Summary

Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Published: March 08, 2018
doi:

Summary

Questo articolo viene illustrato un protocollo dettagliato per isolamento di DNA e la costruzione della libreria sequenziamento ad alte prestazioni da materiale di erbario tra cui salvataggio di eccezionalmente scarsa qualità del DNA.

Abstract

Gli erbari sono una preziosa fonte di materiale vegetale che può essere utilizzato in una varietà di studi biologici. L’uso di campioni di erbario è associato con una serie di sfide tra cui qualità di conservazione del campione, DNA degradato e campionamento distruttivo di rari esemplari. Per poter utilizzare in modo più efficace materiale di erbario in progetti di sequenziamento di grandi dimensioni, è necessario un metodo affidabile e scalabile di preparazione di isolamento e libreria di DNA. Questa carta dimostra un protocollo robusto, inizio-to-end per DNA alto-rendimento e isolamento costruzione della libreria da esemplari che non richiedono la modifica di singoli campioni. Questo protocollo è su misura per la bassa qualità secchi pianta materiale e approfitta dei metodi esistenti ottimizzando tessuto rettifica, modifica selezione dimensione biblioteca ed introducendo un passo opzionale reamplification per librerie di basso rendimento. Reamplification di librerie di basso rendimento del DNA può salvare i campioni provenienti da campioni di erbario potenzialmente preziosi e insostituibili, negando la necessità per ulteriore campionamento distruttivo e senza introdurre bias di sequenziamento discernibile per comune applicazioni filogenetiche. Il protocollo è stato testato su centinaia di specie di erba, ma dovrebbe essere adatto per l’impiego in altri lignaggi pianta dopo la verifica. Questo protocollo può essere limitato dal DNA estremamente degradato, dove non esistono frammenti nel campo dimensione desiderata, e di metaboliti secondari presenti in alcuni materiale vegetale che inibiscono pulito isolamento del DNA. Nel complesso, questo protocollo introduce un metodo veloce e completo che permette di isolamento del DNA e preparazione della biblioteca di 24 campioni in meno di 13 ore, con solo 8 h di tempo attivo hands-on con modifiche minime.

Introduction

Erbario collezioni sono una fonte potenzialmente importante di entrambe le specie e diversità genomica per studi compreso phylogenetics1,2,3, genetica delle popolazioni4,5, conservazione biologia6, specie invasive biologia7e tratto evolution8. La capacità di ottenere una ricca diversità di specie, popolazioni, luoghi geografici e punti di tempo mette in evidenza il “forziere”9 che è l’erbario. Storicamente, la natura degradata del DNA erbario-derivato ha ostacolato progetti basati su PCR, relegando spesso i ricercatori a usando solo gli indicatori trovati in alta copia, quali le regioni del genoma del cloroplasto o il distanziatore interno trascritto (ITS) della ribosomiale RNA. Qualità dei campioni e DNA variano ampiamente basata su metodi di conservazione9,10, con rotture a doppio filamento e la frammentazione da calore utilizzato nel processo di essiccazione, essendo le forme più comuni di danno, creando il cosiddetto 90% DNA di lock-up che ha gravato studi basati su PCR11. A parte la frammentazione, il problema secondo più prevalente in erbario genomica è contaminazione, come quello derivato da funghi endofiti13 o funghi acquisito post mortem dopo la raccolta, ma prima di montare nell’erbario12, però Questo problema può essere risolto bioinformatically dato il database proprio fungo (Vedi sotto). Un terzo problema, meno comune, è modifica di sequenza attraverso citosina deaminazione (C/G→T/A)14, anche se si stima essere bassa (~ 0,03%) in campioni di erbario11. Con l’avvento di sequenziatori di alto-rendimento (HTS), il problema di frammentazione può essere superato con brevi letture e sequenziamento profondità12,15, permettendo l’acquisizione di dati a livello genomico dalle numerosi esemplari con bassa qualità DNA e a volte anche permettendo di sequenziamento del genoma intero15.

I campioni di erbario stanno diventando sempre più frequentemente utilizzati e una maggiore componente di filogenetica progetti16. Una sfida attuale della utilizzando campioni di erbario per HTS è costantemente ottenere sufficiente DNA a doppia elica, un prerequisito indispensabile per protocolli di sequenziamento, da numerose specie in modo tempestivo, senza la necessità di ottimizzare i metodi per individuo esemplari. In questa carta, un protocollo per l’estrazione di DNA e preparazione di libreria di campioni di erbario è dimostrato che si avvale dei metodi esistenti e li modifica per consentire risultati veloci e replicabili. Questo metodo consente completo elaborazione da esemplare a una libreria di 24 campioni in 13 h, con tempo di preparazione manuale h 8, o 16 h, con hands-on tempo h 9, quando è richiesto il passaggio opzionale reamplification. Elaborazione simultanea di più campioni è realizzabile, anche se il fattore limitante è la capacità della centrifuga e abilità tecnica. Il protocollo è progettato per richiedere solo attrezzature tipici del laboratorio (termociclatore, centrifuga e supporti magnetici) invece di attrezzature specializzate, come un nebulizzatore o un sonicatore, per la tosatura del DNA.

Qualità del DNA, la dimensione del frammento e la quantità sono fattori per l’utilizzo di campioni di erbario a esperimenti di sequenziamento ad alta velocità limitanti. Altri metodi per isolare il DNA di erbario e creazione di librerie di sequenziamento ad alte prestazioni hanno dimostrato l’utilità dell’utilizzo di appena 10 ng di DNA16; Tuttavia hanno bisogno di determinare sperimentalmente il numero ottimale di PCR cicli necessari per la preparazione di biblioteca. Questo diventa impraticabile quando trattare con estremamente piccole quantità di vitali double stranded DNA (dsDNA), come alcuni esemplari di erbario producono solo abbastanza DNA per una preparazione unica libreria. Il metodo presentato qui utilizza un singolo numero di cicli indipendentemente dalla qualità del campione, quindi nessun DNA si perde nelle fasi di ottimizzazione biblioteca. Invece, un passo di reamplification viene richiamato quando le librerie non soddisfano gli importi minimi necessari per la sequenza. Molti campioni di erbario sono rari e possiedono poco materiale che lo rende difficile da giustificare campionamento distruttivo in molti casi. Per contrastare ciò, il protocollo presentato permette di dsDNA ingresso taglie meno di 1,25 ng nel processo di preparazione di biblioteca, ampliando l’ambito dei campioni praticabili per high throughput sequenziamento e riducendo al minimo la necessità di campionamento distruttivo degli esemplari.

Il seguente protocollo è stato ottimizzato per erbe e testato su centinaia di specie diverse dai campioni di erbario, anche se ci aspettiamo che il protocollo può essere applicato a molti altri gruppi di piante. Esso comprende un passaggio di ripristino opzionale che può essere utilizzato per salvare bassa qualità e/o rari esemplari. Questo protocollo basato su oltre duecento esemplari di erbario testati, funziona sugli esemplari con tessuto basso input e qualità, consentendo la conservazione di esemplari rari tramite campionamento distruttivo minimo. Qui è indicato che questo protocollo può fornire librerie di alta qualità che possono essere ordinati in sequenza per progetti basati su phylogenomics.

Protocol

1. prima di iniziare Fare fresco cetilico trimetilammonio bromuro (CTAB) buffer17 aggiungendo 20 g di CTAB, 10 g di polivinilpirrolidone (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 40 mL di 0,5 M etilendiamminotetraacetico (EDTA) l’acido pH 8.0, 280,0 mL 5 M di NaCl e 400,0 mL di reagente acqua insieme e portare il volume totale a 1 L con reagente-grado dell’acqua. Regolare il pH a 8.0.Nota: Altri reagenti possono essere aggiunto al CTAB a seconda di composti secondari in singoli taxa. Veder…

Representative Results

Isolamento del DNA e la resa finale bibliotecaIn questo studio, l’efficacia del protocollo per l’isolamento del DNA di erbario e al recupero delle librerie di sequenziamento di alta qualità è stata dimostrata utilizzando cinquanta diversi campioni con la più antica dal 1920 e il più giovane dal 2012 (tabella 2). Per ogni campione, circa 10 mg di tessuto fogliare è stato usato per isolamento del DNA. Più verde tessuto fogliare è stato favorito s…

Discussion

Il protocollo presentato qui è un metodo completo e robusto per isolamento del DNA e sequenziamento preparazione libreria dagli esemplari di piante essiccate. La consistenza del metodo e minima necessità di modificarla basata su esemplare qualità rendono esso scalabile per progetti di grande erbario di sequenziamento. L’inclusione di un passo opzionale reamplification per librerie di basso rendimento permette l’inclusione di bassa qualità, quantità di basso, rara o storicamente importanti campioni che altrimenti non…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Taylor AuBuchon-Elder, Jordan Teisher e Kristina Zudock per assistenza negli esemplari di erbario di campionamento e il giardino botanico del Missouri per l’accesso agli esemplari di erbario per campionamento distruttivo. Questo lavoro è stato supporto da una sovvenzione della National Science Foundation (DEB-1457748).

Materials

Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4452300 96 well 
Gel Imaging System Azure Biosystems c300
Microfuge 20 Series Beckman Coulter B30137
Digital Dry Bath Benchmark Scientific BSH1001
Electrophoresis System EasyCast B2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water) ELGA  89204-092
DNA LoBind Tube  Eppendorf 30108078 2 ml
Mini centrifuge Fisher Scientific 12-006-901
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific 12-812
Mortar Fisher Scientific S02591 porcelain
Pestle fisher Scientific S02595 porcelain
Centrifuge tubes fisher Scientific 21-403-161
Microwave Kenmore 405.7309231
Qubit Assay Tubes Invitrogen Q32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCR VWR 20170-004
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866
Balance Mettler Toledo PM2000
Liquid Nitrogen Short-term Storage Nalgene F9401
Magnetic-Ring Stand  ThermoFisher Scientific  AM10050 96 well 
Water Bath VWR 89032-210
Hot Plate Stirrers VWR 97042-754
Liquid Nitrogen Airgas UN1977
1 X TE Buffer Ambion AM9849 pH 8.0
CTAB AMRESCO 0833-500G
2-MERCAPTOETHANOL AMRESCO 0482-200ML
Ribonuclease A AMRESCO E866-5ML 10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63882
Sodium Chloride bio WORLD 705744
Isopropyl Alcohol bio WORLD 40970004-1
Nuclease Free water bio WORLD 42300012-2
Isoamyl Alcohol Fisher Scientific A393-500
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific s608-500
LE Agarose GeneMate E-3120-500
100bp PLUS DNA Ladder Gold Biotechnology D003-500
EDTA, Disodium Salt IBI Scientific IB70182
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32854
TRIS MP Biomedicals 103133 ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X) New England BioLabs B7024S
NEBNext dsDNA Fragmentase New England BioLabs M0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina  New England BioLabs E7645L
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina New England BioLabs E7600S Dual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix New England BioLabs M0543L
Mag-Bind RXNPure Plus Omega bio-tek M1386-02
GelRed 10000 X Pheonix Research 41003-1
Phenol solution SIGMA Life Science P4557-400ml
PVP40 SIGMA-Aldrich PVP40-50G
Chloroform VWR EM8.22265.2500
Ethanol Koptec V1016 200 Proof
Silica sand VWR 14808-60-7
Reamplification primers Integrated DNA Technologies see text
Sequencher v.5.0.1 GeneCodes

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Cite This Article
Saeidi, S., McKain, M. R., Kellogg, E. A. Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens. J. Vis. Exp. (133), e56837, doi:10.3791/56837 (2018).

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