Summary
ここに示すの並進価値が心筋虚血/再灌流障害の病態生理の理解を高めるために急性心筋梗塞の確立されたブタモデルのサンプリング手順を標準化するためのプロトコル新規薬剤の候補者をテストします。
Abstract
心筋虚血再灌流 (私/R) 心筋梗塞後, 壊死の面積のほぼ半分に貢献する損傷。心筋を回避または低減する承認薬がない日付に私/R 負傷。心筋の病態生理学的メカニズムの理解と研究/R 傷害は成功した治療法の開発が不可欠です。大規模な動物実験は、並進メソッドで重要なステップです。急性心筋梗塞のブタのモデルを確立されており、自分や他人によって記述されます。今後の実験で使用するためのサンプリング手法に焦点を当てて詳細にモデルの価値をさらに向上を目指しました。さらに、我々 は最終結果の品質に影響を与えることができる小さいが重要なステップを強調します。心筋の臨床状況を模倣する私/R 負傷、経皮的冠動脈インターベンション (PCI) カテーテルは、動脈左前下行枝冠 (LAD) 麻酔下のブタの挿入されました。このモデル模倣急性心筋梗塞、PCI 治療の領域を正確に把握する可能性を持つ人間のリスクだけでなく、壊死 ° ° °- と実行可能な虚血性の組織。ここでモデルは FXIIa の二環性のペプチド阻害剤の効果を調べるために使用されました。モデルは、心筋梗塞後の効果時間が長く再灌流を許可するように変更できます。
Introduction
虚血性心疾患、特に急性心筋梗塞 (MI) は、先進国1の死の主な原因です。今日、MI の標準治療は、経皮的冠動脈インターベンション (PCI)、バルーン カテーテル治療です。急性 MI の PCI 治療を受けた患者の予後と生活の質に影響を与える重要な要因の 1 つは、梗塞サイズです。サイズの削減は、患者の生存率と予後2大きな影響を持つことができます。心筋虚血・再灌流 (私/R) 傷害は、心血管の研究の主要な目的の 1 つは、回避または低減心筋梗塞巣の大きさに大きな影響私/R 負傷3。私の正確なメカニズム R 負傷がまだ調査4/。プラズマ カスケードと内皮細胞の活性化は、私の特徴/R 負傷5。凝固系の活性化は明らかに関与する6,7です。最近では、血液凝固カスケードの接触相活性化に伴う初期上流ペプチドとして FXII の役割は、FXII で示されている脳のモデルラットをノックアウト私/R 負傷8。ブタのモデルにこれらの結果の検証は、臨床の翻訳に重要なステップです。したがって、我々 は心筋のコンテキストで、新規環 (80 kDa) FXIIa プロテアーゼインヒビターをテスト私/パイロット研究で R 負傷。
急性 MI と PCI 治療の臨床状況を模倣、動物モデルが私たち理解心筋の病態を改善するために不可欠である/R 負傷、新規治療法の選択肢をテストします。豚の良い動物モデルを表す臨床心筋私/R 負傷。これは、彼らの心は解剖学と冠循環に関する人間の心に非常に似ていますが、それらはまた心筋の虚血と再灌流9,10と同様の病態生理学的応答を示すためだけではありません。ラットやマウスなどの他のモデルいないこれらの基準を満たすし、犬などが多くのより多くの担保の冠血管人間と比較して人間の心11,12と比較されたときかなりの相違を表示13。
ブタ心筋梗塞モデルは調べる心筋虚血性心疾患を含む循環器病研究で広く使用されています私/R 負傷14,15,16,17。後者は胸骨に関連する炎症性反応を最小化するため、炎症性疾患や開開胸手術使用が不可欠であります。C アーム血管造影の臨床を用いた閉胸のモデルは、この問題を克服します。さらに、最も重要なポイントの一つは梗塞サイズ (虚血性壊死、NIT) ができるように、我々 のプロトコルが虚血性 (リスク、AAR の領域) と非虚血性左心室 (ANR 危険でない領域) 部の正確な区別を提供することは正確に決定されます。今回の私たちの目的は心筋、ブタの再現方法を明確に定義する私/R 傷害モデル、特に私の分子メカニズムのより正確な分析を可能にする心筋組織サンプリングに関して/R 傷害と薬剤治療の効果の鮮明な画像。
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Protocol
1. 動物:
すべての動物は、スイスの国内法のガイドラインに従って扱われました。研究は、ベルンのカントンのローカル動物実験委員会によって承認された (アクセス許可なし。25/16 である)。
男女の大きな白豚を使う (~ 30 ± 5 kg)。2 つのグループに動物を盲目的に分割受信 FXIIa の環 (80 kDa プロテアーゼ) 阻害剤または治療の選択やその他のアクティブなコントロールの 1 つのグループ。
2. 手術 (図 1)
- 麻酔や動物の準備:
- 高速で 12 h のための動物実験を開始する前に。
- 事前にケタミンを 20 mg/kg と 10 mL のシリンジを使用して首に筋肉内注射を介してキシラジンを 2 mg/kg の動物を薬します。動物の体重を記録して、セックス。
- 耳介の静脈に 0.5 mg/kg ミダゾラムと 0.05 mg/kg アトロピンを注射することによって麻酔を誘導します。動物気管内チューブを挿管します。
- 人工呼吸器人工呼吸器を使用して麻酔を維持 (O2/空気 1:3、コメッツ 1.5%)、7-8 mm 気道チューブとフィルター。35%、6-10 mL/kg を一回換気量に触発された酸素 (FiO2) の割合を調整します。
- 麻酔深度は、鼻をつまんでモーターまたは自律神経の応答の不在で十分な評価されます。眼瞼反射および顎の調子は、継続的にもリラックスした顎の調子や眼瞼反射の不在を対象とした監視されました。コア温度を常時監視し、常温療法 (38-38.5 ° C) のメンテナンスは、パッシブ (分離毛布と暖かいボトル) 地球温暖化で確保しました。
- 無料、フリー、Koudstaal および彼の同僚の手順 3 1 3 318、両側内頚動脈で、前述の解剖し、7F シースとそれらを cannulate します。静脈血サンプリング 7F シースと左頸静脈を cannulate します。
- 続いて 250 μ g/h 輸液ポンプを使用して連続点滴静注として中心静脈ラインを 250 μ g のフェンタニル鎮痛剤のボーラス投与量を管理します。体温、心拍数、3 誘導心電図 (ECG)、全体の実験中に動脈、中心静脈圧とリズムを監視します。
- 静脈ラインから次のベースライン血液サンプルを撤回する標準的な採血管を使用して、: 5 mL クエン酸血漿およびそれぞれのチューブに 2.9 mL EDTA 血漿。すぐに 4 ° C で 15 分間 2,000 × g で遠心します。血清チューブに 2.9 mL の血液を取り出して、室温で 30 分間上記のように遠心分離前に凝固することができます。
- 血しょうか血清 500 μ L に 200 μ L 分注チューブし、さらなる分析-80 ° C ですべてのサンプルを格納します。
- 製造元の指示に従って BGA マシンを用いた BGA を測定する特殊な血液ガス分析 (BGA) が注射器を使用して動脈ラインから血の 0.5 mL を撤回します。
- 標準 2 mL 注射器を使用して静脈ラインから血の 0.5 mL を撤回し、すぐに 30 G の針を使用して行為カートリッジに転送。製造元の指示に従って血液凝固時間測定法マシンに塗りつぶされたカートリッジを挿入します。タイム ポイントは図 2を参照してください。
- 2 mL 注射器を使用して静脈ラインに 5000 IU 未分画ヘパリンを管理および MI の実験を開始する前に 20 分を安定させるために動物を許可します。
- 2.1.11 で述べたように、モニターはすべての 30-45 分を機能します。法律が < 180 s の場合 2500 IU 未分画ヘパリンを静脈内注入します。
- 心筋梗塞の実験
- 標準的な C アーム透視装置を使用 (冠動脈造影プログラム、角度 0 °、12 フレーム/秒 〜 70 kV) または専用の血管造影システムまた、冠動脈インターベンションを実行します。
- 透視を使用して、左頚動脈で以前に配置したシースを介して圧力カテーテル (5 階、120 cm) を挿入します。左心室にそれを進めます。圧力のカテーテルを左心室圧を記録する集録システムに接続します。集録システムを継続的に計算して開発した心拍数を記録する必要がある圧力、dP/dt 最大 (左心室の収縮性) 及び dp/dt 最小 (左心室の弛緩) 全体の実験中。10 分の基準値を記録します。
- 6 階 (100 cm、EB3.75) を挿入右総頚動脈に以前に配置したシースを介してカテーテル。左冠動脈、左冠行枝 (LAD) に到達するために x 線の指導の下でそれを進めます。ガイディングカテーテル経由で 20 mL の注射器を使用して、ベースラインの冠動脈造影を実行する造影剤を注入します。
注: 造影剤の注入圧によって行われていたが、専用の電源インジェクター システムを使用することも可能性があります。 - 経皮的冠動脈インターベンション (PCI) カテーテルの適切なサイズを選択する x 線モニターに若者のサイズを評価します。15-25 mm、直径 2 と若者のサイズに応じて mm 3.5 間の長さと PCI バルーンを使用します。PCI カテーテル、冠動脈ガイドワイヤー (F 014/J 175 cm) を組み立てます。造影剤が記入されたインフレーション デバイスと PCI カテーテルを接続します。
注: 若者直径は定規を使用してキャリブレーション モニター上で直接測定することができ、PCI バルーンのサイズがそれに応じて選択されます。 - 2.2.4 から組立システムをカテーテルの内腔に挿入します。若者の 2 つ目の対角枝を超えてに到達するまでガイドワイヤを若者に進出します。
- 若者の約真ん中に達するまで PCI カテーテルを事前に透視を使用します。通常時に左心室 (LV) の AAR の同じようなパーセントを持つために最初の対角枝 (図 3) は後、2 番目の後、冠動脈の解剖学によって若者のブロック サイトを選択します。
注: ブロックのサイトの選択は、対角枝の長さとこのようにそれぞれ支店を経由の血によって供給されるティッシュの領域に依存します。長い、場合これの直後に分岐最初対角枝ブロックのサイトになります。短い最初対角枝の場合ブロックは 2 番目の斜め後行われます。 - ガイドワイヤを削除し、PCI カテーテルのバルーンを膨らませるし、徐々 に 1 のための心筋虚血を誘発する 7-10 バーに膨らまし装置内の圧力の増加を FiO2虚血の 15 と 40 分間の 50-60% に増やします。6-10 mL/kg で一回換気量を維持します。
注: この手順に発生の発生を減らす、心室細動の頻度を減少します。 - 虚血; を開始直後後が PCI カテーテルのバルーンの血管造影カテーテルを通して造影剤を注入しながら 5-10 の映像記録10 分間虚血 PCI カテーテルのバルーンに遠位の若者の完全閉塞を確認する後を繰り返します。
- すぐに、検出し、治療 (2.2.10) に密接に動物を監視不整脈。発生は通常発生して周波数の増加 (> 毎分 3) 心筋虚血の誘導後 20 〜 40 分間。このような場合は、頬のすぐ下両側に首を優しくマッサージします。ほとんどの場合これは総頸動脈にある迷走神経体位刺激によっておそらく定期的にハートビートを再確立に十分でしょう。
- 不整脈は、心室細動に進行、洞リズムを再確立するのに外部、二相性除細動器を使用します。150 J (30 kg の動物) のショック状態し、酸素を含む血液と、冠動脈を埋めるためにショックを適用する前にすぐに除細動パッドを使用して 5-10 胸部圧迫を適用します。
- 必要に応じて繰り返し、175 J 3rd衝撃後にエネルギーの増加。重い動物のより高いエネルギー設定を使用します。
- 虚血時間の終わりの前に 5 分では、2.1.8-2.1.13 に記載されている採血を繰り返します。被験物質を注入 (環 FXIIa 阻害または 4 mg/kg を制御、盲目的にこれにこれを行う) 中心静脈ラインとフラッシュ 20 mL の生理食塩水でラインを通して静脈内投与。
- 1 クエン酸血漿を撤回する (前述の 2.1.8 で 2.1.9) 2.2.12 で物質を注射した後 4 分。
- 若者の閉塞を確認し、PCI カテーテルのバルーンをしぼませる、このカテーテルをカテーテルから削除する血管造影 (2.2.3) を実行します。心筋虚血の徴候は 5 分以上のため、直前に心電図で表示されていたときにデフレと 10 分その後、PCI カテーテルのバルーンの除去の直後に血管造影で, 閉塞部に遠位の若者の血流を確認します。若者の再閉塞は。
- 2 h の心筋虚血後再灌流を許可します。再灌流 (2.1.8 と 2.1.9) の 10、30、60、115 分で血漿、血清サンプルを取る。60 と 115 分 (2.1.10) で BGA を監視します。
- 虚血のために使用したのと同じ位置にガイドワイヤーと共に PCI カテーテルを挿入し直します。前に、PCI のカテーテルのバルーンを膨らませるし、血管造影 (2.2.3) によって若者の閉塞を確認します。左心室から圧カテーテルを削除し、記録を停止します。
- 2 %100 mL を注入中心静脈ラインにエバンス ブルー リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4)。約 30 秒後、全体の動物が、青に変わったら注入 40 mL 20% 動物の安楽死に塩化カリウム。死は、心電図、脈波の有無によって確認されました。
3. サンプリング技術
-
心 (図 4) をサンプリングを抽出、解剖、
- 中心部を公開する胸骨を実行します。Koudstaal と同僚、手順 8-2、8-318に記載されたプロトコルに従ってください。カット オープン心膜以前心膜炎由来し、動物がさらに評価されない可能性があります異常の検査中。
- 収縮し、カテーテルと同様に、PCI を削除します。詳しく分析するため心臓を切除します。下大静脈を切断し、血液吸引ポンプを使用し、体と心を結ぶすべての大型船をカットを削除します。
- 部屋の温度生理食塩水で心臓内と外をすすいでください。心臓全体の重量を量る。
- 30-40 分以内には、鋭いナイフを使用して長い軸に垂直な僧帽弁の腱索形態に頂点から約 3-5 mm のスライスに中心部をカットします。
- 常に同じ向きでカット サンプル (図 5) の方向を維持するために上を向いて腹側と中心部を配置する注意してください。
- デジタル単一レンズの反射カメラを用いた心のスライスを撮影します。
- 右心室 (不要として破棄) を切り取る。写真左心室スライスと左心室の総重量のすべてのスライスの重量を量る。
- エバンス ブルー肯定的なすべてのセクションでエバンス ブルーの否定的な組織と区別します。メスを使用して非虚血性の組織 (エバンス ブルー正) から、虚血性 (エバンス ブルー負) を分離するスライスを解剖します。
- まずエバンス ブルーの否定的なセクション (AAR リスクで虚血領域) を分析します。それらすべての重量を量るし、プラスチック製の容器にすべて入れてください。
- (心臓のサイズ) によると 100-150 mL トリフェニル テトラゾリウム塩化物溶液 (2 g、TTC 16 g デキストラン、分子量 48000-90000、200 mL の PBS、作りたてに) 完全にスライスをカバー、ソリューション内中心部分が自由に移動できるようにします。コンテナーをカバーし、軽く振りながら 37 ° C で 20 分間インキュベートします。
- インキュベーションこの 20 分の時間では重さ・ エバンス ブルーの中に肯定的な部分 (ANR 危険でない領域) は組織 Tek を埋め込むためのサンプルを取る (損傷から最も遠位部を選択) し、さらに分析-80 ° C で保存します。4% ホルムアルデヒド液に残りの部分を転送し、組織学のセクションの常温で保存します。
- TTC ソリューションから AAR の部分を削除します。赤の染色組織は実行可能な虚血組織 (VIT)、非染色組織が虚血性壊死 (NIT)。小 2 個 (2 ~ 3 mm のブロック) をカット両方 NIT と VIT、組織 Tek にそれらを埋め込むし、さらに詳しい分析-80 ° C で保存します。これらのサンプルは、同じ重さで必要があります。
- 発泡スチロールの容器にそれらをピンで止めるとヒューム フードに室温で 24 時間 4% ホルムアルデヒド溶液を完全にカバー (AAR から派生したすべてのスライス) の作品の残りの部分を修正します。作品写真ドキュメントについては、次の手順でフラット滞在してください。
- 次の日同じズーム設定と組織 (同じ倍率) からの距離と高解像度カメラを使って作品の両側を写真します。自動スケール バーをすべての画像に追加します。すべてのバーは、同じ長さである必要があります。
注: 高解像度カメラは自動的にそれぞれの写真に縮尺記号を追加するソフトウェアに接続する必要があります。
-
AAR および梗塞サイズの計算
- 左心室の AAR % = (AAR の重量 g/重量 g で左心室の) * 100。
- AAR と写真に基づいて NIT (各部分の両側) の総面積を計算するのに ImageJ ソフトウェアを使用します。
- 角度ツールからの直線を使用してスケールのバーの長さを選択することによって、スケール バーを調整します。分析メニューから選択 > 縮尺の設定、既知の距離と縮尺記号の単位を挿入します。すべての写真に同じスケールが適用されますので「グローバル」を選択します。
- AAR を計算するフリーハンド選択ツールを使用して組織の全体の表面積をマークします。組織や脂肪組織 (図 6 C) の側 (高さ) を含めないように注意してください。
- 「領域」と分析から「ラベルを表示」を選択することで、測定を設定 > 設定測定メニュー。分析から表面積を測定 > メジャー。
- 3.2.5 NIT を測定する (マーク非染色組織のみ) の手順を繰り返します。注: は、寄生虫の卵の計算に脂肪組織 (図 6 D) を含めないでください。組織の他の側の手順を繰り返します。
- AAR および組織の各部分の NIT の平均を計算します。
- 3.2.7 から取得した値を使用して、AAR:% AAR NIT の割合として、NIT を計算する = (Σ 平均体表面積 NIT の cm2/Σ 平均 AAR の cm2の表面積) * 100。
- 2 つの別の捜査官は、上記の方法を繰り返す必要があります。差異の許容は、< 10% です。
-
虚血マーカー
- -80 ° c (2.1.9) 心筋トロポニンのレベルを測定する以前に保存されている EDTA 血漿検体を使用- 19を説明私は、以前シングル プレックス Luminex タイプの試金を使用して。
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Representative Results
1 つの動物は、技術的なエラー (虚血時に、被験物質の添加前に血圧の急激な低下) による FXIIa 阻害剤または制御ペプチドの投与前に途中で死亡しました。1 つの動物は、左前下行枝 (LAD) の解剖学的異常のために虚血/再灌流障害は認められなかったので FXIIa 阻害剤グループから除外されました。尖部を含む左の心室の大部分はこの動物の回旋動脈灌流。最終的な分析に含まれている動物であった n = 環 FXIIa ペプチド阻害剤群 2 (27.5 ± の重量を意味する 2.5 kg) と n = 3 非アクティブな二環式制御ペプチドの受信 (29 ± の重量を意味する 0.8 kg)。
ビデオ画像を x 線/豚の心臓の冠動脈造影は、圧力カテーテルの位置を視覚化し、若者 (図 3 a) をブロックする場所を決定に使用されています。図 3 bは、2 つ目の対角枝の遠位の血流を遮断カテーテルの位置を示しています。図 3 aと3 bの比較は、虚血性なる若者が指定した心筋の一部の推定も可能です。2 再灌流時間の終わりに PCI カテーテルが再導入し、虚血時だったので、同じ位置に膨張します。エバンス ブルー、注入静脈内 (図 5 a) AAR を正確に判断します。中心部の切除後、左心室が僧帽弁、長い軸に垂直になるまで頂点から 3 ~ 5 mm の分厚い部分にスライスします。AAR と ANR がはっきりとエバンス ブルー スライスに染色により区分します。AAR と ANR サンプリング領域を図 5Bに示します。
左心室の割合として表される、AAR は FXIIa 治療グループとコントロール グループ (図 6 a) の統計的に有意な違いを示しています。梗塞サイズ (ニット/AAR) はどちらかのグループ間の違いを示さない (非パラメトリック マン-ホイットニーを使用してテスト、p > 0.05、図 6 b)。FXIIa 阻害剤濃度とアプリケーションの期間に、単独でことができる心筋から中心を保護しないことが示唆された私/R 負傷。図 6および 6 D正確かつ再現性をもってそれぞれの表面積を測定するために AAR および NIT の境界線をマークする方法を示します。
血液サンプリング戦略により、心筋損傷マーカー心筋トロポニンのリリース-私は時間をかけて監視します。再灌流は図 7に示すように、時間をかけて継続的な増加後ながらベースラインと虚血 1 時間後に違いはほとんどありません。トロポニンの-私は、グループ間の違いも認められなかったこれらの実験で。
図 1.実験のタイムラインの概要。心筋虚血・再灌流障害モデルにおける重要なステップのスケマティックのタイムラインです。ベースライン冠可視化, 虚血の時間を開始、心臓の不整脈を監視およびテスト物質を注入することは、実験の重要なステップです。すべての実験では正確なタイミングの使用には、再現性が保証されます。安楽死させる動物と心の切除は 2 h 再灌流フェーズが完了した後の 15-20 分以内行わする必要があります。塩化カリウム kCl:。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.血液サンプリング及び分析のタイムライン。採血の時点は、抗凝固剤使用の種類と共に示されます。その他のサンプルは、測定する実験と分析によると取得できます。行為: 活性化凝固時間、BGA: 血液ガス分析、RT: 部屋の温度。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.冠動脈造影します。ベースラインで (A) の左冠動脈の透視ビューは、黄色の矢印が最初と 2 番目対角枝をポイント白い矢印が指す心尖 (B) 左心室 (LV) のない流路面積を示すオクルー ジョンの若者赤い矢印は PC に私カテーテル (C) は、虚血時、若者で同じサイトに再挿入した PCI カテーテルのバルーンと再灌流の終わりに若者の再閉鎖。CX: 回旋動脈、若者: 前降順冠状動脈、MC を左: ミラー カテーテル、左心室に挿入されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.組織サンプリングの概念図です。心臓解剖の正確なタイミングとさらに詳しい分析のさまざまな領域のサンプリング。タイムラインは、虚血、動物実験の終了後 20 分の初めの後 205 分で開始します。動物を安楽死させる後最大 40 分以内 TTC の切片をインキュベートすることが重要です。ANR、VIT および NIT のサンプリングは、白の正方形として示されます。4% のホルムアルデヒドの AAR をインキュベート梗塞サイズの正確な定量 NIT と VIT と明確に区別できます。AAR: リスク、ANR の領域: リスク、LV ではなくエリア: 左心室、NIT: 虚血性壊死、OTC: 組織-tek 社、RV: 右心室、TTC: トリフェニル テトラゾリウム塩、VIT: 実行可能な虚血性の組織。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.リスク (AAR) の領域と ANR 危険ではなく面積の場で区別します。(実験の終わりに胸骨後ちょうど全体の心 A) 代表的な写真です。(B) 代表的な図郭清後 3 〜 5 mm 厚の左心室を見せします。AAR と ANR が明確に定義されている黄色の矢印で示され、白の矢印は、ANR サンプリング領域を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.虚血と梗塞サイズ。(A) 左心室 (LV) の AAR の割合の重量。(B) AAR の NIT の割合表面領域。(C) AAR 計算の代表的な写真。(D) NIT 計算の代表的な絵。白の矢印が VIT サンプリング領域を示しています、黒の矢印が名工大サンプリング領域を示しています。データは、ImageJ ソフトウェアを使用して計算されました。値のとおり個々 のドット実験平均 ±± の徴候との SD 群、n = 3 と FXIIa 阻害剤治療グループ、n = 2。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7.心臓の筋肉の損傷のマーカー。トロポニン-私コントロール FXIIa 阻害剤の pg/ml で時間の経過と共に濃度投与群。再灌流・心筋トロポニンの中にベースライン、虚血の終わりおよびいくつかの時点で EDTA プラズマ チューブに、血を頚静脈から収集された-シングル-プレックス サスペンション アレイ (プレックスタンパク) を用いています。データのとおり個々 のドット実験平均 ±± の徴候との SD 群、n = 3 と扱われる FXIIa グループ、n = 2。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
心筋私/R 負傷後急性心筋梗塞3患者の予後に直接変換は最終梗塞サイズに大きな影響があります。心筋の病態生理を理解私/R 傷害は減らすか、それを防ぐために最初のステップです。心筋私/R の損傷、閉塞血管の再灌流直後後に発生する急性の状態。私/R 負傷は自然免疫応答の活性化につながるし、再灌流と周囲組織20のサイトで細胞の損傷が発生しました。最近の研究は、脳のラットモデルにおける神経学的予後の改善を示した私/R 負傷8FXIIa 阻害剤で処理します。ただし、現在のパイロット研究では我々 が見つかりません環 FXIIa 阻害剤の効果で心筋私/R 負傷。使用される FXIIa 阻害剤の新規であり、豚の体内動態はまだ知られていません。したがって、効果の観測の欠如は、不適切な投薬またはアプリケーションによって原因可能性があります。これは、フォロー アップ研究で対処する必要があります。
動物モデルの標準化は深さで心筋の病態を調べることが不可欠、私/R 負傷して診療所に適切なソリューションをもたらします。心筋の病態生理を調査私 R 傷害それの細胞メカニズムを研究するために良いと代表的なサンプリングする必要があります。ブタの閉胸心筋私/R 損傷モデルは臨床状況に近いとするのに役立つ細胞メカニズムとテスト新しい治療薬について、再現可能な方法を提供します。現在のモデルのバリアントは、上記の目的14,17,18の前に記載されています。
豚における急性心筋梗塞の我々 のプロトコルは、前述の18,21としてアミオダロンによる前処理を必要はありません。不整脈と心室細動の場合 cardioconversion の二相性除細動器を削減する頸動脈洞マッサージを使いました。頸動脈洞マッサージの使用は心房細動の22日に影響を与える臨床的に知られているが、これまでのところそれ示されていないようにする人間、または豚モデルで MI に心室細動の発症を遅らせます。また、セボフルランの使用は心室性不整脈と心筋硬塞23ブタモデルで死亡率を減らすのに役立ちます。
ヘパリンの用量 Koudstaal ら18で前述の例を修正を使用してのではなく、再現性を確保し、実験中に血栓症のリスクを減らす、複数の用量のヘパリンを投与法では、繰り返しの測定に基づきます。私のコンテキストで凝固カスケードを調査するのに役立ちますヘパリン投与量を制御/R 負傷。エバンス ブルーにより、AAR/左の正確な定量ANR に最小限の影響で中心部の非虚血性の部分を含む全体の豚の青を汚すため、透視下虚血誘導中に正確なサイトで若者の再閉塞後エバンス ブルーの静脈内注射心筋と血管系。エバンス ブルーは、知られている細胞毒性物質24です。現在実験に使用するために ANR 心臓血管の内皮細胞層の生存を維持するために重要でしたので 100 mL エバンス ブルーは全身注入し、全血の減少で希釈を制御内個人としてそれの毒性。以前は、同様の設定で心臓にその細胞毒性のリスクを増加させる冠動脈に直接注入したエバンス ブルー 50 ml 2% は25をセルします。次の重要なステップは、最大僧帽弁 (すべての動物で正確な位置) と左心室の割合として AAR の正確な計算をするこのメソッドを使用して頂点から 3 ~ 5 mm スライスに直接心臓を解剖するだった。
メソッドの現在の説明は、以前記載されていない細かい詳細を提供します。実行可能な (赤) と明確に区別を提供 24 時間 4% のホルムアルデヒドのセクションを染色 TTC をインキュベートし、(白) 壊死、最終的に更に分子汚染のサンプリングの再現性を高める。血液サンプリング戦略再灌流の以上 2 h 後 (60 のそして 120 分) と同様、再灌流の非常に早い (10, 30 分) 段階で新しく発現分子の検出が有効に。正しい血液および組織採取と保管もプラズマ カスケード マーカーなどの補完し、凝固の蛋白質の表現の分析のために重大が。
日に数時間から、長い再灌流時間を持っている、現在のプロトコルを変更できます。これにより、私の後の結果を調査する研究者/心に R 傷害の新規治療薬、その効果の評価テストを行えます。現在のプロトコルの制限は、心臓の機能の測定圧力ヒント カテーテルの使用です。圧容積ループ測定システムの使用によって心機能のより信頼性の高いデータを取得できます。要するに現在のメソッドはブタの閉胸心筋の再現性を高めるために必要な重要な詳細を提供します私 R 傷害モデル モデルの使用目的とのコンテキストで細胞・分子の変化を研究することです/心筋の勉強私/R 傷害の病態や治療の新しい選択肢を勉強します。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者は、FXIIa 阻害剤と、対応するコントロールを提供する教授クリスチャン Heinis を認識したいです。また感謝するラミナー Beslac、博士ダニエル メトラー、実験的手術ユニット、生物医学研究、テクニカル サポートのためのベルンの大学のための部門からケイ Nettelbeck。セリーヌ Guillod と診断、Interventional ベルン大学病院小児放射線科からマティアス ラウシュ Inselspital は x 線装置と技術サポートを提供しました。このプロジェクトは、スイスの全米科学財団のプロジェクト号 320030_156193 によって賄われていた。我々 はまたコミュニケーションとマーケティング、ベルン大学病院映像記録実験用 Inselspital から氏 Reto Haenni に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 90 Flex, blood gas analyser | Radiometer | - | Blood gas analysis (BGA) |
| ACT Plus | Medtronic | - | Activated clotting time |
| Atropin | Sintetica | - | Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml |
| Balance (20-500 Kg) | NAGATA Scale, Tiwan | HTB/HTR | Alternative products can be used |
| Balance (21-4200 g) | Mettler toledo, Switzerland | MS4002SDR | Alternative products can be used |
| Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum | S-Monovette, Nuembrecht, Germany | 05.1167.001, 05.1071.001 and 05.1557.001 respectively |
Alternative products can be used |
| BV Pulsera mobile C-arm | Philips | - | Alternative products can be used |
| Centrifuge | Labcare, UK | ALC PK120R | Alternative products can be used |
| Defibrillator Lifepak 12 | Medtronic | - | Alternative products can be used |
| Dextran from Leuconostoc mesenteroides | Sigma-Aldrich, Germany | D3759 | Average M.wt 48000-90000 |
| Digital single lens reflex camera | Sony, Thailand | DSLR-A500/A550 | Alternative products can be used |
| Dissecting forceps | Alternative products can be used | ||
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15300S | Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15350S | Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich, Germany | E2129 | Toxic |
| Fabius GS premium respirator | Dräger, Lübeck, Germany | - | Anesthesia work station, Alternative products can be used |
| Fentanyl | Inselspital ISPI | - | Fentanyl 2500mcg/50ml |
| Formaldehyde | Pathology Institute, Bern University | SI148701 | Alternative products can be used |
| FXIIa inhibitor | Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL | Novel bicyclic peptide | |
| Galeo, coronary guidewire | Biotronik, Germany | 125497 | Alternative products can be used |
| Guidance catheter | Boston Scientific, Florida, USA | 34356-06 | 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used |
| Heparin Sodium | Drossapharm, Basel, Switzerland | - | Liquemin, 25000 U.I./5 ml |
| High end electrosurgery | BOWA, Germany | ARC 400 | Electrical source for blood suction. Alternative products can be used |
| Hydro-Guardmini breathing filter | Intersurgical, Lithuania | 1745000 | Filters |
| Image J | National Institute of Health, USA | 1.47v | Alternative products can be used |
| Inflation device, Atrion QL2530 | Atrion medical product, Alabama, USA | 96402 | Alternative products can be used |
| IntelliVue MP 70 | Philips, Boeblingen, Germany | - | Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used |
| KCl | Sintetica SA | - | Potassium chloride 15% |
| Ketamine | Vetoquinol | - | Narketan, 1ml/100mg |
| LR-ACT | Medtronic | 402-01 | ACT special syringes |
| Midazolam | Roche | - | Dormicum, 5mg/ml |
| Monopolar scalpel | Alternative products can be used | ||
| Needle holder | Alternative products can be used | ||
| High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing | Spotimaging, USA | 1080 p HD resolution. Alternative products can be used | |
| PBS | In-house preparation | - | Alternative products can be used |
| Peripheral venous cannula, 18 G | Alternative products can be used | ||
| PowerLab 4/35 data acquisition system | Adinstruments, Spechbach, Germany | - | |
| Rotamax120T | Heidolph, Germany | 544-41200-00 | Shaker. Alternative can be used |
| Rüschelit-Super Safety Clear Tube | Teleflex, Dublin, Irland | 112480 | Air way tubing, Alternative products can be used |
| Safe Pico Aspirator Syringes | Radiometer | 956-622 | BGA special syringes |
| Saline | Sintetica Bioren | - | NaCl 0,9%. Alternative products can be used |
| Sevorane 1.5% | AbbVie AG | - | Sevorane 250ml 100% |
| Sheath | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 504-607 A | AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used |
| Space infusion pump | B.Braun Medical AG, Germany | - | For infusion of fentanyl. Alternative products can be used |
| SPR-350 (Millar catheter) | Adinstruments, Texas, USA | 840-8166 | MIKRO-TIP, 5F, 120 cm |
| Sternotomy saw | Alternative products can be used | ||
| Sutures | ETHICON, Johnson&Johnson, USA | Y3110H | Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used |
| Syringes (20, 10 and 5 mL) | CODAN,Baar, Switzerland | 62.7602, 62.6616, 62.5607 respectively |
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used |
| Thorax spreader | Alternative products can be used | ||
| Tissue-tek | SAKURA, Netherlands | 4583 | O.C.T. compound |
| Vascular forceps | Alternative products can be used | ||
| Xenetix 300 contrast media | Guerbet, Zürich, Switzerland | - | Lobitridol, 300 mg iodide/ml |
| Xylazine | Vetoquinol | - | Xylapan, 20mg/1 mL |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium choride | Sigma-Aldrich, Austria | T8877 | |
| 500 μL tubes (eppendorf) | Trefflab, Switzerland | 96.08185.9.03 | Alternative products can be used |
References
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