Vi præsenterer her, en protokol, der kan bruges til mikroskopisk visualisere og kvantificering af aktiviteten af dehydrogenases i celler og væv og dens forsvindingskinetik, funktion og subcellulært lokalisering.
Ændrede cellulære metabolisme er kendetegnende for mange sygdomme, herunder kræft, hjerte-kar-sygdomme og infektion. De metaboliske motor enheder af celler er enzymer og deres aktivitet er stærkt reguleret på mange niveauer, herunder det transkriptionel, mRNA stabilitet, translationel, posttranslationelle og funktionelle plan. Dette kompleks forordning betyder, at konventionelle kvantitative eller tænkelig assays, såsom kvantitative mRNA eksperimenter, Western blotting og immunhistokemi, giver ufuldstændige oplysninger om den ultimative aktivitet af enzymer, deres funktion og/eller deres subcellulært lokalisering. Kvantitative enzym cytochemistry og histokemi (dvs. metaboliske kortlægning) Vis dybdegående information i situ enzymatisk aktivitet og dens kinetik, funktion og subcellulært lokalisering i en næsten ægte-til-naturen situation.
Vi beskriver en protokol for at registrere aktiviteten af dehydrogenases, som er enzymer der udfører redox reaktioner for at reducere cofaktorer som NAD(P)+ og FAD. Celler og væv sektioner er inkuberes i et medium, der er specifikke for ét dehydrogenase enzymatisk aktivitet. Efterfølgende, udfører den dehydrogenase, der er genstand for undersøgelsen RuBisCOs enzymaktivitet i sin subcellulært hjemmeside. I en kemisk reaktion med reaktion medium skaber dette i sidste ende blå-farvet formazankoncentrationen i stedet for den dehydrogenase aktivitet. Formazankoncentrationens absorbans er derfor en direkte måling af den dehydrogenase aktivitet og kan kvantificeres ved hjælp af monokromatisk lys mikroskopi og billede analyse. Det kvantitative aspekt af denne protokol gør det muligt for forskere at drage statistiske konklusioner af disse assays.
Udover observationsstudier, kan denne teknik bruges til hæmning undersøgelser af specifikke enzymer. I denne sammenhæng, undersøgelser fordel fra sand-til-naturen fordelene ved metaboliske kortlægning, kan giver resultater, og i situ der være fysiologisk mere relevant end in vitro- enzym hæmning undersøgelser. I alt er metaboliske mapping en uundværlig teknik til at studere metabolisme på celle- eller vævsdel niveau. Teknikken er let at vedtage, indeholder dybdegående, omfattende og integreret metaboliske oplysninger og giver mulighed for hurtig kvantitativ analyse.
En afgørende hjørnesten for cellulær fysiologi er stofskiftet. Stofskifte giver celler med den energi, der kræves for alle fysiologiske processer, leverer byggesten for makromolekylære biosyntese og regulerer cellulær homøostase affaldsprodukter, giftige molekyler og dekompileringen og genanvendelse af unødvendige eller dysfunktionelle cellulære komponenter. Enzymer katalyserer næsten alle afgørende cellulære kemiske reaktioner og derfor er de motoriske enheder i fysiologi af celler. 1 , 2
Aktiviteten af enzymer er stramt reguleret på mange niveauer og derfor kvantitative enzym histokemi og cytochemistry (også kaldet metaboliske kortlægning) er den foretrukne metode til at studere enzym aktivitet in situ. På niveauet transcriptional er genekspression i mRNA reguleret. Virkningen af regulering af transkription kan bestemmes ved hjælp af kvantitative mRNA assays, såsom microarrays eller direkte RNA sekvensering eller kvalitative mRNA assays, som in situ hybridisering, som giver oplysninger om (sub) trådløse lokalisering af mRNA molekyler. Dette gør det muligt at værdsætte relative forskelle i transcriptional aktivitet mellem celler. Fortolkning og gyldighed af disse mRNA assays til metaboliske aktivitet er imidlertid komplicerede, fordi forordning forekommer også på mRNA niveau, hvor sekvens og stabilitet af mRNA molekyler er redigeret efter det er transskriberet fra DNA. Denne redigering regulerer protein isoform oversættelse og protein oversættelse mængde på ribosomer. Derudover protein oversættelsesprocessen er kontrolleret og i sidste ende påvirker enzym udtryk og derfor aktivitet. De kombinerede virkninger af de ovennævnte lovgivningsmæssige skridt kan blive værdsat bruger kvantitativ protein udtryk assays, såsom Western Blotting eller omvendt fase protein lysate microarrays eller kvalitative protein udtryk assays, som immuncytokemi og immunhistokemi, men disse teknikker undgå at indarbejde downstream regulerende virkninger såsom posttranslationel modifikation af proteiner og funktionelle regulering af enzymer i deres overfyldte mikromiljø. Endvidere kan udtryk for et enzym dårligt korrelerer med sin aktivitet, således at aktiviteten målinger af en renset enzym i celle- eller vævsdel homogeniseret eller fortyndet løsninger er almindeligt brugt til enzym aktivitet undersøgelser. Men disse forsøg ikke at replikere en overfyldt opdelte cytoplasma eller organelle indflydelse på aktiviteten af et enzym. Desuden, alle førnævnte teknikker bestemme enten mængden eller lokalisering af mRNA eller enzym udtryk, men er ikke i stand til at give omfattende oplysninger på begge disse aspekter af enzymet udtryk for slet ikke at tale om integration af dette oplysninger med enzym aktivitet bestemmelser. 2 , 3 , 4
Metaboliske kortlægning giver påskønnelse af alle de førnævnte variabler, der bestemmer aktiviteten af et enzym. Hvad mere er, er metabolisk mapping en form for levende celler eller væv imaging med celler og væv, der er bevaret intakt under analysen til at generere en næsten ægte-til-naturen situation at frembringe data af aktiviteten af enzymer. Det producerer billeder, der fremmer både detaljeret forståelse af placeringen af enzymaktivitet samt robust kvantificering af enzymaktivitet i en celle- eller vævsdel rum. 3 , 4 de protokoller er beskrevet her for metaboliske kortlægning af aktiviteten af dehydrogenases er baseret på laboratorium manual af alle tilgængelige enzym histokemiske metoder,5 på principperne om kvantitative enzym histokemi,6 og på billedanalyse af kvantitative metaboliske kortlægning. 4
Dehydrogenases er enzymer, der udfører redox reaktioner for at reducere kanoniske cofaktorer NAD+, NADP+ og FAD til NADH og NADPH FADH2, henholdsvis. Intakt celler eller væv frysemikrotomsnit, der ikke er kemisk faste inkuberes i en reaktion medium, der indeholder, blandt andre reagenser, substrat og cofaktorer af en specifik dehydrogenase og en tetrazolium salt. Efterfølgende, at dehydrogenase udfører sin katalytiske aktivitet og reducerer f.eks NADP+ til NADPH. Via en elektron luftfartsselskab reducere 2 NADPH molekyler i sidste ende 1 vandopløselige semi-farveløs tetrazolium salt molekyle i 1 vanduopløselige blå formazankoncentrationen molekyle, der straks udfældes i stedet for dehydrogenase. Derfor absorbansen af udfældet formazankoncentrationen er en direkte måling af den lokale aktivitet af en dehydrogenase og kan observeres ved hjælp af lysmikroskopi eller kvantificeres ved hjælp af monokromatisk lys mikroskopi og billede analyse. Det kvantitative aspekt af denne protokol gør det muligt for forskere at drage statistiske konklusioner af disse assays. Derudover letter denne kvantificering bestemmelse af i situ kinetic enzym parametre, såsom maksimal enzymaktivitet (Vmax) og affinitet af et substrat for et enzym (Km). 3 , 4 , 5 , 6
Når du planlægger en metabolisk kortlægning eksperiment, er det vigtigt at indse, at et maksimum af 50 glas dias med vedhængende celle præparater eller væv sektioner pr. eksperiment, anbefales at minimere forsinkelser under inkubation for at opnå overensstemmelse resultater. Det er muligt at behandle flere dias og/eller mellemstore kompositioner, når disse protokollen trin udføres sammen af mere end én eksperimentator. Desuden findes nogle variation mellem eksperimenter. Derfor identiske eksperimenter bør gentages mindst 3 gange med cytospins fra hver celle forberedelse eller sektioner fra hver vævsprøve og passende kontrol bør medtages i hvert forsøg. Altid udarbejde en kontrol inkubation medium i mangel af substrat men i nærværelse af cofaktorer til kontrol for uspecifik enzym aktivitet farvning. De mest repræsentative resultater opnås i eksperimenter hvor forskellige substrat/cofaktor koncentrationerne anvendes til væv sektioner eller celle præparater fra den samme prøve, således at eksperimentatoren kan udføre analyser af enzymet kinetik ved hjælp af dosis-aktivitet kurver.
Forskning på cellulære metabolisme i øjeblikket oplever en renæssance, fordi forskere indser nu, at metaboliske effekter er afgørende for patogenese og behandling af mange sygdomme. 1 øvrigt, metabolisk forskning er hjulpet af en stigende tilgængelighed af teknikker, der giver dette område af forskningen med flere funktioner end nogensinde, herunder massespektrometri, radioisotopic mærkning og Kernemagnetisk resonans massespektrometri. Metaboliske kortlægning er på ingen måde en ny teknik, men dens kapacitet til at give integrerede oplysninger om aktiviteten af enzymer i en næsten ægte-til-naturen situation gør denne teknik mere relevant end nogensinde. 2
Cofaktorer NAD+ og NADP+ findes i alle levende celler, som angiver, at dehydrogenases opstod meget tidligt i udviklingen og have nøgleroller i cellulære stofskifte. 14 , 15 i øjeblikket, der er 523 enzym-katalyserede reaktioner, der er klassificeret som dehydrogenases og opstår på tværs af alle arter. 16 teoretisk, aktiviteten af alle forskellige dehydrogenase reaktioner kan særskilt undersøges ved tweaking metaboliske kortlægning protokollen beskrevet her. Hver enzymatisk reaktion er unikt ved hjælp af substrat og cofaktorer, der er nødvendige for dets aktivitet. Derfor, aktiviteten af hver enzymatisk reaktion kan bestemmes ved hjælp af en metabolisk kortlægning eksperiment med fyldestgørende substrat og cofaktorer på mellemlang og reaktion. Men nogle enzym isoformer afviger i deres subcellulært lokalisering, fx én isoform katalyserer en reaktion i cytoplasmaet, mens en anden isoform funktioner i mitokondrierne. Et bemærkelsesværdigt eksempel er IDH1 og IDH2, hvoraf førstnævnte er cytoplasmatisk og sidstnævnte er mitokondrie og der er to forskellige proteiner kodet af to forskellige gener. 11 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate (methoxy-PMS) og 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) kan både bruges som elektron luftfartsselskaber for disse eksperimenter. Den tidligere passere ikke mitokondrie membraner, sidstnævnte ikke. Undersøgelser af mitokondrie enzymer (f.eks. IDH2) skal derfor bruge PMS, mens undersøgelser på cytosole enzymer (f.eks. IDH1) skal bruge mPMS.
Som med mange teknikker, variationer af denne protokol, som ved hjælp af forskellige typer af tetrazolium salte, bortset fra tilføjelsen af PMS og natriumazid, ved hjælp af en vandig montering medium, og varierende inkubation og skylning gange, eksisterer og fungerer lige så godt. Anvendelsen af metaboliske kortlægning med tetrazolium salte er ikke begrænset til dehydrogenases. Med små ændringer til protokollen, kan det også bruges til vurdering af aktiviteten af enzymer, der fungere direkte opstrøms af en dehydrogenase i en stofskiftevej. Vi har tidligere beskrevet dette princip for glutaminase enzym,17 som fungerer direkte opstrøms af glutamat dehydrogenase i glutaminolysis vej. 18 i teorien, det samme princip kan anvendes på andre enzymer, der funktion direkte downstream eller opstrøms af en dehydrogenase fx aconitase, som ligger direkte opstrøms af IDH2 og IDH3 i den tricarboxylic syre (TCA) cyklus. En anden simpel variation af de koncentrationer, der er beskrevet i tabel 1 er ved at gøre inkubation medium hætteglas med forskellige koncentrationer af substrat, cofaktor og/eller hæmmer. Dette giver mulighed for generation af dosis-aktivitet kurver som funktion af substrat, cofaktor og/eller hæmning.
Teknisk taler, metabolisk kortlægning eksperimenter lette ikke upartiske observationer i situ enzym aktivitet, fordi forskerne har til at vælge et substrat og cofaktor koncentration, der ikke måske afspejler substrat og cofaktor niveauerne der er til stede i situ. Desuden brug af tyktflydende 18% PVA i reaktion medium tjener til at holde makromolekyler intakt, og i kropsbygning men forbyder effektiv udbredelse af lav molekylvægt reagenser gennem reaktion. 3 , 5 derfor bestemt enzym aktiviteter i eksperimenter beskrevet her, der bruger suprafysiologiske substrat koncentrationer ikke afspejler i vivo situation på en given substratkoncentrationen men egner sig til intra eksperimentelle sammenligninger. Resultatet af metaboliske kortlægning eksperimenter er således en enzymatisk reaktion inden for rammerne af de substrat og cofaktor niveauer, der er til stede i situproduktionskapacitet (maksimal aktivitet). Desuden, brug af forskellige koncentrationer af substrat og/eller cofaktorer og flere prøver giver uvildig sammenligning af maksimale produktionskapacitet (Vmax) og affinitet (Km) af et enzym til et substrat/cofaktor i celle præparater , væv eller væv regioner. Disse parametre er et resultat af summen af enzymet protein udtryk, posttranslationelle modifikationer og effekten af en overfyldt mikromiljø på aktiviteten af enzymer. Metaboliske kortlægning er derfor stadig en bedre afspejling af enzymaktivitet end eksperimenter, der bestemme protein udtryk eller renset enzym aktivitet i vitro.
The authors have nothing to disclose.
R.J.M. understøttes af en AMC ph.d.-stipendium. Denne forskning blev støttet af den hollandske Cancer Society (KWF grant UVA 2014-6839). Forfatterne takke Dr. A. Jonker for hans hjælp med at skrive i protokollen.
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |