Her presenterer vi en protokoll som kan brukes til mikroskopisk visualisere og kvantifisere aktiviteten til dehydrogenases i celler og vev og kinetics, funksjon og subcellular lokalisering.
Endret cellenes stoffskifte er et kjennetegn på mange sykdommer, inkludert kreft, hjerte-og karsykdommer og infeksjon. Metabolsk motor enhetene celler er enzymer og deres aktivitet er sterkt regulert på mange nivåer, inkludert det transcriptional, mRNA stabilitet, translasjonsforskning, post-translasjonell og funksjonelle. Denne komplekse forskriften betyr at konvensjonelle kvantitative eller tenkelig analyser, som kvantitative mRNA eksperimenter, Western blotter og immunohistochemistry, gir ufullstendig informasjon om ultimate aktiviteten av enzymer, deres funksjon og/eller deres subcellular lokalisering. Kvantitativ enzymet cytochemistry og histochemistry (dvs. metabolske tilordning) viser detaljert informasjon i situ enzymatisk aktivitet og kinetics, funksjon og subcellular lokalisering i en nesten sant-til-naturen.
Vi beskriver en protokoll for å oppdage aktiviteten til dehydrogenases, som er enzymer som utfører redoksreaksjoner å redusere kofaktorer som NAD(P)+ og Kjepphest. Celler og vev deler er ruges i et medium som er spesifikk for den enzymatiske aktiviteten en dehydrogenase. Deretter utfører dehydrogenase som er gjenstand for etterforskning den enzymatiske aktiviteten i subcellular området. I en kjemisk reaksjon med reaksjon medium, til slutt genereres blå-farget formazan på stedet av den dehydrogenase aktivitet. Den formazan absorbans er derfor et direkte mål på dehydrogenase aktivitet og kan kvantifiseres monokromatisk lys mikroskopi og bilde analyse. Kvantitativ aspekt av denne protokollen kan forskere til å trekke statistiske slutninger fra disse analyser.
Foruten observasjonsstudier, kan denne teknikken brukes for hemming studier av spesielle enzymer. I denne sammenheng, studier dra nytte av ekte-til-naturen fordelene av metabolske kartlegging, kan gir i situ resultater som være fysiologisk mer relevant enn i vitro enzym hemming studier. I alle er metabolske kartlegging en uunnværlig teknikk å studere stoffskiftet på mobiltelefonen eller vev. Teknikken er lett å adoptere, gir detaljert, omfattende og integrert metabolske informasjon og muliggjør rask kvantitativ analyse.
En vesentlig hjørnestein for mobilnettet fysiologi er metabolisme. Metabolisme gir cellene energien som trengs for alle fysiologiske prosesser, gir byggesteinene for macromolecular biosyntesen og regulerer mobilnettet homeostase med tanke avfallsprodukter, giftige molekyler og demonteringen og resirkulering av unødvendige eller dysfunksjonelle cellulære komponenter. Enzymer katalysere nesten alle viktige mobilnettet kjemiske reaksjoner og derfor er de motoriserte enhetene i fysiologi av celler. 1 , 2
Aktiviteten av enzymer er strengt regulert på mange nivåer og derfor kvantitative enzym histochemistry og cytochemistry (også kalt metabolske kartlegging) er den foretrukne metoden å studere enzym aktivitet i situ. På transcriptional nivå, er genuttrykk i mRNA regulert. Effekten av regulering av transkripsjon kan bestemmes ved hjelp av kvantitative mRNA analyser, for eksempel microarrays eller direkte RNA sekvensering kvalitativ mRNA analyser, for eksempel på plass hybridisering som gir informasjon om (sub) mobilnettet lokalisering av mRNA molekyler. Dette gjør det mulig å verdsette relative forskjeller i transcriptional aktivitet mellom celler. Men er tolkningen og gyldigheten av disse mRNA analyser med hensyn til metabolsk aktivitet komplisert fordi regulering oppstår også på mRNA nivå, der rekkefølgen og stabilitet av mRNA molekyler er endret etter at det er transkribert fra DNA. Dette redigerer regulerer protein isoformen oversettelse og protein oversettelsen antallet på ribosomene. I tillegg prosessen med protein oversettelsen er kontrollert og til slutt påvirker enzym uttrykk og derfor aktivitet. Den kombinerte effekten av nevnte regulatoriske trinnene kan nytes med kvantitative protein uttrykk analyser, for eksempel Western Blotting omvendt fase protein lysate microarrays eller kvalitativ protein uttrykk analyser, som immunocytochemistry og immunohistochemistry, men disse teknikkene ikke innlemme nedstrøms regulatoriske effekter som post-translasjonell modifikasjon av proteiner og funksjonelle regulering av enzymer i sine overfylt microenvironment. Videre kan uttrykk for et enzym dårlig korrelerer med sin aktivitet, slik at aktiviteten målinger av en renset enzym i cellen eller vev homogenates eller utvannet løsninger er mye brukt for enzym aktivitet studier. Imidlertid mislykkes disse eksperimentene å gjenskape påvirkning av en overfylt compartmentalized cytoplasma eller organelle på aktiviteten til et enzym. Videre alle nevnte teknikker bestemme antallet eller lokalisering av mRNA eller enzym, men ikke klarer å gi omfattende informasjon om begge disse aspektene av enzymet uttrykk, enn si integrering av dette informasjon med enzym aktivitet bestemmelser. 2 , 3 , 4
Metabolsk tilordning gjør styrkingen av alle nevnte variablene som bestemmer handlingen av et enzym. Hva mer, er metabolske kartlegging en form for levende celle eller vev bildebehandling med celler og vev som holdes vedlike under analyse for å generere en nesten sant-til-naturen situasjon for å generere data for aktiviteten av enzymer. Den produserer bilder som forenkler både detaljert styrkingen av plasseringen av enzym aktivitet i tillegg til robust kvantifisering av enzym aktivitet i en celle eller vev kupé. 3 , 4 protokollene beskrevet her for metabolske tilordning av aktivitet av dehydrogenases er basert på laboratoriet manualen for alle tilgjengelige enzymet histochemical metoder,5 på prinsippene kvantitative enzym histochemistry,6 og på bildeanalyse av kvantitative metabolske kartlegging. 4
Dehydrogenases er enzymer som utfører redoksreaksjoner å redusere kanoniske kofaktorer som NAD+, NADP+ og Kjepphest NADH, NADPH og FADH2, henholdsvis. Intakt celler eller kryostaten vev inndelinger som ikke kjemisk fast er ruges i et reaksjon medium som inneholder, blant andre, substrat og kofaktorer av en bestemt dehydrogenase og en tetrazolium salt. Deretter at dehydrogenase utfører sin katalytisk aktivitet og reduserer, for eksempel NADP+ å NADPH. Via et elektron carrier redusere 2 NADPH molekyler til slutt 1 vannløselige semi fargeløs tetrazolium salt molekyl i 1 vann-uløselig blå formazan molekyl som precipitates umiddelbart på stedet av dehydrogenase. Derfor absorbansen av utfelt formazan er et direkte mål på lokale aktiviteten til en dehydrogenase og kan observeres med * lys eller kvantifisert monokromatisk lys mikroskopi og bilde analyse. Kvantitativ aspekt av denne protokollen kan forskere til å trekke statistiske slutninger fra disse analyser. I tillegg forenkler denne kvantifisering fastsettelse av i situ kinetic enzym parametere, for eksempel maksimal enzym aktivitet (VMaks) og affinitet av et substrat for et enzym (K-m). 3 , 4 , 5 , 6
Når du planlegger en metabolsk kartlegging eksperimentet, er det viktig å innse at per forsøk, opptil femti glass lysbilder med overholde celle forberedelser eller vev inndelinger er anbefalt å minimere forsinkelser under inkubasjonen for å få konsekvent resultater. Det er mulig å behandle flere lysbilder og/eller middels komposisjoner når følgende protokollen utføres fellesskap av flere eksperimentator. Videre finnes noen variasjoner mellom eksperimenter. Derfor identiske eksperimenter bør gjentas 3 ganger med cytospins fra hver celle forberedelse eller inndelinger fra hver Vevsprøve og egnede kontroller skal inkluderes i hvert eksperiment. Alltid forberede en kontroll inkubasjon medium i fravær av underlaget, men i nærvær av kofaktorer kontroll uspesifisert enzym aktivitet flekker. De mest representative resultatene er oppnådd i eksperimenter der ulike substrat/kofaktor konsentrasjoner brukes til vev deler eller cellen forberedelser fra samme eksempel, slik at eksperimentator kan utføre analyser av enzymet kinetics bruker dose-aktivitet kurver.
Forskning på cellenes stoffskifte opplever for tiden en renessanse fordi forskere innser nå at metabolsk effekter er avgjørende for patogenesen og behandling av mange sykdommer. 1 videre metabolske forskning er hjulpet av en økt tilgjengelighet av teknikker som gir dette feltet av forskning med mer verktøy enn noensinne, inkludert massespektrometri, radioisotopic merking og kjernefysiske magnetisk resonans massespektrometri. Metabolsk kartlegging er på ingen måte en teknikken, men dens evne til å gi informasjon på aktiviteten av enzymer i en nesten sant-til-naturen gjør denne teknikken mer aktuell enn noensinne. 2
Kofaktorer NAD+ og NADP+ finnes i alle levende celler, som angir at dehydrogenases oppsto tidlig i utviklingen og har nøkkelroller i cellenes stoffskifte. 14 , 15 for tiden finnes 523 enzym-katalysert reaksjoner som er klassifisert som dehydrogenases og skje over alle arter. 16 teoretisk aktiviteten til alle forskjellige dehydrogenase reaksjoner kan separat undersøkes ved å tilpasse metabolske kartlegging protokollen beskrevet her. Hver enzymatiske reaksjonen er unik substrat og kofaktorer som kreves for sin virksomhet. Derfor kan aktiviteten til hver den enzymatiske reaksjonen bestemmes ved hjelp av en metabolsk kartlegging eksperiment med tilstrekkelig substrat og kofaktorer i reaksjon medium. Men noen enzym isoformene varierer i sine subcellular lokalisering, f.eks en isoformen gir en reaksjon i cytoplasma mens en annen isoformen funksjoner i mitokondrier. Et godt eksempel er IDH1 og IDH2, som tidligere er cytoplasmatiske og sistnevnte er mitokondrie og som er to ulike proteiner som er kodet av to ulike gener. 11 1-metoksy-5-methylphenazinium methylsulfate (metoksy-PMS) og 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) kan begge brukes som elektron bærer disse eksperimentene. Tidligere går ikke mitokondrie membraner, gjør sistnevnte. Derfor bør undersøkelser på mitokondrie enzymer (f.eks IDH2) bruke PMS mens undersøkelser på cytosolic enzymer (f.eks IDH1) bør bruke mPMS.
Som med mange teknikker, varianter av denne protokollen, som bruker ulike typer tetrazolium salter, unntatt tillegg av PMS og Natriumazid, ved hjelp av en vandig montering medium, og varierende inkubasjon og skylling ganger, eksisterer og fungerer like bra. Anvendelsen av metabolske kartlegging med tetrazolium salter er ikke begrenset til dehydrogenases. Med små modifikasjoner til protokollen, den kan også brukes for vurdering av aktiviteten av enzymer som fungerer direkte over en dehydrogenase i en metabolsk sti. Vi har tidligere beskrevet dette prinsippet for glutaminase enzymet,17 som fungerer direkte over glutamat dehydrogenase i glutaminolysis veien. 18 i teorien er det samme prinsippet kan brukes på andre enzymer som funksjonen direkte nedstrøms eller over en dehydrogenase f.eks aconitase, som ligger direkte oppstrøms av IDH2 og IDH3 i tricarboxylic syre (TCA) syklus. En annen enkel variant av konsentrasjonen beskrevet i tabell 1 er ved å gjøre inkubasjon middels ampuller med ulike konsentrasjoner substrat, kofaktor og/eller inhibitor. Dette tillater generering av dose-aktivitet kurver som en funksjon av underlaget, kofaktor og/eller hemming konsentrasjon.
Teknisk sett, metabolske kartlegging eksperimenter Letter ikke objektive observasjoner i situ enzym aktivitet, fordi forskere har å velge en substrat og kofaktor konsentrasjon som ikke gjenspeiler de substrat og kofaktor nivåene som er tilstede i situ. Videre bruk av tyktflytende 18% PVA i reaksjon medium tjener til å holde makromolekyler intakt, sted og conformation men forbyr effektiv spredningen av lav molekylvekt reagenser gjennom reaksjon. 3 , 5 derfor bestemt enzym aktiviteter i eksperimenter beskrevet her bruker supraphysiological substrat konsentrasjoner reflekterer ikke i vivo situasjonen på en gitt substrat konsentrasjon, men er egnet for intra eksperimentelle sammenligninger. Dermed er utfallet av metabolsk kartlegging eksperimenter produksjonskapasiteten (maksimal aktivitet) en enzymatiske reaksjonen i sammenheng substrat og kofaktor nivåene som er tilstede i situ. Videre gir bruk av ulike konsentrasjoner av underlaget og/eller kofaktorer og flere eksempler upartisk sammenligning av maksimal kapasitet (VMaks) og affinitet (Km) av et enzym for substrat/kofaktor i cellen forberedelser , vev eller vev regioner. Disse parameterne er resultatet av enzym protein uttrykk, post-translasjonell modifikasjoner og effekten av en overfylt microenvironment på aktiviteten av enzymer. Derfor er metabolske kartlegging fortsatt en bedre refleksjon av enzym aktivitet enn eksperimenter som bestemme protein uttrykk eller renset enzym aktivitet i vitro.
The authors have nothing to disclose.
R.J.M. støttes av en AMC PhD stipend. Denne forskningen ble støttet av den hollandske Kreftforeningen (KWF grant UVA 2014-6839). Forfatterne takker Dr. A. Jonker for hans hjelp med skrivingen av protokollen.
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |