krökt bana; rak linje hastighet definieras som genomsnittlig hastighet av en spermie mätt från den första upptäckta positionen till sin förra position i en rak linje; genomsnittliga sökvägen hastighet definieras som genomsnittlig hastighet av en spermie längs dess rumsliga genomsnittliga bana; Slå kors frekvens definieras som den genomsnittliga växelkurs som krökt spermier huvudet banan korsar dess genomsnittliga sökvägen bana; cellernas viabilitet definieras som andelen levande spermier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver hela processen för europeisk ål mognad, hantering och spermier frysförvaring. Om djurhållning villkoren här är optimal för snabb mognad och produktion av stora volymer av hög kvalitet sperma i denna art 6,7,25. Framgången för frysförvaring protokollet och dess potentiella användning för befruktning efter upptining är kraftigt beroende av kvaliteten på färsk sperma 26. Urvalet av högkvalitativa spermier är därför av stor betydelse. Observera att subjektiva spermier kvalitetsbedömning beror på färdigheter, perception och utbildning av forskaren som utvärderar de prover 5,27,28 och kan leda till mycket olika kvalitet anseende beroende på de forskare 29. Därför, användningen av datorstödd spermier analys rekommenderas att välja de bästa kvalité proverna för frysförvaring.
Resultaten av den efter upptining spermiekvalitet som presenteras här visade en minskning i parametrarna för motilitet, hastighet och cellöverlevnad. Detta är förenligt med tillgängliga bibliografin, trots att det finns stora skillnader mellan arter 26,30. Till exempel, i en studie med lax (Salmo salar), var färsk sperma med en motilitet 70-95% frusen använder olika cryoprotectants (DMSO och metanol). Spermiernas rörlighet efter upptining var betydligt lägre än i färska prover, med motilitet värden i det bästa protokollet på 8,2%, ändå befruktning med hjälp av tinade spermier var så hög som 42,8%, vilket motsvarade 95% av kontroll (färsk sperma) 31. I en annan studie med sperma från hälleflundra (Hippoglossus hippoglossus), hittades inga betydande minskning av spermiernas rörlighet efter frysförvaring och befruktning med hjälp av tinade spermier var över 95% 32.
I europeisk ål, tidigare studierna visade också en minskning i spermiernas rörlighet efter frysförvaring oberoende av frysskyddmedel använt 16,18. Dessutom har frysförvarade spermier från europeisk ål av liknande kvalitet använts framgångsrikt för gödsling 8. I denna studie använde Asturiano et al. DMSO som frysskyddmedel. Användning av DMSO har vissa nackdelar i manipulation sedan denna frysskyddmedel aktiverar spermierna och behöver därför omedelbart frysas vid tillägg av DMSO. Insemination med tinade spermier måste också utföras omedelbart efter upptining. Minskningen av spermier pH kan delvis lösa detta problem 19, men protokollet är mer känslig än protokollet presenteras här med metanol som frysskyddmedel.
Flera studier har visat positiva resultat med metanol som frysskyddmedel. Till exempel, i en studie med japanska ålen (Anguilla japonica) använder ett mycket liknande protokoll till den som presenteras här, med 10% metanol som frysskyddmedel, befruktade författarna framgångsrikt ägg använder färska och nedfrysta spermier. I denna studie erhöll de befruktning priser på 17% med inga signifikanta skillnader mellan färsk och nedfrysta spermier 33.
Det protokoll som presenteras här har visat att bevara tillräcklig spermiekvalitet efter upptining och Visa liknande spermier egenskaper efter upptining än protokoll använder olika förlängare och cryoprotectants, men med fördelarna med enkel hantering före och efter frysförvaring. Det är mycket viktigt att följa exakt kyla och upptining gånger beskrivs här samt med hjälp av högkvalitativa spermier. I framtida studier, kommer befruktning prövningar att testas med hjälp av detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Denna publikation har finansierats av EU: s Horizon 2020 forskning och innovation-programmet under Marie Sklodowska-Curie bidragsavtalet ingen 642893 (IMPRESS), det COST-kontoret (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) och Research Centre of Excellence- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
