Här presenterar vi ett protokoll som kan användas för att mikroskopiskt visualisera och kvantifiera aktivitet mellan östradiol och östron i celler och vävnader och dess kinetik, funktion och subcellulär lokalisering.
Förändrad cellulär metabolism är ett kännetecken för många sjukdomar, inklusive cancer, hjärt-kärlsjukdomar och infektioner. De metabola motoriska enheterna av celler är enzymer och deras verksamhet är starkt reglerad på många nivåer, inklusive den transkriptionell, mRNA-stabilitet, translationell, post-translationella och funktionell nivå. Denna komplexa förordning innebär att konventionella kvantitativa eller imaging analyser, såsom kvantitativa mRNA experiment, Western blotting och immunohistokemi, ger ofullständig information angående den ultimata aktiviteten av enzymer, deras funktion och/eller deras subcellulär lokalisering. Kvantitativa enzymet cytochemistry och histokemi (dvs metabola mappning) visar ingående information på i situ enzymatisk aktivitet och dess kinetik, funktion och subcellulär lokalisering i en nästan sann-till-naturen-situation.
Vi beskriver ett protokoll för att identifiera aktiviteten av mellan östradiol och östron, som är enzymer som utför redoxreaktioner för att minska kofaktorer som NAD(P)+ och FAD. Celler och vävnadssnitt inkuberas i ett medium som är specifik för den enzymatiska aktiviteten av ett dehydrogenas. Därefter utför på dehydrogenas som är föremål för utredning dess enzymatiska aktivitet i dess subcellulär webbplats. I en kemisk reaktion med reaktion medium genererar detta i slutändan blå-färgade formazan på platsen för den dehydrogenass verksamhet. Den formazan absorbansen är därför ett direkt mått på dehydrogenass verksamhet och kan kvantifieras med monokromatiskt ljus microscopy och bild analys. Den kvantitativa aspekten av detta protokoll gör det möjligt för forskare att dra några statistiska slutsatser från dessa analyser.
Förutom observationsstudier, kan denna teknik användas för hämning studier av särskilda enzymer. I detta sammanhang studier nytta sann-till-naturen fördelarna av metabola kartläggning, kan ger i situ resultat som vara fysiologiskt mer relevant än i vitro enzym hämning studier. I alla är metabola mapping en oumbärlig teknik att studera metabolismen på cell eller vävnad. Tekniken är lätt att anta, ger djupgående, omfattande och integrerade metabola information och möjliggör snabb kvantitativ analys.
En viktig hörnsten i cellulär fysiologi är ämnesomsättningen. Ämnesomsättning ger celler med den energi som behövs för alla fysiologiska processer, ger byggstenar för makromolekylära biosyntes och reglerar cellulär homeostas avseende avfallsprodukter, giftiga molekyler och demonteringen och återvinning av onödiga eller dysfunktionella cellulära komponenter. Enzymer katalysera nästan alla vitala cellulära kemiska reaktioner och därför är de motoriska enheterna i fysiologi av celler. 1 , 2
Aktiviteten av enzymer är hårt reglerad på många nivåer och kvantitativa enzym histokemi och cytochemistry (kallas även metabola mappning) är därför att föredra att studera enzym aktivitet i situ. På transkriptionell nivå regleras genuttryck i mRNA. Effekten av regleringen av transkription kan bestämmas med hjälp av kvantitativa mRNA analyser, såsom microarrays eller direkt RNA-sekvensering eller kvalitativa mRNA analyser, såsom in situ – hybridisering som ger information om (sub) cellulära lokalisering av mRNA-molekyler. Detta gör det möjligt att uppskatta relativa skillnader i transkriptionell aktivitet mellan celler. Tolkningen och giltigheten av dessa mRNA analyser med avseende på metabolisk aktivitet är emellertid komplicerat eftersom förordning uppstår även på mRNA-nivå, där ordning och stabilitet av mRNA-molekyler redigeras efter det transkriberas från DNA. Denna redigering reglerar protein isoform översättning och protein översättning kvantitet på ribosomerna. Dessutom protein översättning kontrolleras och i slutändan påverkar enzymet uttryck och därför aktivitet. De kombinerade effekterna av de tidigare nämnda rättsliga steg kan uppskattas med kvantitativa protein uttryck analyser, såsom Western Blotting eller omvänd fas protein lysate microarrays eller kvalitativt protein uttryck analyser, såsom immuncytokemi och immunohistokemi, men dessa metoder misslyckas med att införliva nedströms reglerande effekter såsom posttranslationella modifieringen av proteiner och funktionell reglering av enzymer i deras trånga mikromiljö. Dessutom kan ett uttryck för ett enzym dåligt korrelerar med sin verksamhet, så att Aktivitetsmätningar av en renade enzymet i cell eller vävnad homogenates eller utspädda lösningar används allmänt för enzym aktivitet studier. Dessa experiment fungerar emellertid inte att replikera påverkan av en fullsatt konkurrensbetingat cytoplasman eller organell på aktiviteten hos ett enzym. Dessutom alla ovannämnda tekniker bestämma antingen mängden eller localizationen av mRNA eller enzym uttryck, men inte kan ge omfattande information om båda dessa aspekter av enzymet uttryck, för att inte tala om integrationen av detta information med enzym aktivitet bestämningar. 2 , 3 , 4
Metaboliska mappning kan apprecieringen av alla ovannämnda variabler som bestämmer aktiviteten hos ett enzym. Vad är mer, är metabola mappning en form av levande cell eller vävnad bildbehandling med celler och vävnader som hålls intakt under analysen att generera en nästan sann-till-naturen situation för att generera data av aktiviteten av enzymer. Det ger bilder som underlättar både detaljerad uppskattning av placeringen av enzymaktivitet samt robust kvantifiering av enzymaktivitet inom en cell eller vävnad kupé. 3 , 4 de protokoll som beskrivs här för metabola kartläggning av aktivitet av mellan östradiol och östron baseras på laboratoriet handboken av alla tillgängliga enzym histochemical metoder,5 på principerna om kvantitativa enzym histokemi,6 och på bildanalys av kvantitativa metabola kartläggning. 4
Mellan östradiol och östron är enzymer som utför redoxreaktioner för att minska kanoniska kofaktorer som NAD+, NADP+ och modefluga NADH, NADPH och Fransson2, respektive. Intakta celler eller kryostaten vävnadssnitt som inte är kemiskt fasta inkuberas i en reaktion medium som innehåller, bland andra reagenser, substrat och kofaktorer av en specifik dehydrogenas och en tetrazolium salt. Därefter det Dehydrogenasen utför dess katalytiska aktivitet och minskar, till exempel NADP+ till NADPH. Via en elektron bärare minska 2 NADPH molekyler i slutändan 1 vattenlösliga semi färglös tetrazolium salt molekyl till 1 olöslig blå formazan molekyl som omedelbart fällningar på platsen för Dehydrogenasen. Därför absorbansen av utfällda formazan är ett direkt mått på den lokala aktiviteten ett dehydrogenas och kan observeras med hjälp av ljusmikroskop eller kvantifieras med hjälp av monokromatiskt ljus mikroskopi och bild analys. Den kvantitativa aspekten av detta protokoll gör det möjligt för forskare att dra några statistiska slutsatser från dessa analyser. Dessutom underlättar denna kvantifiering fastställandet av i situ kinetiska enzym parametrar, såsom maximal enzymaktivitet (Vmax) och affinitet av ett substrat för ett enzym (Km). 3 , 4 , 5 , 6
När du planerar en metabolisk mappning experiment, är det viktigt att inse att per experiment, högst femtio glasskivor med vidhängande cell preparat eller vävnadssnitt rekommenderas att minimera förseningar under inkubation för att få konsekvent resultat. Det är möjligt att bearbeta mer bilder eller medellång kompositioner när dessa protokoll steg utförs kooperativt av mer än en försöksledaren. Dessutom finns vissa variationer mellan experiment. Därför identiska experiment bör upprepas minst 3 gånger med cytospins från varje cell förberedelse eller avsnitt från varje vävnadsprov och lämpliga kontroller bör ingå i varje experiment. Alltid förbereda kontroll inkubation medium i avsaknad av substrat men i närvaro av kofaktorer kontroll för icke-specifika enzym aktivitet färgning. De mest representativa resultat erhålls i experiment där olika substrat/kofaktor koncentrationer tillämpas på vävnadssnitt eller cell preparat från samma prov, så att försöksledaren kan utföra analyser av enzymet kinetik med hjälp dos-aktivitet kurvor.
Forskning på cellulär metabolism upplever nu en renässans eftersom forskare inser nu att metabola effekter är av avgörande betydelse för patogenes och behandling av många sjukdomar. 1 dessutom metabolisk forskning är understödda av en ökande tillgången till tekniker som tillhandahåller forskningsområdet med fler verktyg än någonsin, inklusive masspektrometri, Radioisotopiska märkning och kärnmagnetisk resonans spectrometry. Metaboliska mappning är ingalunda ny teknik, men dess kapacitet att ge integrerad information om aktiviteten av enzymer i en nästan sann-till-naturen-situation gör denna teknik mer relevant än någonsin. 2
Kofaktorer NAD+ och NADP+ finns i alla levande celler, vilket indikerar att mellan östradiol och östron uppstod mycket tidigt under utvecklingen och har viktiga roller i cellulär metabolism. 14 , 15 för närvarande finns 523 enzymkatalyserade reaktioner som klassificeras som mellan östradiol och östron och förekomma på alla arter. 16 teoretiskt, aktiviteten av alla olika dehydrogenas reaktioner kan separat undersökas genom tweaking det metabola kartläggning-protokollet som beskrivs här. Varje enzymatisk reaktion är unik genom underlaget och kofaktorer som behövs för verksamheten. Därför kan aktiviteten av varje enzymatisk reaktion bestämmas med hjälp av en metabolisk mappning experiment med lämpliga substrat och kofaktorer reaktion medium. Dock vissa enzym isoformer skiljer sig åt i deras subcellulär lokalisering, e.g. en isoform katalyserar en reaktion i cytoplasman medan en annan isoform fungerar i mitokondrierna. Ett anmärkningsvärt exempel är IDH1 och IDH2, varav den förstnämnda är cytoplasmiska och den senare är mitokondrie och som är två olika proteiner som kodas av två olika gener. 11 1-metoxi-5-methylphenazinium methylsulfate (metoxi-PMS) och 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) kan både användas som elektron bärare för dessa experiment. Den förstnämnda passerar inte mitokondriell membran, den sistnämnda har. Utredningar på mitokondriella enzymer (t.ex. IDH2) bör därför använda PMS medan utredningar på cytosoliska enzymerna (e.g. IDH1) bör använda mPMS.
Som med många tekniker, variationer av detta protokoll, som att använda olika typer av tetrazolium salter, exklusive tillägg av PMS och natriumazid, använda en vattenlösning monteringsmedium, och varierande inkubation och sköljning gånger, existerar och kan fungera lika bra. Tillämpningen av metabola mappning med tetrazolium salter är inte begränsat till mellan östradiol och östron. Med små ändringar av protokollet, kan det också användas för bedömning av aktiviteten av enzymer som fungerar direkt uppströms ett dehydrogenas i en metaboliska väg. Vi har tidigare beskrivit denna princip för enzymet glutaminase,17 som fungerar direkt uppströms glutamat dehydrogenas i glutaminolysis väg. 18 i teorin samma princip kan tillämpas på andra enzymer som funktion direkt nedströms eller uppströms ett dehydrogenas t.ex. aconitase, som ligger direkt uppströms IDH2 och IDH3 i den tricarboxylic syran (TCA) cykel. En annan enkel variant av de koncentrationer som beskrivs i tabell 1 är genom att göra inkubation medium injektionsflaskor med olika koncentrationer av substrat, kofaktor eller hämmare. Detta tillåter generationen av dos-aktivitet kurvor som en funktion av substrat, kofaktor eller hämning.
Tekniskt sett, metabola mappning experiment underlättar inte opartiska yttranden i situ enzymaktivitet, eftersom forskare har att välja ett substrat och kofaktor koncentration som inte kanske återspeglar de substrat och kofaktor nivåerna som är närvarande i situ. Dessutom användningen av trögflytande 18% PVA reaktion medium tjänar till att hålla makromolekyler intakt, på plats och i konformation men förbjuder effektiv spridning av låg molekylvikt reagenser genom reaktion. 3 , 5 därför de beslutsamma Enzymaktiviteter i de experiment som beskrivs här som använder suprafysiologiska substrat koncentrationer inte återspeglar i vivo situationen vid en viss substrat koncentrationen men lämpar sig för inom experimentell jämförelser. Resultatet av metabola mappning experiment är alltså en enzymatisk reaktion i samband substrat och kofaktor nivåer som är närvarande i situproduktionskapacitet (maximal aktivitet). Dessutom tillåter användning av olika koncentrationer av substrat eller kofaktorer och flera prover opartisk jämförelse av maximal produktionskapacitet (Vmax) och affinitet (Km) av ett enzym för en substrat/kofaktor i cell preparat , vävnader eller vävnad regioner. Dessa parametrar är resultatet av summan av enzymet proteinuttryck, post-translationella modifieringar och effekten av en fullsatt närmiljön på aktiviteten av enzymer. Metaboliska mappning är därför fortfarande en bättre återspegling av enzymaktivitet än experiment som bestämma proteinuttryck eller renade enzymet aktivitet in vitro.
The authors have nothing to disclose.
R.J.M. stöds av en AMC PhD stipendium. Denna forskning stöddes av den holländska Cancer Society (KWF grant UVA 2014-6839). Författarna vill tacka Dr A. Jonker för hans hjälp med skrivandet av protokollet.
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
D-Glucose 6-phosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | G7879 | |
Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4) | Merck Millipore | 106559 | |
di-Sodium succinate | Sigma-Aldrich | W327700 | |
DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | I1252 | |
D-Malic acid | Sigma-Aldrich | 2300 | |
Glycerol Gelatin | Sigma-Aldrich | GG1 | |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
Lithium 6-phospho-D-galactonate | Sigma-Aldrich | 55962 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
methoxy-Phenazine methosulfate | Serva | 28966.01 | |
Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N0505 | |
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
Phenazine methosulfate | Serva | 32030.01 | |
Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | P1763 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Merck Millipore | 104873 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | L7022 | |
Bandpass filter | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
Grey-step wedge | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |