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Medicine

组织和采血程序标准化改善闭合性胸猪心肌梗死模型的研究

doi: 10.3791/56856 Published: March 12, 2018

Summary

在这里, 我们演示了一个标准化的方法, 以规范建立猪急性心肌梗塞模型的抽样程序, 以提高其平移值, 了解心肌缺血/再灌注损伤的病理生理学并测试新的药物候选者。

Abstract

心肌缺血再灌注 (一/R) 损伤对心肌梗死后坏死区的近半数有贡献。到目前为止还没有批准的药物来预防或减少心肌的 I/R 损伤。研究和理解心肌损伤的病理生理机制是发展成功治疗的必要条件。大型动物实验是翻译方法的重要步骤。猪急性心肌梗死模型由我们自己和其他人自行建立和描述。我们的目标是进一步提高模型的价值, 重点放在取样技术, 用于未来的实验。此外, 我们强调小但重要的步骤, 可能影响最终结果的质量。为模拟心肌 I./R 损伤的临床情况, 经皮冠状动脉介入治疗 (PCI) 导管插入麻醉猪左前降冠状动脉 (童子)。°°°This 模型模仿急性心肌梗死和 PCI 治疗的人, 有可能准确地确定的区域在危险, 以及坏死和可行的缺血性组织。该模型用于研究 FXIIa 笼肽抑制剂的作用。该模型也可以修改, 以允许更长的再灌注时间, 以研究晚期心肌梗死的影响。

Introduction

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缺血性心脏病, 特别是急性心肌梗死 (MI), 是发达国家死亡的主要原因1。今天, 标准治疗 MI 是经皮冠状动脉介入 (PCI), 气囊导管治疗。影响 PCI 治疗急性心肌梗死患者生活质量和预后的关键因素之一是梗塞面积。大小的减少可能对患者生存和预后有很大的影响2。心肌缺血/再灌注 (I.) 损伤对梗死大小有显著影响, 因此心血管研究的主要目的之一是预防或减少心肌 I./r 损伤3。我/R 损伤的确切机制仍在调查中4。激活血浆叶栅和内皮细胞是 I/R 损伤的标志5。凝血系统的激活明显涉及67。最近, FXII 的作用, 作为一个早期的上游肽参与凝血叶的接触相活化, 已显示在 FXII 敲出大鼠脑 I/R 损伤模型8。在猪模型中验证这些结果是临床翻译的重要一步。因此, 我们正在试验一种新的笼 (80 kDa 蛋白酶) FXIIa 抑制剂的背景下心肌 I/R 损伤的试验研究。

动物模型, 模仿急性 MI 和 PCI 治疗的临床情况, 是必要的, 以提高我们对心肌 I./R 损伤的病理生理学的认识, 并测试新的治疗方案。猪是临床心肌 I. 型损伤的良好动物模型。这不仅是因为他们的心脏是非常相似的人的心脏解剖和冠状动脉循环, 但他们也显示类似的病理生理反应心肌缺血和再灌注9,10。其他模型, 如老鼠和老鼠不满足这些标准, 并显示相当大的差异时, 与人的心脏11,12, 而狗例如, 有更多的抵押品冠状动脉血管相比, 人类13

猪急性心肌梗死模型已广泛应用于心血管研究, 包括心肌 I./R 损伤14,15,16,17。后者是一种炎症状态, 因为它减少了与胸骨或开胸手术有关的炎症反应是必不可少的。采用临床 C 臂血管造影设置的闭合胸模型克服了这一问题。此外, 最重要的一点是, 我们的议定书提供了一个准确的区分缺血性 (危险区域, AAR) 和左心室的非缺血性区域 (没有危险的地区), 以便梗塞大小 (坏死缺血性组织, 吹毛求疵) 可以被准确地确定。本论文的目的是明确界定猪心肌 I./r 损伤模型的可再生方法, 特别是在心肌组织取样方面, 这将有助于更精确地分析 I. r 损伤的分子机制和更清楚地了解新药物治疗的效果。

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Protocol

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1. 动物:

所有动物根据瑞士国家法律的指南对待。研究由伯尔尼的地方动物实验委员会批准 (允许 no。为 25/16)。

使用两个性别的大白猪 (~ 30 ~ 5 公斤)。将动物盲目分为两组, 一组接受笼 (80 kDa 蛋白酶) 抑制剂的 FXIIa 或治疗的选择, 另一种是不活跃的控制。

2. 外科手术 (图 1)

  1. 麻醉和动物的准备:
    1. 在开始实验前, 动物的速度要快12小时。
    2. 使用10毫升注射器在颈部注射20毫克/千克氯胺酮和2毫克/千克甲苯噻嗪。记录动物的体重和性别。
    3. 通过注射0.5 毫克/千克咪达唑仑和0.05 毫克/千克阿托品入耳静脉, 诱发麻醉。用气管插管动物。
    4. 使用呼吸机 (O2/空气 1:3, Sevorane 1.5%), 7-8 毫米气道管和过滤器维持麻醉的机械通气。调整被启发的氧气的分数 (不负担装卸2) 到35% 和潮汐容量到6-10 毫升/公斤。
    5. 麻醉深度被评估为足够的没有任何马达或自主反应的鼻子捏。眼睑反射和下巴的语调不断监测, 以及针对松弛颚色调和没有眼睑反射。核心温度连续监测和维护常温 (38-38.5 °c) 是确保与被动升温 (隔离毛毯和温暖瓶)。
    6. 解剖自由, 如前 Koudstaal 和他的同事所描述的步骤3-1 至 3-318, 颈动脉两侧和 cannulate 他们与7F 鞘。Cannulate 左颈静脉与7F 鞘静脉采血。
    7. 管理一丸剂量250µg 芬太尼镇痛通过中心静脉线后250µg/小时作为持续静脉输液使用输液泵。在整个实验过程中, 用3导联心电图 (ECG)、动脉和中心静脉压力监测体温、心率和节律。
    8. 使用标准采血管, 从静脉线提取以下基线血液样本: 5 毫升柠檬酸血浆和2.9 毫升 EDTA 血浆入各自的管子。离心机立即在 2000 x g 15 分钟4摄氏度。将2.9 毫升血液注入血清管, 并允许在室温下凝固30分钟, 离心前所述。
    9. 整除200µL 血浆或血清为500µL 管, 并将所有样品保存在-80 摄氏度以供进一步分析。
    10. 根据制造商的指示, 使用特殊的血气分析 (bga) 注射器从动脉线上提取0.5 毫升血液, 使用 bga 机测量 bga。
    11. 使用标准的2毫升注射器从静脉线提取0.5 毫升血液, 并立即用30克针将其转移到 ACT 墨盒中。将填充的墨盒插入 ACT 机器, 根据制造商的说明测量凝固时间。有关时间点, 请参见图 2
    12. 用2毫升注射器将5000普通肝素注入静脉内, 让动物在开始 MI 实验前稳定20分钟。
    13. 监督行动每30-45 分钟, 如2.1.11 所述。注射2500普通肝素静脉注射, 如果行为是 < 180s。
  2. 心肌梗塞实验
    1. 使用标准的 C 臂透视设备 (冠状动脉造影程序, 角度, 12 帧每秒, ~ 70 伏)-或一个专门的血管造影系统-进行冠状动脉介入治疗。
    2. 使用透视引导插入压力导管 (5F, 120 厘米) 通过先前放置鞘在左颈动脉。把它推进左心室。将压力导管连接到采集系统以记录左心室压力。在整个实验过程中, 采集系统需要连续计算和记录心率、压力、dp/dt 最大值 (左心室收缩率) 和 dp/dt 最小 (左心室松弛)。记录基线值为10分钟。
    3. 插入一个 6F (100 厘米, EB3.75) 引导导管通过先前放置鞘进入右颈动脉。在 X 线引导下, 将其推进左冠状动脉, 达到左前降冠状动脉 (童子)。用20毫升注射器通过引导导管注射造影剂, 进行基线冠状动脉造影。
      注: 通过人工压力进行对比介质的注入, 但也可以使用专用的动力喷油器系统。
    4. 评估 X 线显示器上的小伙子大小, 选择合适的经皮冠状动脉介入治疗 (PCI) 导管大小。使用 PCI 气球的长度为15-25 毫米和直径在2和3.5 毫米之间取决于小伙子的大小。组装 PCI 导管和冠状动脉导丝 (F 014/J, 175 厘米)。用造影剂预填充的充气装置将 PCI 导管连接起来。
      注意: 可以使用标尺直接在校准的显示器上测量童子直径, 然后相应地选择 PCI 气球的大小。
    5. 将组装的系统从2.2.4 插入引导导管的腔内。推进导丝入小伙子, 直到它到达在小伙子的第二对角分支之外。
    6. 使用透视的指导, 以推进 PCI 导管, 直到它到达大约在中间的小伙子。根据冠状动脉的解剖学选择 "小伙子阻断站点", 通常在第二次之后, 有时在第一个对角线分支 (图 3) 之后, 以使左心室的 AAR (LV) 有相似的百分比。
      注: 阻断部位的选择取决于对角线分支的长度, 因而是由血液通过各自分支提供的组织面积。在一个长, 分岔的第一对角线分支的情况下, 封锁网站将在这之后。如果第一对角分支较短, 则在第二个对角线之后进行阻塞。
    7. 取出导丝, 然后将充气装置中的压力增加到7-10 巴, 以充气 PCI 导管的气球, 并诱导心肌缺血1小时, 将不负担装卸2逐渐增加到50-60% 之间的15和40分钟的缺血。保持潮汐体积在6-10 毫升/千克。
      注意: 本程序可减少 extrasystoles 的发生, 降低心室颤动的频率。
    8. 记录 5-10 s 视频序列, 同时通过引导导管注射造影剂, 在启动缺血后, 对 PCI 导管的气球进行血管造影;重复10分钟的缺血后, 验证 PCI 导管的气球远端完全闭塞。
    9. 密切监视动物, 立即检测和治疗 (2.2.10) 心律失常。心肌缺血诱导后, Extrasystoles 通常发生并增加20至40分钟之间的频率 (> 3/分钟)。如果发生这种情况, 轻轻地按摩两侧的颈部就在脸颊下面。在大多数情况下, 这将足以重新建立一个正常的心跳, 可能是通过刺激的迷走神经 baroreceptors 位于颈总动脉。
    10. 如果心律失常进展为心室颤动, 使用外部, 双相除颤器重新建立窦节律。在应用休克前立即应用5-10 胸按压, 以便用含氧血填充冠状动脉, 然后用 150 J (30 公斤动物) 休克。
    11. 如有必要, 重复 3rd冲击后将能量增加到 175 J。对较重的动物使用更高的能量设置。
    12. 五分钟在缺血时间结束之前重复血液取样在 2.1. 8-2. 1.13 中提及。注射测试物质 (无论是笼 FXIIa 抑制剂或控制4毫克/千克, 这样做盲目) 静脉注射通过中心静脉线和冲洗线与20毫升生理盐水。
    13. 提取一个血浆柠檬酸盐样品 (如2.1.8 和2.1.9 中提到) 4 分钟后, 注射的物质在2.2.12。
    14. 执行血管造影 (2.2.3), 以确认小伙子闭塞, 然后解除 PCI 导管的气球, 并从引导导管取出这个导管。在通缩后立即进行血管造影, 并在 PCI 导管的球囊取出后, 确认患者远端至闭塞部位的灌注, 10 分钟后, 每当心肌缺血的迹象显示为5分钟以上, 并立即重新闭塞的小伙子。
    15. 允许缺血心肌再灌注2小时。以血浆和血清样品为 10, 30, 60 和115分钟的再灌注 (2.1.8 和 2.1.9)。监控 BGA 在60和115分钟 (2.1.10)。
    16. 将 PCI 导管与导丝重新插入与用于缺血的位置完全相同。将 PCI 导管的气球充气, 并通过血管造影 (2.2.3) 确认其闭塞。从左心室取出压力导管, 停止录音。
    17. 注入100毫升2% 埃文斯蓝色磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.4) 进入中心静脉线。大约三十年代以后, 当整个动物变成蓝色, 注射40毫升20% 氯化钾弄死动物。死亡由心电图信号和脉搏波缺乏证实。

3. 取样技术

  1. 心脏的提取、解剖和取样 (图 4)
    1. 执行胸骨来暴露心脏。按照 Koudstaal 和同事以前描述的协议, 步骤8-2 和 8-318。切开心包, 同时检查异常, 这可能源于早期心包炎, 并排除动物进一步评估。
    2. 卸除 PCI 和导向导管。消费心脏进一步分析。切开腔静脉, 用吸入泵取出血液, 然后切断所有连接心脏与身体的大血管。
    3. 用室温生理盐水冲洗心脏内外。权衡整颗心。
    4. 在30-40 分钟内, 将心脏切成3-5 毫米左右的切片, 从顶端到腱腱的二尖瓣, 用锋利的刀子垂直于长轴。
    5. 注意始终将心脏放在与腹侧朝向相同的方向上, 以保持剪切样本的方向 (图 5)。
    6. 使用数码单镜头反射相机拍摄心脏切片。
    7. 切断右心室 (不需要丢弃)。照片左心室切片, 并权衡所有切片的总重量的左心室。
    8. 区分埃文斯蓝阳性和埃文斯蓝阴性组织的所有部分。解剖切片, 以分离的缺血性 (埃文斯蓝阴性) 从非缺血性组织 (埃文斯蓝阳性) 使用手术刀。
    9. 首先分析埃文斯蓝阴性部分 (缺血性区域风险, AAR)。把它们都称重, 放入塑料容器中。
    10. 覆盖切片完全与100-150 毫升 (根据心脏大小) 苯基四氮唑氯溶液 (2 克 TTC, 16 克葡聚糖, 分子量 48000-90000, 在200毫升 PBS, 新鲜准备), 使心脏块可以自由移动内的解决方案。盖上容器和孵化20分钟, 在37摄氏度, 而轻轻摇晃。
    11. 在这20分钟的潜伏期体重的埃文斯蓝阳性片 (区域不处于危险中,), 采取组织-植骨标本 (从伤害选择最远端部分) 和存储在-80 °c 进一步分析。将其余部分转移到4% 甲醛溶液中, 在室温下贮存组织学切片。
    12. 从 TTC 解决方案中移除 AAR 部件。红染色组织是可行的缺血性组织 (维生素), 非染色组织为坏死性缺血性组织 (吹毛求疵)。2小块 (2-3 毫米块) 从维生素, 嵌入到组织和存储在-80 °c, 以进一步分析。这些样品应该有相同的重量。
    13. 修复其余的部分 (从 AAR 派生的所有切片), 将其固定在一个泡沫塑料容器中, 并完全覆盖4% 甲醛溶液在室温下在一个通风罩24小时。在接下来的步骤中, 这些片断应该保持平面以供照相文档参考。
    14. 第二天, 照片两侧的作品与一个高分辨率的相机具有相同的变焦设置和距离从组织 (相同的放大)。向所有图片添加自动缩放条。所有条形必须具有相同的长度。
      注意: 高分辨率的摄像机应该连接到自动添加缩放条到每张照片的软件。
  2. AAR 和梗死面积的计算
    1. 左心室的%AAR = (在 g 中的左心室重量中的 AAR 重量) * 100。
    2. 使用 ImageJ 软件计算的总表面积的 AAR 和吹毛求疵 (两侧的每件) 基于照片。
    3. 通过使用 "角度" 工具中的直线选择刻度线长度来调整缩放条。从菜单中选择 "分析" > "设置比例", 然后插入刻度线的已知距离和单位。选择 "全局", 以便将相同的比例应用于所有图片。
    4. 用自由手选择工具标记组织的整个表面积, 计算 AAR。小心不要包括组织和/或脂肪组织的侧面 (高度) (图 6-C)。
    5. 通过从 "分析" > "设置测量" 菜单中选择 "区域" 和 "显示标签" 来设置测量。测量表面积, 从分析 > 测量。
    6. 重复步骤3.2.5 测量 (只标记未染色的组织)。注: 不包括脂肪组织 (图 6 D) 在吹毛求疵的计算。在组织的另一侧重复步骤。
    7. 计算每块组织的平均 AAR 和吹毛求疵。
    8. 使用从3.2.7 获得的值, 以计算出 aar 的百分比: aar 的%NIT = (在 cm 的2/σ平均表面积在 cm2) * 100。
    9. 两个不同的调查员应该重复上述方法。可接受的差额差值为 < 10%。
  3. 缺血标记
    1. 使用以前被描述为19的单丛 Luminex 型检测方法, 以-80 摄氏度 (2.1.9) 为测量心肌肌钙蛋白水平的 EDTA 等离子样品。

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Representative Results

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一动物在 FXIIa 抑制剂或控制肽的管理之前过早地死了由于技术错误 (血压突然下落在缺血时间, 在测试物质的加法之前)。一只动物被排除在 FXIIa 抑制剂组, 因为没有观察到缺血/再灌注损伤由于左前降动脉的异常解剖 (小伙子)。左心室的很大一部分, 包括先端, 由该动物的扬抑动脉灌注。最后分析的动物是 n = 2 在笼 FXIIa 肽抑制剂小组 (平均重量 27.5 2.5 公斤) 和 n = 3 接受不活跃的笼控制肽 (平均重量 29 @ 0.8 公斤)。

x 线影像/冠状动脉造影的猪心脏用于可视化压力导管的位置, 并决定在哪里阻止小伙子 (图 3A)。图 3B显示导管位置, 阻塞了第二对角分支远端的血流。图 3A3B的比较也允许估计出哪些部分的童子提供的心肌缺血。在2小时的再灌注期结束时, PCI 导管被重新引入并在与缺血期间相同的位置充气。然后用静脉注射的埃文斯蓝来准确确定 AAR (图 5A)。心脏切除后, 左心室被切成3-5 毫米厚的部分, 从先端到二尖瓣, 垂直于长轴。AAR 和情报局在切片上被埃文斯蓝染色明确划定。AAR 和情报局取样区域显示在图 5B中。

以 LV 百分比表示的 AAR 显示, FXIIa 治疗组与对照组之间没有统计学意义的差异 (图 6A)。梗塞大小 (吹毛求疵/AAR) 显示组之间没有区别 (使用非参数曼-惠特尼测试, p > 0.05,图 6B)。这些数据表明, 单 FXIIa 抑制剂, 在使用的浓度和持续时间, 不能保护心脏从心肌 I/R 伤害图 6C和 6D显示如何标记 AAR 和吹毛求疵的边界, 以便准确和重现性测量各自的表面积。

血液取样策略允许释放心肌损伤标记心肌肌钙蛋白-i 的监测随着时间的推移。再灌注后一小时的缺血与基线几乎没有差别, 随着时间的推移持续增加, 如图 7所示。对于肌钙蛋白 i. 组间差异在这些实验中也没有显著意义。

Figure 1
图 1.实验时间线的概述.在心肌缺血/再灌注损伤模型中重要步骤的示意图。基线冠状动脉可视化、缺血起始时间、心律失常监测和注射试验物质是实验中的重要步骤。在所有实验中使用精确的时间可以确保重现性。Euthanizing 的动物和切除心脏应在15-20 分钟内完成后, 2h 再灌注阶段。氯化钾: 氯化钾。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.血液取样和分析的时间线.血液取样的时间点连同抗凝剂的类型一起被表明。可以根据实验和测定的化验结果抽取额外的样品。动作: 活化凝血时间, BGA: 血气分析, RT: 室温。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.冠状动脉造影.透视视图 (A) 左冠状动脉在基线上, 黄色箭头指向第一和第二对角分支, 白色箭头指向心脏顶点 (B) 闭塞的小伙子显示左心室的无流区 (LV), 红色箭头指向个人计算机I 导管 (C) 重新关闭的小伙子在结束后再灌注与 PCI 导管气球重新插入到同一地点的小伙子, 在缺血期间。CX: 带扬抑冠状动脉, 左前降冠状动脉, MC: 米勒导管, 插入左心室。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.组织取样示意图.确切的时间的心脏解剖和抽样的不同领域进行进一步分析。该时间线开始在205分钟后, 缺血, 20 分钟结束后的动物实验。euthanizing 后, 在40分钟内, 在 TTC 内孵化组织切片是很重要的。维生素和吹毛求疵的取样被表示为白色方块。在4% 甲醛孵化的 AAR 允许明确区分和维生素, 以准确地确定梗死大小。AAR: 危险区域: 无危险区, 左心室: 坏死性缺血性组织, OTC: 组织, RV: 右心室, TTC: 苯基四氮唑氯, 维生素: 可行的缺血性组织。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5.在风险区域 (AAR) 和不处于危险的区域之间的原位分化.(A) 在实验结束胸骨后, 整个心脏的代表图片。(B) 有代表性的图片显示解剖后3-5 毫米厚的左心室切片。AAR 和情报局是明确定义的, 由黄色箭头指示, 白色箭头显示的是在情报局取样区域。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6.缺血和梗塞大小。(A) 左心室的 AAR (LV) 的百分比权重。(B) AAR 的面积百分比。(C) AAR 计算的代表性图片。(D) 有代表性的计算的图片。白色箭头显示维生素取样区域, 黑色箭头显示了吹毛求疵的取样区域。使用 ImageJ 软件计算数据。值被显示为每个单独实验的点, 有平均±± SD 的指示. 对照组, n-= 3 和 FXIIa 抑制剂治疗组, n = 2。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7.心肌损伤标志物。在控制和 FXIIa 抑制剂治疗组的 pg/毫升中, 心肌肌钙蛋白-i 浓度随时间的推移。通过单丛悬浮阵列 (生物丛) 测量血流从颈静脉到 EDTA 等离子管的基线, 缺血的结束和再灌注和心肌肌钙蛋白-i 的几个时间点。数据显示为每个单独实验的点, 表明平均±± SD. 对照组, n = 3 和 FXIIa 治疗组, n = 2。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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心肌 I. 型损伤对急性心肌梗死后的最终梗死大小有显著影响, 直接转化为患者的预后3。了解心肌 I./R 损伤的病理生理学是减少或预防其发生的第一步。心肌 I./R 损伤是闭塞血管再灌注后直接发生的急性疾病。I/R 损伤导致活化的先天免疫应答和细胞损伤发生在现场的再灌注和周围组织20。最近的一项研究表明, FXIIa 抑制剂8治疗大鼠脑 I/R 损伤模型的神经结果有所改善。然而, 在目前的试验研究中, 我们发现笼 FXIIa 抑制剂对心肌 I./R 损伤无影响。使用的 FXIIa 抑制剂是新颖的, 其药代动力学在猪还不知道。因此, 观察到的缺乏效果可能是由不适当的剂量或应用引起的。这需要在后续研究中加以解决。

规范动物模型是深入研究心肌 I. 型损伤的病理生理学, 并为临床带来合适的解决方案的关键。研究心肌 I./R 损伤的病理生理学需要良好的和具有代表性的抽样, 以了解其基础的细胞机制。猪闭合性胸心肌 I./R 损伤模型提供了一种可重现的方法, 接近临床情况, 有助于理解细胞机制和测试新的新型疗法。前面介绍的模型的变体已被描述为上述目的14,17,18

我们在猪急性心肌梗死的协议不需要前处理与胺碘酮, 如前所述18,21。我们使用颈动脉窦按摩减少心律失常和双相除颤器的 cardioconversion 在心室颤动的情况下。使用颈动脉窦按摩是临床已知影响心房颤动22, 但迄今尚未显示, 以防止或延缓心室颤动的发病, 无论是在人类或猪模型。此外, 七氟醚的使用有助于降低猪急性心肌梗死模型中的室性心律失常和死亡率23

为确保重复性和降低血栓形成的风险, 在实验中注射了多剂量的肝素, 根据重复测量的行为, 而不是使用固定的肝素剂量, 如 Koudstaal et al18所述。控制量的肝素管理有助于调查凝血梯级的情况下, I/R 损伤。埃文斯蓝允许准确测定 AAR/LV。在透视引导下, 在脑缺血诱导下, 在完全部位重新闭塞的情况下, 注射埃文斯蓝会导致整个猪的蓝染色, 包括心脏的非缺血性部分, 对免疫球蛋白的影响最小。心肌和血管。埃文斯蓝色是已知的细胞毒性物质24。在目前的实验中, 保持血管内皮细胞层在心脏血管中的生存能力是至关重要的, 以便将其作为一个内部个体控制, 从而使100毫升的埃文斯蓝系统地注入并稀释整个血液, 减少其毒性.以前, 在类似的设置, 50 毫升2% 埃文斯蓝色直接注射到冠状动脉增加其细胞毒性对心脏细胞的风险25。下一步的重要步骤是将心脏直接解剖成3-5 毫米切片, 从顶点到二尖瓣 (每个动物的确切位置), 并用这种方法对 AAR 进行准确的计算, 作为左心室的一个百分比。

该方法的当前描述提供了以前未描述过的详细细节。在4% 甲醛中孵化的 TTC 染色段24小时提供了可行 (红色) 和坏死 (白色) 组织之间的明确区别, 这最终增加了取样的重现性进一步的分子染色。血液取样策略超过2小时的再灌注能够在很早 (10 和30分钟) 的再灌注阶段以及以后 (60 和120分钟) 内检测新表达的分子。正确的血液和组织取样和贮存对于分析血浆级联标记物, 如补体和凝固蛋白的表达也至关重要。

当前的协议可以修改为有一个更长的再灌注时间, 从几个小时到几天。这使得研究人员能够调查心脏损伤后的后果, 同时也能对新药的检测和疗效进行评估。目前协议的局限性是使用压力尖端导管来测量心脏功能。使用压力-容积回路测量系统可以获得更可靠的心脏功能数据。总之, 目前的方法提供了详细的重要步骤, 以提高猪闭合性胸心肌 I/R 损伤模型的重现, 当该模型的预期用途是研究细胞和分子变化的背景下,研究心肌 I./R 损伤病理生理学或研究新的治疗方案。

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Disclosures

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgments

作者希望感谢基督教 Heinis 教授提供 FXIIa 抑制剂和各自的控制。我们还感谢伯尔尼大学生物医学研究系 Olgica Beslac、丹尼尔梅特勒和凯 Nettelbeck 的技术支持。席琳 Guillod 和 Rausch 从诊断, 介入和儿科放射科, 伯尔尼大学医院, Inselspital 提供支持的 x 光设备和技术。该项目由瑞士国家科学基金会320030_156193 项目资助。我们还要感谢伯尔尼大学医院通讯和营销 Reto Haenni 先生, Inselspital 为我们的实验录像录音。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABL 90 Flex, blood gas analyser Radiometer - Blood gas analysis (BGA)
ACT Plus Medtronic - Activated clotting time
Atropin Sintetica - Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml
Balance (20-500 Kg) NAGATA Scale, Tiwan HTB/HTR Alternative products can be used
Balance (21-4200 g) Mettler toledo, Switzerland MS4002SDR Alternative products can be used
Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum S-Monovette, Nuembrecht, Germany 05.1167.001,
05.1071.001
and
05.1557.001 respectively
Alternative products can be used
BV Pulsera mobile C-arm Philips - Alternative products can be used
Centrifuge Labcare, UK ALC PK120R Alternative products can be used
Defibrillator Lifepak 12 Medtronic - Alternative products can be used
Dextran from Leuconostoc mesenteroides Sigma-Aldrich, Germany D3759 Average M.wt 48000-90000
Digital single lens reflex camera Sony, Thailand DSLR-A500/A550 Alternative products can be used
Dissecting forceps Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15300S Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
EMPIRA RX PCI dilatation catheter Cordis, Johnson&Johnson, USA 85R15350S Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used
Evans Blue Sigma-Aldrich, Germany E2129 Toxic
Fabius GS premium respirator Dräger, Lübeck, Germany - Anesthesia work station, Alternative products can be used
Fentanyl Inselspital ISPI - Fentanyl 2500mcg/50ml
Formaldehyde Pathology Institute, Bern University SI148701 Alternative products can be used
FXIIa inhibitor Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL Novel bicyclic peptide
Galeo, coronary guidewire Biotronik, Germany 125497 Alternative products can be used
Guidance catheter Boston Scientific, Florida, USA 34356-06 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used
Heparin Sodium Drossapharm, Basel, Switzerland - Liquemin, 25000 U.I./5 ml
High end electrosurgery BOWA, Germany ARC 400 Electrical source for blood suction. Alternative products can be used
Hydro-Guardmini breathing filter Intersurgical, Lithuania 1745000 Filters
Image J National Institute of Health, USA 1.47v Alternative products can be used
Inflation device, Atrion QL2530 Atrion medical product, Alabama, USA 96402 Alternative products can be used
IntelliVue MP 70 Philips, Boeblingen, Germany - Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used
KCl Sintetica SA - Potassium chloride 15%
Ketamine Vetoquinol - Narketan, 1ml/100mg
LR-ACT Medtronic 402-01 ACT special syringes
Midazolam Roche - Dormicum, 5mg/ml
Monopolar scalpel Alternative products can be used
Needle holder Alternative products can be used
High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing Spotimaging, USA 1080 p HD resolution. Alternative products can be used
PBS In-house preparation - Alternative products can be used
Peripheral venous cannula, 18 G Alternative products can be used
PowerLab 4/35 data acquisition system Adinstruments, Spechbach, Germany -
Rotamax120T Heidolph, Germany 544-41200-00 Shaker. Alternative can be used
Rüschelit-Super Safety Clear Tube Teleflex, Dublin, Irland 112480 Air way tubing, Alternative products can be used
Safe Pico Aspirator Syringes Radiometer 956-622 BGA special syringes
Saline Sintetica Bioren - NaCl 0,9%. Alternative products can be used
Sevorane 1.5% AbbVie AG - Sevorane 250ml 100%
Sheath Cordis, Johnson&Johnson, USA 504-607 A AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used
Space infusion pump B.Braun Medical AG, Germany - For infusion of fentanyl. Alternative products can be used
SPR-350 (Millar catheter) Adinstruments, Texas, USA 840-8166 MIKRO-TIP, 5F, 120 cm
Sternotomy saw Alternative products can be used
Sutures ETHICON, Johnson&Johnson, USA Y3110H Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used
Syringes (20, 10 and 5 mL) CODAN,Baar, Switzerland 62.7602,
62.6616,
62.5607
respectively
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used
Thorax spreader Alternative products can be used
Tissue-tek SAKURA, Netherlands 4583 O.C.T. compound
Vascular forceps Alternative products can be used
Xenetix 300 contrast media Guerbet, Zürich, Switzerland - Lobitridol, 300 mg iodide/ml
Xylazine Vetoquinol - Xylapan, 20mg/1 mL
2,3,5-Triphenyltetrazolium choride Sigma-Aldrich, Austria T8877
500 μL tubes (eppendorf) Trefflab, Switzerland 96.08185.9.03 Alternative products can be used

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References

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组织和采血程序标准化改善闭合性胸猪心肌梗死模型的研究
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Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).More

Abdelhafez, M. M., Shaw, J., Wilbs, J., Despont, A., Rieben, R. Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures. J. Vis. Exp. (133), e56856, doi:10.3791/56856 (2018).

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