Summary
Aqui vamos demonstrar um protocolo para padronizar os procedimentos de amostragem de um modelo estabelecido de suínos de infarto agudo do miocárdio, a fim de aumentar seu valor de translação no entendimento da fisiopatologia da lesão de isquemia/reperfusão miocárdica e para testar candidatos a novos fármacos.
Abstract
Reperfusão de isquemia miocárdica (eu / R) lesão contribui para quase metade da área necrótica após infarto do miocárdio. Até à data, não há nenhuma droga aprovada para evitar ou reduzir miocárdica eu / lesão R. O estudo e compreensão dos mecanismos fisiopatológicos do miocárdio eu / R lesão é essencial para desenvolver tratamentos bem sucedidos. Experiências com animais grandes são um passo importante na translação métodos. O modelo suíno de infarto agudo do miocárdio foi estabelecido e descrito por nós mesmos e os outros. Objetivo melhorar ainda mais o valor do modelo, concentrando-se em detalhes sobre as técnicas de amostragem para uso em experimentos futuros. Além disso, Ressaltamos a passos pequenos, mas importantes que podem afetar a qualidade do resultado final. Para imitar a situação clínica do miocárdio eu / lesão R, um cateter de intervenção coronária percutânea (PCI) foi inserido no esquerdo artéria descendente anterior coronária (rapaz) de um porco anestesiado. ° ° ° Este modelo imita infarto agudo do miocárdio e tratamento PCI em seres humanos com a possibilidade de determinar com precisão a área de risco assim como a necrose- e tecido isquêmico viável. Aqui, o modelo foi usado para investigar o efeito de um inibidor de peptídeo bicíclico de FXIIa. O modelo também pode ser modificado para permitir tempos de reperfusão mais estudar os efeitos posteriores de infarto do miocárdio.
Introduction
Doença isquêmica do coração, em especial infarto agudo do miocárdio (MI), é a principal causa de morte em países desenvolvidos 1. Hoje, o tratamento padrão de MI é intervenção coronária percutânea (PCI), o tratamento de cateter de balão. Um dos fatores críticos que afeta a qualidade de vida e o prognóstico de pacientes após MI aguda tratada com PCI são o tamanho do infarto. A redução do tamanho pode ter um grande impacto na para sobrevivência e prognóstico do paciente 2. Isquemia/reperfusão miocárdica (eu / R) lesão tem uma influência significativa sobre o tamanho do infarto por um dos principais objectivos em pesquisa cardiovascular é evitar ou reduzir miocárdica eu / R lesão 3. Os mecanismos exatos de I / lesão R estão ainda sob investigação 4. Ativação das cascatas de plasma e as células endoteliais são marcas registradas de I / R lesão 5. Ativação do sistema de coagulação é claramente envolvidos 6,7. Recentemente, o papel do FXII, como um início peptídeo montante envolvido na ativação de contato fase da cascata da coagulação, tem sido demonstrado em um FXII nocautear modelo do rato de cerebral eu / R lesão 8. Validação destes resultados em um modelo de suínos é um passo importante na tradução clínica. Portanto, estamos testando um inibidor de FXIIa romance bicíclico (80 kDa protease) no contexto do miocárdio eu / lesão R em um estudo piloto.
Modelos animais, que imitam a situação clínica de tratamentos MI e PCI agudas, são essenciais para melhorar a nossa compreensão da fisiopatologia do miocárdio eu / lesão R e testar as opções de tratamento de novela. Os porcos representam um bom modelo animal para clínicos miocárdica eu / lesão R. Isto não é só porque seus corações são muito semelhantes aos corações humanos no que diz respeito a anatomia e circulação coronária, mas eles também mostram respostas fisiopatológicas semelhantes a miocárdica isquemia e reperfusão 9,10. Outros modelos tais como ratos e camundongos não cumprir esses critérios e mostrar diferenças consideráveis em relação de corações humanos 11,12, Considerando que os cães por exemplo, têm muitos vasos coronarianos colaterais, mais, em comparação com os seres humanos 13.
O modelo de suínos infarto agudo do miocárdio tem sido amplamente utilizado em pesquisa cardiovascular para investigar a doença de coração isquêmica incluindo miocárdica eu / R lesão 14,15,16,17. O último é uma condição inflamatória, por causa do qual minimizando a reação inflamatória relacionada a esternotomia ou toracotomia usada na cirurgia de peito aberto é essencial. O modelo de peito fechado usando uma configuração de angiografia C-braço clínica resolve este problema. Além disso, um dos pontos mais importantes é que nosso protocolo fornece uma distinção exata entre isquêmica (área de risco, AAR) e áreas não-isquêmicas do ventrículo esquerdo (área de risco, ANR) para que o tamanho do infarto (tecido necrótico isquêmico, NIT) pode ser determinado com precisão. O nosso objectivo para este papel é definir claramente uma metodologia reproduzível de um suíno miocárdica eu / lesão R modelo, em particular no que diz respeito a amostragem do tecido do miocárdio, que permitirá uma análise mais precisa dos mecanismos moleculares de I / lesão R e um mais clara dos efeitos dos tratamentos com drogas novas.
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Protocol
1. os animais:
Todos os animais foram tratados de acordo com as orientações da legislação nacional Suíça. O estudo foi aprovado pelo comitê local de experimentação animal do Cantão de Berna (permissão não. SER DE 25/16).
Use grandes porcos brancos de ambos os sexos (~ 30 ± 5 kg). Divida os animais cegamente em dois grupos, um grupo receber um inibidor (80 kDa protease) bicíclico de FXIIa ou o tratamento de escolha e o outro um controle inativo.
2. ato cirúrgico (Figura 1)
- Anestesia e preparação do animal:
- Rapidamente os animais para 12 h antes de iniciar o experimento.
- Pre-medicar o animal com 20 mg/kg de ketamina e 2 mg/kg de xilazina através de uma injeção intramuscular no pescoço, utilizando uma seringa de 10 mL. Registre o peso do animal e sexo.
- Induzi anestesia pela injeção de 0,5 mg/kg de Midazolam e 0,05 mg/kg Atropin na veia auricular. Entube o animal com um tubo endotraqueal.
- Manter a anestesia por ventilação mecânica, usando um respirador (O2/Air do 1:3, sevoflurano 1,5%), um tubo de vias aéreas de 7-8 mm e um filtro. Ajuste da fração inspirada de oxigênio (FiO2) para 35% e o volume corrente de 6 a 10 mL/kg.
- Profundidade da anestesia é avaliada como adequada na ausência de respostas autonômicas ou motor para beliscar o nariz. Reflexos palpebrais e Tom mandíbula foram monitoradas continuamente também direcionamento Tom descontraído maxilar e ausência de reflexos palpebrais. Temperatura do núcleo foi continuamente monitorizada e manutenção de normotermia (38-38,5 ° C) foi assegurada com aquecimento passivo (isolando cobertores e garrafas quentes).
- Dissecar livre, como anteriormente descrito por Koudstaal e seus colegas as etapas 3-1 para 3-318, as artérias carótidas em ambos os lados e Canule-los com uma bainha 7F. Canule a veia jugular esquerda com uma bainha 7F para recolha de amostras de sangue venoso.
- Administre uma dose em bolus de 250 µ g analgésico de fentanil através da linha venosa central, seguido de 250 µ g/h como uma infusão intravenosa contínua, usando uma bomba de infusão. Monitorar a temperatura corporal, frequência cardíaca e ritmo com um vantagem de 3 eletrocardiograma (ECG), pressão venosa central e arterial durante todo o experimento.
- Usando tubos de colheita de sangue padrão, retirar as seguintes amostras de sangue de linha de base da linha venosa: plasma de EDTA 2,9 mL para os respectivos tubos e plasma citratado de 5 mL. Centrifugar imediatamente a 2.000 x g, durante 15 min a 4 ° C. Tirar sangue de 2,9 mL para um tubo de soro e deixe para coagular por 30 min à temperatura ambiente antes de centrifugação conforme descrito acima.
- Alíquota 200 µ l de plasma ou soro em 500 µ l tubos e armazenar todas as amostras a-80 ° C para uma análise mais aprofundada.
- 0,5 mL de sangue retire a linha arterial utilizando que a análise de gás de sangue especiais (BGA) seringas para medir BGA usando a máquina BGA de acordo com as instruções do fabricante.
- Retirar a linha venosa utilizando uma seringa padrão 2 mL 0,5 mL de sangue e transferi-lo imediatamente no cartucho ACT usando uma agulha 30G. Insira o cartucho cheio dentro da máquina de ACT para medir o tempo de coagulação, de acordo com as instruções do fabricante. Consulte a Figura 2 para pontos de tempo.
- Administrar 5000 IU fluida de heparina na linha venosa, utilizando uma seringa de 2 mL e permitir que o animal se estabilize por 20 min antes de iniciar o experimento de MI.
- Monitor agir cada 30-45 min, como mencionado em 2.1.11. Injete heparina unfractionated 2500 IU por via intravenosa, se o ato é < 180 s.
- Experimento de infarto do miocárdio
- Usar um equipamento de fluoroscopia de braço C padrão (programa de angiografia coronária, ângulo de 0°, 12 quadros por segundo, ~ 70 kV) - ou alternativamente um sistema dedicado de angiografia - para realizar a intervenção coronária.
- Use sob orientação fluoroscópica para inserir um cateter de pressão (5F, 120 cm) através da bainha previamente colocada na artéria carótida esquerda. Avance-o para o ventrículo esquerdo. Conecte o cateter de pressão a um sistema de aquisição para registrar a pressão ventricular esquerda. O sistema de aquisição precisa calcular e registrar a frequência cardíaca, desenvolvida continuamente pressão, dP/dt máxima (contratilidade do ventrículo esquerdo) e dP/dt mínimo (relaxamento do ventrículo esquerdo) durante todo o experimento. Gravar valores basais durante 10 minutos.
- Inserir uma 6F (100 cm, EB3.75) cateter-guia através da bainha previamente colocada na artéria carótida direita. Avançá-lo para a artéria coronária esquerda para chegar à esquerda artéria descendente anterior coronária (LAD), sob orientação de raio-x. Injete o meio de contraste, utilizando uma seringa de 20 mL através do cateter-guia para realizar uma angiografia coronária de linha de base.
Nota: Injeção de meio de contraste foi feita por pressão manual, mas um sistema injector dedicado poderia ser usado também. - Avalie o tamanho do menino no monitor raio-x para selecionar o tamanho apropriado do cateter de intervenção coronária percutânea (PCI). Use balões PCI com um comprimento de 15 a 25 mm e diâmetros entre 2 e 3,5 mm dependendo do tamanho do rapaz. Monte PCI cateter e o fio guia coronário (F. 014/J, 175 cm). Conecte o cateter PCI com o dispositivo de inflação pré-preenchido com meio de contraste.
Nota: O diâmetro do rapaz pode ser medido diretamente em um monitor calibrado, usando uma régua e o tamanho do balão PCI é então selecionado em conformidade. - Inserir o sistema montado de 2.2.4 do lúmen do cateter-guia. Avance o fio-guia para o rapaz até atingir além do segundo ramo diagonal do menino.
- Use sob orientação fluoroscópica para avançar o cateter PCI até chegar no meio do menino. Escolha o site de bloqueio rapaz dependendo da anatomia das coronárias, geralmente após o segundo, às vezes após o primeiro ramo diagonal (Figura 3) para poder ter percentagens semelhantes de RAA do ventrículo esquerdo (LV).
Nota: A escolha do site bloqueio depende do comprimento dos ramos diagonal e, portanto, a área de tecido que é fornecido pelo sangue através do respectivo ramo. No caso de uma longa e bifurcado primeiro ramo diagonal o bloqueio do site será só depois disto. No caso de um primeiro ramo diagonal mais curto, o bloqueio é feito após a segunda diagonal. - Retire o fio-guia e vá aumentando a pressão no dispositivo de insuflação para 7-10 bar para insuflar o balão do cateter PCI e induzir isquemia miocárdica por 1 h. aumentar gradualmente a FiO de2 a 50-60% entre 15 e 40 min de isquemia. Manter o volume corrente em 6-10 mL/kg.
Nota: Este procedimento irá reduzir a ocorrência de extrasystoles e diminuir a frequência de fibrilações ventricular. - Registro de uma sequência de vídeo de s de 5-10 durante a injeção de meio de contraste através do cateter-guia ter um angiograma do balão do cateter PCI no lugar apenas após o início de isquemia; repeti após 10min de isquemia para verificar a completa oclusão do menino distal para o balão do cateter de PCI.
- Monitorar o animal estreitamente para imediatamente detectar e tratar (2.2.10) arritmias cardíacas. Extrasystoles geralmente ocorrem e o aumento da frequência (> 3 / min) entre 20 e 40 min após a indução de isquemia miocárdica. Se isso ocorrer, Massageie suavemente o pescoço de ambos os lados, logo abaixo da bochecha. Na maioria dos casos isso será suficiente para re-estabelecer uma pulsação regular, provavelmente pela estimulação dos barorreceptores nervo vagal localizado na artéria carótida comum.
- Se arritmias cardíacas progridem para fibrilação ventricular, use um desfibrilador bifásico externo, para re-estabelecer um ritmo sinusal. Aplica compressões torácicas de 5-10 usando o desfibrilador imediatamente antes de aplicar o choque, a fim de preencher as coronárias com sangue oxigenado e depois choques com 150 J (para animais de 30 kg).
- Repita a operação se necessário e aumentar a energia para 175 J depois do choque de 3rd . Use configurações de energia mais elevadas para animais mais pesados.
- Cinco minutos antes do fim do tempo isquemia repita a mencionado no 2.1.8-2.1.13 de amostra de sangue. Injetar a substância (ou bicíclicos FXIIa inibidor ou controlar 4 mg/kg, isto fazer isto às cegas) por via intravenosa através do cateter venoso central e flush a linha com soro fisiológico 20 mL.
- Retirar uma amostra de plasma citrato (como mencionado em 2.1.8 e 2.1.9) 4 min após a injeção da substância em 2.2.12.
- Realize uma angiografia (2.2.3) para confirmar a oclusão do rapaz, em seguida, esvazie o balão do cateter PCI e retirar este cateter cateter-guia. Confirmar perfusão do menino distal ao site da oclusão por angiografia imediatamente após deflação e remoção do balão do cateter de PCI, 10 min depois disso, sempre que os sinais de isquemia miocárdica eram visíveis por ECG por mais de 5 min e imediatamente antes de Re-oclusão do menino.
- Permita a reperfusão do miocárdio isquêmico por 2 h. Colher amostras de soro e plasma às 10, 30, 60 e 115 min de reperfusão (2.1.8 e 2.1.9). Monitor BGA em 60 e 115 min (2.1.10).
- Volte a introduzir o cateter PCI juntamente com o fio-guia para exatamente a mesma posição usada para a isquemia. Insuflar o balão do cateter PCI como antes e confirmar a oclusão do rapaz por angiografia (2.2.3). Remover o cateter de pressão do ventrículo esquerdo e parar a gravação.
- Injetar 100 mL 2% azul de Evans em fosfato tampão salino (PBS, pH 7,4) em linha venosa central. Cerca de 30 s depois, quando o animal inteiro fica azul, injetar 40 mL 20% KCl a eutanásia do animal. Morte foi confirmada pela ausência de sinais de ECG e ondas de pulso.
3. técnicas de amostragem
-
Extraindo, dissecando e amostragem do coração (Figura 4)
- Execute uma esternotomia para expor o coração. Siga o protocolo descrito anteriormente por Koudstaal e colegas, as etapas de 8-2 e 8-3,18. Abri o pericárdio ao inspecionar para anormalidades, que talvez decorrem pericardite anterior e excluir o animal de nova avaliação.
- Esvazie e retire a placa PCI, bem como o cateter-guia. Excisar o coração para posterior análise. Cortar a veia cava e remover o sangue usando uma bomba de sucção, em seguida, corte todos os grandes navios conectando o coração com o corpo.
- Enxágue o coração dentro e por fora com temperatura ambiente salino. Pese o coração inteiro.
- Dentro de 30-40 min, corte o coração em fatias de cerca de 3-5 mm do ápice para o dever tendinae da válvula mitral, perpendicular ao eixo longo, usando uma faca afiada.
- Tenha cuidado de sempre colocar o coração na mesma orientação com o lado ventral virada para cima a fim de manter a orientação das amostras cortadas (Figura 5).
- Fotografe as fatias do coração usando uma câmera reflex de lente digital única.
- Corte do ventrículo direito (descarte que não necessário). Fotografar as fatias do ventrículo esquerdo e pesar todas as fatias para o peso total do ventrículo esquerdo.
- Diferencie entre o azul de Evans positivo e azul de Evans tecido negativo em todas as seções. Disse as fatias para separar o isquêmico (Evans Blue negativo) do tecido não-isquêmica (azul de Evans positivo) usando um bisturi.
- Primeiro analise as seções negativas azul de Evans (área isquêmica em risco, AAR). Pesá-los todos e colocá-los todos em um recipiente de plástico.
- Cubra as fatias inteiramente com solução de cloreto de 100-150 mL (de acordo com o tamanho do coração) trifenil tetrazólio (2G TTC, 16G dextrano, peso molecular 48000-90000, em 200 mL de PBS, preparados na hora) para que os pedaços de coração podem mover-se livremente dentro da solução. Cubra o recipiente e incubar durante 20 min a 37 ° C, agitando suavemente.
- Durante esse pesa de tempo de incubação de 20 min o azul de Evans peças positivas (área de risco, ANR), colher amostras para a incorporação de tecido-Tek (escolher a parte mais distal da lesão) e armazenar a-80 ° C para posterior análise. Transferir o resto em solução de formol 4% e armazenar à temperatura ambiente para seções de histologia.
- Retire os pedaços da raa da solução TTC. O tecido manchado vermelho é tecido isquêmico viável (VIT) e o tecido manchado não é tecido necrótico isquêmico (NIT). Corte 2 pedaços pequenos (blocos de 2-3 mm) de tanto o NIT e VIT, incorporá-los em tecido - Tek e armazenar a-80 ° C para posterior análise. Estas amostras devem ter o mesmo peso.
- Corrigi o resto das peças (todas as fatias, derivadas da AAR) fixando-os para baixo em um recipiente de isopor e cobrir completamente com solução de formol 4% por 24 horas à temperatura ambiente em uma coifa. As peças devem ficar planas para a documentação fotográfica na próxima etapa.
- No dia seguinte fotografia de ambos os lados das peças com uma câmera de alta resolução com a mesma configuração de zoom e distância do tecido (mesma ampliação). Adicione barras de escala automática para todas as imagens. Todas as barras precisam ter o mesmo comprimento.
Nota: A câmera de alta resolução deve ser ligada a um software que adiciona automaticamente a barra de escala para cada foto.
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Cálculo da raa e o tamanho do infarto
- % De AAR do ventrículo esquerdo = (peso de AAR em g / peso do ventrículo esquerdo em g) * 100.
- Use o software ImageJ para calcular a área de superfície total de ambos os AAR e NIT (ambos os lados de cada peça) com base nas fotografias.
- Ajuste a barra de escala, selecionando o comprimento da barra de escala usando a linha reta da ferramenta ângulo. Escolha o menu Analyze > definir escala de e insira a distância conhecida e a unidade da barra de escala. Escolha "global" para que a mesma escala será aplicada a todas as imagens.
- Marque a área toda a superfície do tecido usando a ferramenta de seleção de mão livre para calcular AAR. Tenha cuidado para não incluir o lado (altura) do tecido e/ou do tecido adiposo (Figura 6-C).
- Definir a medição escolhendo "área" e "Exibir rótulo" de Analyze > menu definir medições. Medir a área de superfície de Analyze > medida.
- Repita o passo 3.2.5 a medida NIT (marca apenas o tecido não-coradas). Nota: Não inclua o tecido adiposo (Figura 6-D) no cálculo NIT. Repita o passo do outro lado do tecido.
- Calcule a média AAR e NIT para cada pedaço de tecido.
- Use os valores obtidos 3.2.7 para calcular o NIT como uma porcentagem do NIT de RAA AAR:% = (Σ superfície área média de NIT em cm2/ Σ média área de superfície de AAR em cm2) * 100.
- Dois investigadores diferentes devem repetir o método acima. A margem aceitável de diferença é < 10%.
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Marcadores de isquemia
- Usar as amostras de plasma de EDTA, que foram previamente armazenadas a-80 ° C (2.1.9) para medir o nível de troponina cardíaca-usando um ensaio de Luminex-tipo single-plex, como anteriormente descrito 19.
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Representative Results
Um animal morreu prematuramente antes da administração de FXIIa peptídeo inibidor ou controle devido a um erro técnico (queda súbita da pressão arterial durante o tempo de isquemia, antes da adição da substância em estudo). Um animal foi excluído do grupo de inibidor FXIIa porque nenhuma lesão de isquemia/reperfusão foi observada devido a anatomia anormal da artéria descendente anterior esquerda (LAD). Uma grande parte do ventrículo esquerdo, incluindo o ápice, foi perfundida pela artéria circunflexa neste animal. Os animais incluídos na análise final foram n = 2 no grupo bicíclico FXIIa peptídeo inibidor (peso de 27,5 ± 2,5 kg) e n = 3, recebendo um peptídeo inativo controle bicíclicos (peso de 29 ± 0,8 kg).
A imagem de raio-x / angiografia coronária do coração porco é usada para visualizar a posição do cateter de pressão e decidir onde bloquear o rapaz (Figura 3A). Figura 3B mostra a posição do cateter, bloqueando o fluxo sanguíneo distal para o segundo ramo diagonal. Comparação da Figura 3A e 3B também permite uma estimativa de que parte do miocárdio fornecido pelo rapaz será isquêmica. No final do período de reperfusão de h 2 o cateter PCI é reintroduzido e inflado na mesma posição, como foi durante a isquemia. Azul de Evans é então injetado por via intravenosa para determinar com precisão o AAR (Figura 5A). Após a excisão do coração, o ventrículo esquerdo é cortado em seções grossas de 3-5mm do ápice até a válvula mitral, perpendicular ao eixo longo. AAR e ANR são claramente demarcados por Evans Blue coloração sobre as fatias. Áreas de amostragem AAR e ANR são mostradas na Figura 5B.
O AAR, expressado em percentagem do ve, mostra que não há diferenças estatisticamente significativas entre o grupo FXIIa Tratado e o grupo controle (figura 6A). O tamanho do infarto (NIT/AAR) mostra que não há diferenças entre os grupos também (usando não-paramétrico Mann-Whitney test, p > 0,05, Figura 6B). Estes dados sugerem que FXIIa inibidor sozinha, na concentração usada e duração da aplicação, não pode proteger o coração de miocárdica eu / lesão R. Figura 6 e 6 D mostra como marcar as fronteiras AAR e NIT para precisão e reproducibly medir as respectivas áreas de superfície.
A estratégia de amostragem de sangue permite a liberação de troponina cardíaca de marcador de dano do músculo cardíaco-eu a serem monitorados ao longo do tempo. Não há quase nenhuma diferença depois de uma hora de isquemia com a linha de base, enquanto após reperfusão lá é um aumento contínuo ao longo do tempo como mostrado na Figura 7. Para troponina-eu, inter-grupal diferenças também não foram significativas nestas experiências.
Figura 1 . Visão geral do cronograma experimental. Cronograma esquemática para as etapas importantes no modelo de lesão de isquemia/reperfusão miocárdica. Coronariana-visualização da linha de base, começando a tempo da isquemia, arritmias cardíacas de monitoramento e injetando a substância são passos importantes no experimento. O uso de temporização exata em todos os experimentos assegura a reprodutibilidade. Eutanásia do animal e excisão do coração deve ser feito dentro de 15-20 min após a conclusão da fase 2h de reperfusão. KCl: cloreto de potássio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Cronograma de colheita de sangue e análise. Pontos de tempo para amostragem de sangue são indicados em conjunto com o tipo de anticoagulante utilizado. Amostras adicionais podem ser tomadas de acordo com a experiência e os analitos a ser medido. ACT: ativado tempo, BGA de coagulação: análise de gás, RT de sangue: temperatura ambiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Angiografia coronária. Visualização fluoroscópica de (A) as coronárias esquerdas na linha de base, as setas amarelas apontam para a primeira e os segunda diagonais ramos, a seta branca aponta para o ápice do coração (B) o rapaz obscurecido não mostrando a nenhuma área do fluxo do ventrículo esquerdo (LV), a seta vermelha aponta para o PC Eu cateter (C) re-encerramento do menino no final da reperfusão com o balão do cateter PCI re-inserido para o mesmo site o rapaz como durante a isquemia. CX: coronária circunflexa, rapaz: deixou a artéria coronária descendente anterior, MC: cateter Millar, inserido no ventrículo esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Gráfico esquemático da amostragem de tecido. Momento exato de dissecação de coração e amostragem das diferentes áreas para posterior análise. O cronograma começa em 205 min após o início da isquemia, 20 min após o término do experimento animal. É importante incubar as seções de tecido no TTC, num prazo máximo de 40 min após a eutanásia do animal. Amostragem da ANR, VIT e NIT é indicada como quadrados brancos. Incubar a AAR em formol 4% permite uma distinção clara entre NIT e VIT para determinação precisa do tamanho do infarto. AAR: área de risco, ANR: área de risco, LV: ventrículo esquerdo, NIT: tecido necrótico isquêmico, OTC: tecido-Tek, RV: ventrículo direito, TTC: cloreto de trifenil tetrazólio, VIT: tecido isquêmico viável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . In situ diferenciação entre a área de risco (AAR) e área de risco ANR. (A) imagem representativa de todo coração logo após esternotomia ao final do experimento. (B) representante imagens mostrando o 3-5 mm fatias grossas do ventrículo esquerdo após a dissecação. AAR e ANR estão claramente definidos, indicado por setas amarelas, e a seta branca mostra a área de amostragem do ANR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Tamanho de isquemia e infarto. (A) a percentagem, em peso de RAA do ventrículo esquerdo (LV). (B) a área de superfície de percentagem do NIT do RAA. (C) uma fotografia representativa do cálculo AAR. (D) uma imagem representativa do cálculo NIT. A seta branca mostra a área de amostragem de VIT e a seta preta mostra a área de amostragem de NIT. Dados foram calculados utilizando software ImageJ. Os valores são mostrados como pontos para cada indivíduo experimentarem com indicação da média ±± grupo de SD. controle, n = 3 e grupo de inibidor Tratado FXIIa, n = 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 . Marcador de dano do músculo cardíaco. Troponina cardíaca-eu concentração ao longo do tempo em pg/ml, do controle e inibidor FXIIa tratados de grupo. Sangue foi coletado da veia jugular em tubos de plasma EDTA na linha de base, final de isquemia e vários pontos de tempo durante a reperfusão e cardíaca troponina-eu era medido pela matriz de suspensão single-plex (Bio-Plex). Dados são mostrados como pontos para cada indivíduo experimentarem com indicação da média ±± grupo de SD. controle, n = 3 e grupo FXIIa Tratado, n = 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Miocárdica eu / lesão R tem um efeito significativo no tamanho final de infarto que é traduzido diretamente para o prognóstico do paciente após infarto agudo do miocárdio3. Entendimento da fisiopatologia do miocárdio eu / lesão de R é o primeiro passo para reduzir ou evitar isso. Miocárdica eu / lesão R é uma condição aguda que ocorre diretamente após a reperfusão dos vasos obscurecidos. Eu / lesão R leva à ativação da resposta imune inata e dano celular ocorre no local da reperfusão e os tecidos circundantes20. Um estudo recente mostrou uma melhoria no resultado neurológico em um modelo do rato do cérebro eu / lesão R quando tratados com inibidor de FXIIa8. No entanto, no estudo piloto atual não encontramos nenhum efeito do inibidor FXIIa bicíclico na miocárdica eu / lesão R. O inibidor de FXIIa usado é romance e sua farmacocinética em porcos ainda não são conhecidos. Portanto, a observado falta de efeito pode ser causada por dosagem inadequada ou aplicativo. Isto precisa ser abordada em estudos de seguimento.
A padronização de um modelo animal é essencial para investigar em profundidade a fisiopatologia do miocárdio eu / lesão R e trazer soluções adequadas para clínicas. Investigando a fisiopatologia do miocárdio eu / lesão R requer amostragem representativa e bom a fim de estudar os mecanismos celulares subjacentes a ele. O peito fechado porcino miocárdico eu / modelo de lesão R fornece um método reprodutível, que é perto da situação clínica e útil para ajudar a compreender os mecanismos celulares e teste romance novas terapias. Variantes do presente modelo têm sido descritas antes, para os acima mencionados fins14,17,18.
Nosso protocolo de infarto agudo do miocárdio em porcos não precisa de pré-tratamento com amiodarona como descrito anteriormente,18,21. Usamos a massagem do seio carotídeo para reduzir arritmias cardíacas e um desfibrilador bifásico para cardioconversion em caso de fibrilação ventricular. O uso da massagem do seio carotídeo é clinicamente conhecido por influenciar a fibrilação atrial22, mas até agora ele não mostrou para prevenir ou retardar o aparecimento de fibrilação ventricular em MI, em seres humanos ou em modelos de porco. Além disso, o uso do sevoflurano ajuda a reduzir arritmias ventriculares, bem como a taxa de mortalidade no modelo suíno de infarto agudo do miocárdio23.
Para assegurar a reprodutibilidade e reduzir o risco de trombose durante o experimento, várias doses de heparina foram injetados com base na medição repetida da lei, ao invés de usar fixo doses de heparina, conforme descrito por exemplo pelo Koudstaal et al.18. Uma quantidade controlada de administração de heparina ajuda a investigar a cascata de coagulação, no contexto da eu / lesão R. Evans Blue permite a determinação precisa da AAR/LV. A injeção intravenosa do Evans Blue depois de re-oclusão do menino no exato local durante a indução de isquemia sob orientação fluoroscópica leva a coloração azul do porco inteiro incluindo a parte não-isquêmica do coração com efeito mínimo sobre o ANR miocárdio e vasculatura. Azul de Evans é uma substância citotóxica conhecida24. Nos experimentos atuais foi crucial para manter a viabilidade da camada de células endoteliais na ANR na vasculatura coração para utilizar-o como um indivíduo intra controlar então 100ml azul de Evans foi injetado sistemicamente e dilui-se com a redução do sangue inteiro seu toxicidade. Anteriormente, em um cenário semelhante, 50 ml 2% de que azul de Evans foi injetado diretamente as coronárias, aumentando o risco de sua citotoxicidade para cardíaca células25. O próximo passo importante foi a dissecar o coração diretamente em fatias de 3 a 5 mm do ápice até a válvula mitral (a posição exata de cada animal) e usando esse método para fazer um cálculo exato de RAA como uma porcentagem do ventrículo esquerdo.
A descrição atual do método fornece detalhes mais finos que não tenham sido descritos anteriormente. TTC manchado seção em formol 4% por 24 horas de incubação fornece uma clara distinção entre viável (vermelho) e o tecido necrosado (branco), que finalmente aumenta a reprodutibilidade da amostragem para coloração mais molecular. A estratégia de amostragem de sangue mais de 2h de reperfusão permite a detecção de moléculas recém expressas em estágios muito iniciais (10 e 30 min) de reperfusão, bem como a posterior (60 e 120 min). O sangue correta e amostragem de tecido e armazenamento também são cruciais para a análise de marcadores de cascata plasma tais como a expressão de proteínas do complemento e da coagulação.
O protocolo atual pode ser modificado para ter um tempo de reperfusão, de algumas horas a dias. Isso permite que o investigador investigar as consequências mais tarde eu / lesão R sobre o coração e também permite que o teste de novos medicamentos e avaliação dos seus efeitos. A limitação do protocolo atual é o uso de um cateter de pressão-dica para a medição da função cardíaca. Dados mais fiáveis sobre a função cardíaca podem ser obtidos pelo uso de um sistema de medição de ciclo de pressão-volume. Em resumo, o método atual fornece detalhadas etapas importantes necessárias para aumentar a reprodutibilidade do peito fechado porcina miocárdica eu / modelo de lesão de R quando a utilização do modelo é estudar as alterações celulares e moleculares no contexto da estudo do miocárdio eu / fisiopatologia de lesão R ou estudando novas opções terapêuticas.
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Disclosures
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores desejam reconhecer o Professor Christian Heinis para fornecer o inibidor FXIIa e o respectivo controle. Reconhecemos também com gratidão Olgica Beslac, Dr. Daniel Mettler e Kay Nettelbeck da unidade de Cirurgia Experimental, departamento de pesquisas biomédicas, Universidade de Berna, para suporte técnico. Celine Guillod e Matthias Rausch do departamento para diagnóstico, intervencional e radiologia pediátrica, Hospital Universitário de Berna, Inselspital fornecido com o equipamento de raios-x e técnicas. Este projecto foi financiado pela Swiss National Science Foundation, projeto n. º 320030_156193. Também gostaríamos de agradecer o Sr. Reto Haenni de comunicação e marketing, Hospital Universitário de Berna, Inselspital para nossa experiência de gravação de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 90 Flex, blood gas analyser | Radiometer | - | Blood gas analysis (BGA) |
| ACT Plus | Medtronic | - | Activated clotting time |
| Atropin | Sintetica | - | Atropinum Sulfas, 0,5mg/ml |
| Balance (20-500 Kg) | NAGATA Scale, Tiwan | HTB/HTR | Alternative products can be used |
| Balance (21-4200 g) | Mettler toledo, Switzerland | MS4002SDR | Alternative products can be used |
| Blood collection tubes: EDTA, citrate and serum | S-Monovette, Nuembrecht, Germany | 05.1167.001, 05.1071.001 and 05.1557.001 respectively |
Alternative products can be used |
| BV Pulsera mobile C-arm | Philips | - | Alternative products can be used |
| Centrifuge | Labcare, UK | ALC PK120R | Alternative products can be used |
| Defibrillator Lifepak 12 | Medtronic | - | Alternative products can be used |
| Dextran from Leuconostoc mesenteroides | Sigma-Aldrich, Germany | D3759 | Average M.wt 48000-90000 |
| Digital single lens reflex camera | Sony, Thailand | DSLR-A500/A550 | Alternative products can be used |
| Dissecting forceps | Alternative products can be used | ||
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15300S | Diameter 3 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| EMPIRA RX PCI dilatation catheter | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 85R15350S | Diameter 3.5 mm, length 15 mm, Alternative products can be used |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich, Germany | E2129 | Toxic |
| Fabius GS premium respirator | Dräger, Lübeck, Germany | - | Anesthesia work station, Alternative products can be used |
| Fentanyl | Inselspital ISPI | - | Fentanyl 2500mcg/50ml |
| Formaldehyde | Pathology Institute, Bern University | SI148701 | Alternative products can be used |
| FXIIa inhibitor | Provided by Prof. Christian Heinis' laboratory in EPFL | Novel bicyclic peptide | |
| Galeo, coronary guidewire | Biotronik, Germany | 125497 | Alternative products can be used |
| Guidance catheter | Boston Scientific, Florida, USA | 34356-06 | 6F (100 cm, EB3.75). Alternative products can be used |
| Heparin Sodium | Drossapharm, Basel, Switzerland | - | Liquemin, 25000 U.I./5 ml |
| High end electrosurgery | BOWA, Germany | ARC 400 | Electrical source for blood suction. Alternative products can be used |
| Hydro-Guardmini breathing filter | Intersurgical, Lithuania | 1745000 | Filters |
| Image J | National Institute of Health, USA | 1.47v | Alternative products can be used |
| Inflation device, Atrion QL2530 | Atrion medical product, Alabama, USA | 96402 | Alternative products can be used |
| IntelliVue MP 70 | Philips, Boeblingen, Germany | - | Monitor (ECG, heart rate, blood presure and body temperature). Alternative products can be used |
| KCl | Sintetica SA | - | Potassium chloride 15% |
| Ketamine | Vetoquinol | - | Narketan, 1ml/100mg |
| LR-ACT | Medtronic | 402-01 | ACT special syringes |
| Midazolam | Roche | - | Dormicum, 5mg/ml |
| Monopolar scalpel | Alternative products can be used | ||
| Needle holder | Alternative products can be used | ||
| High resolution camera, PathStand Macro Imaging Stand for Grossing | Spotimaging, USA | 1080 p HD resolution. Alternative products can be used | |
| PBS | In-house preparation | - | Alternative products can be used |
| Peripheral venous cannula, 18 G | Alternative products can be used | ||
| PowerLab 4/35 data acquisition system | Adinstruments, Spechbach, Germany | - | |
| Rotamax120T | Heidolph, Germany | 544-41200-00 | Shaker. Alternative can be used |
| Rüschelit-Super Safety Clear Tube | Teleflex, Dublin, Irland | 112480 | Air way tubing, Alternative products can be used |
| Safe Pico Aspirator Syringes | Radiometer | 956-622 | BGA special syringes |
| Saline | Sintetica Bioren | - | NaCl 0,9%. Alternative products can be used |
| Sevorane 1.5% | AbbVie AG | - | Sevorane 250ml 100% |
| Sheath | Cordis, Johnson&Johnson, USA | 504-607 A | AVANTI + / 7 F, Alternative products can be used |
| Space infusion pump | B.Braun Medical AG, Germany | - | For infusion of fentanyl. Alternative products can be used |
| SPR-350 (Millar catheter) | Adinstruments, Texas, USA | 840-8166 | MIKRO-TIP, 5F, 120 cm |
| Sternotomy saw | Alternative products can be used | ||
| Sutures | ETHICON, Johnson&Johnson, USA | Y3110H | Monocryl 3-0 SH-1 Plus. Alternative products can be used |
| Syringes (20, 10 and 5 mL) | CODAN,Baar, Switzerland | 62.7602, 62.6616, 62.5607 respectively |
Used to inject anesthetic materials intramuscularly or directly into the central venous line. Also to inject heparin or FXIIa or the respective control. Alternative products can be used |
| Thorax spreader | Alternative products can be used | ||
| Tissue-tek | SAKURA, Netherlands | 4583 | O.C.T. compound |
| Vascular forceps | Alternative products can be used | ||
| Xenetix 300 contrast media | Guerbet, Zürich, Switzerland | - | Lobitridol, 300 mg iodide/ml |
| Xylazine | Vetoquinol | - | Xylapan, 20mg/1 mL |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium choride | Sigma-Aldrich, Austria | T8877 | |
| 500 μL tubes (eppendorf) | Trefflab, Switzerland | 96.08185.9.03 | Alternative products can be used |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update. Circulation. 133, e338-e360 (2016).
- Miller, T. D., et al. Infarct size after acute myocardial infarction measured by quantitative tomographic 99mTc sestamibi imaging predicts subsequent mortality. Circulation. 92, 334-341 (1995).
- Ovize, M., et al. Postconditioning and protection from reperfusion injury: where do we stand? Position Paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 87, 406-423 (2010).
- Neri, M., Riezzo, I., Pascale, N., Pomara, C., Turillazzi, E. Ischemia/Reperfusion Injury following Acute Myocardial Infarction: A Critical Issue for Clinicians and Forensic Pathologists. Mediators Inflamm. 2017, 1-14 (2017).
- Yang, Q., He, G. -W., Underwood, M. J., Yu, C. -M. Cellular and molecular mechanisms of endothelial ischemia/reperfusion injury: perspectives and implications for postischemic myocardial protection. Am J Transl Res. 8, 765-777 (2016).
- Massberg, S., et al. Platelet-Endothelial Cell Interactions During Ischemia/Reperfusion: The Role of P-Selectin. Blood. 92, 507-515 (1998).
- Wang, J., et al. Antithrombin is protective against myocardial ischemia and reperfusion injury. J Thromb and Haemost. 11, 1020-1028 (2013).
- Hopp, S., et al. Targeting coagulation factor XII as a novel therapeutic option in brain trauma. Ann Neurol. 79, 970-982 (2016).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Heusch, G., Skyschally, A., Schulz, R. The in-situ pig heart with regional ischemia/reperfusion - ready for translation. J Mol Cell Cardiol. 50, 951-963 (2011).
- Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery? Circulation. , 2085-2087 (2014).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacol Ther. 141, 235-249 (2014).
- Bloor, C. M., White, F. C. Functional development of the coronary collateral circulation during coronary artery occlusion in the conscious dog. Am J Pathol. 67, 483-500 (1972).
- Banz, Y. Locally targeted cytoprotection with dextran sulfate attenuates experimental porcine myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 26, 2334-2343 (2005).
- Krombach, G. A., Kinzel, S., Mahnken, A. H., Günther, R. W., Buecker, A. Minimally Invasive Close-Chest Method for Creating Reperfused or Occlusive Myocardial Infarction in Swine. Invest Radiol. 40, 14 (2005).
- Suzuki, Y., Lyons, J. K., Yeung, A. C., Ikeno, F. In vivo porcine model of reperfused myocardial infarction: in situ double staining to measure precise infarct area/area at risk. Catheter Cardiovasc Interv. 71, 100-107 (2008).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nat Protoc. 7, 1479-1496 (2012).
- Koudstaal, S., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. J Vis Exp. , e51269 (2014).
- Kamat, P., et al. Dexrazoxane Shows No Protective Effect in the Acute Phase of Reperfusion during Myocardial Infarction in Pigs. PLoS One. 11, e0168541 (2016).
- Carden, D. L., Granger, D. N. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury. J Pathol. 190, 255-266 (2000).
- Pérez de Prado, A., et al. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Lown, B., Levine, S. A. The carotid sinus. Clinical value of its stimulation. Circulation. 23, 766-789 (1961).
- Regueiro-Purriños, M., et al. Ventricular Arrhythmias and Mortality Associated with Isoflurane and Sevoflurane in a Porcine Model of Myocardial Infarction. J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2011).
- Roberts, L. N. Evans blue toxicity. Can Med Assoc J. 71, 489-491 (1954).
- Ellenbroek, G. H. J. M., et al. Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction. J Vis Exp. , e54021 (2016).
