Надежные ДНК изоляции и высокопроизводительного секвенирования строительство библиотеки для образцов гербария
Summary
Эта статья демонстрирует подробный протокол для изоляции ДНК и высокопроизводительного секвенирования библиотека строительство из материалов гербариев, включая спасение исключительно низкого качества ДНК.
Abstract
Гербариев являются незаменимым источником растительного материала, который может использоваться в различных биологических исследований. Использование образцов гербария связано с рядом проблем, включая пример сохранения качества, деградации ДНК и разрушительной выборки редких образцов. Для того, чтобы более эффективно использовать гербарий материал в большой последовательности проектов, необходим надежный и масштабируемый метод подготовки ДНК изоляции и библиотека. Этот документ демонстрирует надежный, начало в конец протокол для ДНК изоляции и высок объём библиотека строительства от образцов гербария, не требуют изменений для отдельных образцов. Этот протокол является специально для низкого качества сушеных растений материала и принимает преимущество существующих методов путем оптимизации измельчения тканей, изменения выбора размера библиотеки и представляя шаг необязательный reamplification для низкой урожайностью библиотек. Reamplification библиотек ДНК низкой урожайностью может спасти образцов, полученных от образцов незаменимым и потенциально ценный гербарий, отрицая необходимость дополнительных деструктивных выборки и без внесения заметных последовательности смещения для общего Филогенетические приложений. Протокол был протестирован на сотни видов травы, но ожидается быть адаптированы для использования в других линий завода после проверки. Этот протокол может быть ограничено путем крайне деградировавших ДНК, где фрагментов нет нужного размера в диапазоне размеров, и вторичных метаболитов в некоторых растительных материалов, которые препятствуют чистый изоляции ДНК. В целом этот протокол вводит быстрый и всеобъемлющий метод, который позволяет для изоляции ДНК и библиотека подготовка 24 проб в меньше чем 13 h, с только 8 h активного практического времени с минимальными изменениями.
Introduction
Гербарий коллекции являются потенциально ценным источником как видов, так и геномного разнообразия для исследований, включая филогенетики1,2,3, популяционной генетики4,5, сохранению Биология6, инвазивные виды биологии7и черта эволюции8. Возможность получения богатого разнообразия видов, популяций, географических точках, и моменты времени подчеркивает «сундук»9 это гербария. Исторически деградированных характер гербарий, полученных ДНК препятствовало ПЦР-проектов на базе, часто relegating исследователей с использованием только маркеры в высокой копии, например регионов геномом хлоропластов или внутренней трансляции распорку (СТС) о рибосомных РНК. Качества образцов и ДНК широко зависят методы сохранения9,10, с двуцепочечные разрывы и фрагментации от жары, используемых в процессе сушки, будучи наиболее распространенных форм ущерба, создание так называемые 90% ДНК карцер, заполнена на основе ПЦР исследования11. Помимо фрагментации второй наиболее распространенной проблемой в гербарий геномики является загрязнение, такие как, производный от эндофитные грибов13 или грибов приобрел посмертных после сбора, но до монтажа в гербарий12, хотя Эта проблема может быть выполнено bioinformatically, учитывая право грибковых базы данных (см. ниже). Третий и менее распространенные, проблема изменения последовательности через цитозина дезаминирование (C/G→T/A)14, хотя он считается низкой (~ 0.03%) в гербарий образцов11. С появлением высокопроизводительного секвенирования (HTS) вопрос о фрагментации может быть преодолена с короткой читает и последовательности глубины12,15, позволяя геномных данных приобретение от многочисленных образцов с низким качеством ДНК и иногда даже разрешительные весь геном последовательности15.
Гербарий образцы становится все более часто используются и более крупный компонент филогенетических проектов16. Текущий вызов с использованием образцов гербария для HTS неизменно является получение достаточных двойной мель ДНК, является необходимым условием для последовательность протоколов, от многочисленных видов своевременно, без необходимости оптимизации методов для отдельных образцы. В этом документе протокол для экстракции ДНК и библиотека подготовки образцов гербария показано что использует преимущества существующих методов и изменяет их для быстрого и воспроизводимые результаты. Этот метод позволяет для полной обработки от образца к библиотеке 24 пробы в 13 h, с 8 h практическое время, или 16 h, с 9 ч практический время, когда требуется дополнительный reamplification шаг. Одновременная обработка более образцов является достижимым, хотя ограничивающим фактором является мощности центрифуг и технических навыков. Протокол призван требовать только в типичных лабораторное оборудование (Термоциклер, центрифуги и магнитные стенды) вместо специализированного оборудования, такие как распылитель или sonicator, для сдвига ДНК.
Размер фрагментов ДНК качество и количество сдерживающими факторами для использования образцов гербария в высокопроизводительного секвенирования экспериментов. Другие методы для изоляции гербарий ДНК и создания высокопроизводительного секвенирования библиотек продемонстрировали полезность использования как мало, как 10 нг16ДНК; Однако они требуют экспериментально определить оптимальное количество PCR циклов, необходимых для подготовки библиотеки. Это становится нецелесообразным, когда решения с весьма небольшим количеством жизнеспособных двойной мель ДНК (dsDNA), как некоторые образцы гербарий производят только достаточное количество ДНК для приготовления одной библиотеки. Метод, представленные здесь использует единый количество циклов независимо от качества образцов, поэтому не ДНК теряется в шагов оптимизации библиотеки. Вместо этого шаг reamplification вызывается, когда библиотеки не соответствуют минимальной суммы, необходимой для виртуализации. Многие образцы гербарий редки и имеют мало материала, что делает его трудно оправдать разрушительной выборки во многих случаях. Чтобы противостоять этому, представленный протокол позволяет dsDNA ввода размеров менее 1,25 нг в процесс подготовки Библиотека, расширение сферы применения жизнеспособных образцов для высокопроизводительного секвенирования и свести к минимуму потребность в разрушительной выборки образцов.
Следующий протокол оптимизирован для трав и протестированы на сотни различных видов из образцов гербария, хотя мы ожидаем, что протокол может применяться для многих других групп растений. Она включает в себя шаг необязательный восстановления, который может использоваться для сохранения низкого качества или редких образцов. Основываясь на более чем двух сотен гербарий образцов испытания, этот протокол работает на образцах с низкой ткани ввода и качества, позволяя для сохранения редких образцов через минимальным разрушительным выборки. Здесь показано, что этот протокол может обеспечить высокое качество библиотек, которые можно упорядочивать для проектов на базе phylogenomics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленные здесь является всеобъемлющий и надежный метод для изоляции ДНК и последовательности подготовки библиотеки из образцов сухих растений. Согласованность метода и минимальная потребность изменить его на основе образца качества делают его масштабируемость для б…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Тейлор Обечон-старший, Teisher Иордании и Кристина Zudock для помощи в выборки образцов гербария и ботанический сад Миссури для доступа к гербарий образцов для разрушительных выборки. Эта работа была поддержка грант от национального научного фонда (DEB-1457748).
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
- Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
- Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
- Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
- Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
- Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
- Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
- Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
- Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
- Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
- Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
- Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
- Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
- Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
- Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
- Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
- Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
- Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
- Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
- Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
- McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
- Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
- Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
- . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
- Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).
