Summary
Vi beskriver en i vivo murine model af perineural invasion ved at indsprøjte syngeneic bugspytkirtelkræftceller i iskiasnerven. Modellen giver mulighed for kvantificering af omfanget af nerve invasion, og understøtter undersøgelse af de cellulære og molekylære mekanismer af perineural invasion.
Abstract
Kræftceller invadere nerverne gennem en proces, der kaldes perineural invasion (PNI), i hvilke kræft celler formere sig og vandrer i nerve mikromiljø. Denne form for invasion er udstillet ved en række kræft typer og meget ofte er fundet i bugspytkirtelkræft. Den mikroskopiske størrelse af nervefibre i mus bugspytkirtlen gør studiet af PNI vanskeligt i orthotopic murine modeller. Her, beskriver vi en heterotopisk i vivo model af PNI, hvor vi indsprøjte syngeneic pancreas cancer cellelinie Panc02-H7 i murine iskiasnerven. I denne model, er ischiadicus nerver af bedøvede mus udsat og injiceres med kræftceller. Kræftcellerne invadere i nerver proksimalt mod rygmarven fra punktet, injektion. Invaderede ischiadicus nerver er derefter udvundet og forarbejdet med OCT for frosne skæring. H & E og immunofluorescens farvning af disse sektioner giver mulighed for kvantificering af både graden af invasion og ændringer i protein udtryk. Denne model kan anvendes til en lang række undersøgelser af PNI givet sin alsidighed. Ved hjælp af mus med forskellige genetiske modifikationer og/eller forskellige typer af kræftceller giver mulighed for undersøgelse af de cellulære og molekylære mekanismer af PNI og forskellige kræft typer. Virkningerne af terapeutiske agenter på nerve invasion kan endvidere studeres ved at anvende behandling til disse mus.
Introduction
Nerver danne en bestemt tumor mikromiljø, der stimulerer kræft vækst og migration1,2,3. Perineural invasion (PNI) er den proces, gennem hvilken kræft celler invadere i og omkring nerverne. Det kan betragtes som en unik rute af metastaser da kræft invasion strækker sig fra steder, hvor oprindelse langs nerverne. PNI er fundet i flere kræft typer herunder i bugspytkirtlen, prostata, hoved & hals, spyt, livmoderhalskræft, og tyktarms-og endetarmskræft med en incidens spænder fra 22% til 100%1,2. PNI er forbundet med smerte og korrelerer med dårlig prognose og værre overlevelse satser1,2.
Udvikling af modeller af perineural invasion er vigtigt at belyse de cellulære og molekylære mekanismer af denne proces, og at teste kandidat terapeutiske agenter for at formindske PNI. In vitro metoder til at studere samspillet mellem kræft og nerver omfatter kræftceller med nerve explants4, dorsalrods ganglier5,6,7, eller med specifikke celler fælles kultur fra nerve celler mikromiljø såsom Schwann7. In vivo tilgange, er imidlertid mere fysiologisk relevante, omfatter anvendelse af kræft musemodeller som kræft er blevet induceret eller transplanteret og har fordel af regnskab for hele nerve mikromiljø. I orthotopic modeller af pancreas eller prostata cancer, PNI har været rapporteret8,9,10 og forekomsten af PNI kan registreres, men på grund af den lille størrelse af nerverne i disse organer, er det svært at se den hele nerve og dermed at opgøre omfanget af PNI. Den model vi beskrive her er en i vivo model af PNI i hvilke kræft celler injiceres i iskiasnerven af mus gennem en enkel kirurgisk procedure11. Heterotopisk transplantation invaderer inden for nerve mod rygmarven. Længden af nerve invasionen fra webstedet af injektion på rygmarven kan måles, og omfanget af kræft i nerve. Vigtigere, kan invaderede nerven også indsamles for en bred vifte af assays herunder mikroskopisk, og molekylære analyser. En bred vifte af kræftceller kan afprøves, og værten mus, der er blevet genetisk modificeret eller behandlet med særlige forbindelser kan bruges som godt. Denne kraftfulde assay giver mulighed for kræftceller og vært mikromiljø ændres til undersøgelse af mekanismerne af PNI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer med animalsk emner blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på Memorial Sloan Kettering Cancer Center.
1. forberedelse af kræftceller
- Høst sub sammenflydende Panc02-H7 celler med 0,25% trypsin i 5 min ved 37 ° C. Indsamle cellerne i en 15 mL centrifugeglas.
Bemærk: Cellerne dyrkes i T-225 kolbe, som indeholder omkring 12 x 106 celler pr. kolbe på 80% confluency og 4 mL trypsin / kolbe bruges. - Der centrifugeres celler på x 900 g ved 4° C i 5 min. Skyl celler ved resuspending i cellen pellet i 1 mL PBS (af pipettering op og ned to gange), og overføre suspension til en 1,5 mL microcentrifuge tube på is.
- Centrifugeres celler igen på x 900 g ved 4° C i 5 min, og supernatanten uden at forstyrre pelleten. Holde isen pelleted cellerne indtil injektion.
2. forberedelse af mus og kirurgi
Bemærk: 8 uger gamle, mandlige og kvindelige C57BL/6J mus er anvendt i denne undersøgelse. Kirurgi betingelser følger IACUC regler i vores institution. Instrumenter er steriliseret, kirurgisk arbejde overfladen desinficeres, dyret er desinficeret og kirurgen bærer sterile handsker.
- Dagen før operationen, bedøver musen ved hjælp af 2% isofluran og derefter fjerne pels langs længden af lårbenet på den dorsale side med enten en tynd razor eller en kemiske hår fjernelse agent.
- På dagen for operationen, bedøver musene bruger 2% isofluorane i en induktion kammer. Bekræft anesthetization ved en tå knivspids stimulus og manglende svar.
- Anvende vet salve på øjnene at forhindre tørhed under anæstesi.
- Opstille den bedøvede mus på sin ventrale side, og forsigtigt sikre hver lemmer med allergivenlige tape for at skabe mild spænding i lemmer skal injiceres. Anæstesi vedligeholdes ved hjælp af isofluran leveret via en præcision vaporizer og næsen kegle.
- Rense injektionsstedet med Betadine, derefter igen med 70% alkohol. Gentag processen to gange mere. At sikre at ingen løse hår forbliver på det kirurgiske område.
- Lave et 1 cm snit med en lille saks ca 2 mm nedenfor og parallelt med lårbenet. Trække huden med pincet lateralt til at eksponere muskler nedenunder.
- Iskiasnerven løber dybt til gluteus maximus og biceps femoris muskler. Adskille disse to muskler langs en fascial flyet med en lille saks og udsætte ischiadicusnerven nedenunder. Gratis nerve fra de omkringliggende muskler ved hjælp af stump dissektion.
- Trække 3 μL af kræftceller (ca. 50.000 celler) fra toerstoffet i en 10 μL sprøjte.
Bemærk: Tegne alternativt 3 μL af PBS som en kontrol. - Placer en lille metal spatel nedenunder nerve ved injektion for støtte. Under visualisering med et dissekere mikroskop, indsætte nålen i nerve mod den metal base, holder nålen som parallel til nerven som muligt ved indsættelse. Pas på ikke at punktere gennem bagsiden af nerven. Minimere håndtering af nerve så meget som muligt i hele denne proces.
- Langsomt tilføre nerve over 5 s. En dannelse af en pære i området injektion angiver en god injektion. Så lad nålen i stedet for 3 s før du fjerner nål forsigtigt. At holde nålen i stedet for 3 s minimerer tilbagestrømning af celler ud af nerven.
Bemærk: Injektion kan udføres mod den distale nerve eller rygmarven. Det er vigtigt at forblive konsistente inden for en række eksperimenter. Hvis cellerne spill udenfor, skal dyret ikke medtages i analysen af eksperimentet. Med erfaring er disse begivenheder meget sjældne. - Returnere nerven til sin oprindelige position. Dække nerve med de overliggende muskler. Behandling af musene med ordentlig analgesi, og derefter lukke huden med 5-0 Nylon sutur.
- Placer musen alene i et rent bur til observation under opsving, indtil det fuldt vågner fra anæstesi.
Bemærk: Det tager 5-15 min for dyret at genvinde fuld bevidsthed. Dyret er ikke efterlades uden opsyn, indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Dyret er ikke returneres til virksomheden af andre dyr indtil fuldt tilbagebetalt. Derefter evaluere opsving mindst én gang hver 24 h i 72 timer.
3. iskiasnerven udvinding
- På postop dag #7, aflive mus med CO2. Placer musen på den ventrale side og stabilisere de distale lemmer ved hjælp af stifter.
- Fjern skindet på den dorsale side af den injicerede lemmer og torso.
- Bruger stump dissektion, udsætte iskiasnerven dybt til musklerne.
- Nerve kurser mellem ilium og korsbenet. For at få adgang til nerven på regionen rygmarven, adskille de to knogler. Først indsætte lukkede saks i det smalle område hvor ischiadicusnerven er placeret, og Åbn derefter saksen mens du holder musen. Være delikat og bevare integriteten af iskiasnerven under dissektion.
- Omhyggeligt dissekere iskiasnerven distalt til udgangen af lårbenet, og proksimalt på rygmarven.
- Bemærk: Invaderede nerver er ekstremt skrøbelig og tilbøjelige til at bryde under spænding eller insisterende håndtering.
- Høste nerven ved første skære dets distale ende. Løft forsigtigt nerven samtidig frigøre det fra tilstødende væv. Skær nerven i den proksimale ende, så tæt som muligt til sit exit fra rygsøjlen.
- Post så grov længde af invasion ved hjælp af en Vernier caliper. Denne makroskopisk skøn er kun vejledende.
4. nerve forarbejdning og kvantificering
- Integrere dissekeret nerven i OLT sammensatte. Sørg for at placere nerver på langs og så flad i bunden af formen som muligt.
- Angive på kassetten den proksimale og distale side af nerven ved maerkning af bogstavet P og D.
- Placer integrerede nerver på toppen af tøris, hvis de ikke er sektionerede straks. Prøven kunne bevares ved-80 ° C i flere uger.
- Afsnit prøver ved hjælp af en kryostaten mikrotom på 5 μm tykkelse og sted sektioner på glas dias. Hvis det er muligt, passe 2 nerve sektioner pr. slide. Angive proksimale side af nerve.
- Pletten dias ved hjælp af H & E farvning12.
- Scanne digitalt farves nerve sektioner med en dias-scanner, der giver høj opløsning digitale data.
- Ved hjælp af software til billedbehandling, kvantificere længden af invasion ved at klikke på knappen foranstaltning afstand, område med invasion, eller andre ønskede parametre. For et godt skøn over længden af invasionen, bruge flere sektioner (2 til 4) af samme nerve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne metode beskrives kirurgisk implantation af kræft i bugspytkirtlen celler i murine iskiasnerven at oprette en i vivo model af kvantificerbare nerve invasion. Figur 1 illustrerer den anatomiske placering af iskiasnerven og injektionsstedet. Figur 2 viser to ischiadicus nerver af en nøgen mus. PBS injiceres nerve (til venstre) kan sammenlignes med en nerve sprøjtes med MiaPaCa-2 kræftceller (til højre). Nerven injiceres med kræftceller er infiltreret af tumor, og vises både tykkere og mørkere end den nerve injiceres med PBS.
Figur 3 viser de målbare forskelle af iskiasnerven invasion af bugspytkirtelkræft celle Panc02H7 vildtype og NCAM KO mus. NCAM KO mus er mus hvor vedhæftning molekyle neurale-celle vedhæftning molekyle 1 er mangelfuld13. Længde og areal af invasion har opgjort ved hjælp af software til billedbehandling. Invasionen blev fundet signifikant reduceret i NCAM KO mus7.
Figur 1 : Musen iskiasnerven og injektionsstedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : To dissekeret ischiadicus nerver musen. En PBS injiceres nerve (venstre) og en nerve sprøjtes med MiaPaCa-2 kræft celler (til højre) er vist. Sorte pile viser injektionsstedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : H & E langsgående sektioner af ischiadicus nerver injiceres med Panc02H7 kræftceller i vildtype og NCAM KO mus. Hvide pile angiver stedet for injektion og proksimale side af rygmarven. De sorte pile angiver længden af invasion med tilsvarende værdier (mm). Skalalinjen: 5 mm (top billeder) og 0,2 mm (nederste billeder). Kvantificering af nerve invasion, målt i længde og areal af invasionen. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), ** P < 0,005, *** P < 0.0005 ved hjælp af t-test. (Resultater fra Deborde mfl., 20167). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol beskriver vi en i vivo murine model af perineural invasion, der giver mulighed for kvantificering af iskiasnerven invasion af kræft i bugspytkirtlen celler. Denne model giver mulighed for undersøgelse af molekylære mekanismer af nerve invasion. Vellykkede eksperimenter ved hjælp af denne teknik kræver en forsigtig tilgang til tre kritiske trin i processen: 1) indsprøjtningen af kræftceller (trin 2.7, 2.8), 2) udvinding af invaderede nerver (trin 3,4), og 3) behandling af høstede nerver (trin 4.1).
Injektionen bør ske med stor forsigtighed for at undgå punktering gennem bagvæggen af den nerve, der fører til et tab af kræftceller. Når nålen er på plads, injektionen bør ske i en langsom og støt tempo over 5 s for at forhindre den hydrauliske kraft fra fremdriver kræft celler for langt frem fra punktet, injektion. Lad nålen i nerve efter injektion til en yderligere 3 s vil minimere tilbage flow og kræft celle lækage. Under iskiasnerven udvinding, skal dissektion være meget blid som invaderede iskiasnerven er meget skrøbelige. Kræft invasion forstyrrer den normale cellulære organisation af iskiasnerven. Selvom invaderede nerver vises tykkere i diameter i forhold til ikke-indsprøjtning eller ikke invaderet nerver, de er mere tilbøjelige til at bryde med endnu mindre strække og manipulation. Under indlejring af skåret nerve i OLT til forarbejdning, er det meget vigtigt at sikre, at nerven er lagt helt fladt på formen. Dette trin giver mulighed for skæring af prøven til at fange hele længden af nerven for ordentlig analyse. Solid tumor på en nerve der ofte skal være trimmet for at forhindre den nerve segment proksimalt for tumor fra at hæve nerve ned i bunden af formen. Hele længden af nerven skal lægges helt fladt mod formen.
Mange ændringer kan overvejes, mens ved hjælp af denne protokol. Når en lille metal spatel ikke findes placeres under iskiasnerven, kan overfladen af et par af bred pincet bruges i stedet. En pincet kan bruges til at holde nålen på plads efter indføring, selv om ulemperne ved denne fremgangsmåde er en formindsket visning af injektion og potentiale til at knuse nerven, hvis der bruges overdreven kraft. En anden måde er at bruge en god pincet til at løfte den nerve, derefter åbne pincet til at strække nerver. Denne metode er nemmere at udføre og giver både spændinger og stabilisering under injektion, men kan skade nerven med overdreven strækning af nerven. Injektionen kan gøres i enten en proksimale eller distale retning, men vi har konstateret, at i begge tilfælde, retning af kræft invasion er typisk mod rygmarven. Derfor foretrækker vi indsprøjte distalt for at minimere yderligere hydraulisk kraft, der kan skubbe kræftceller mod rygmarven, og forvirre senere foranstaltninger af længden af invasionen. Vi anbefaler, at det er vigtigt at være konsekvente i valg af retning af injektion inden for en række eksperimenter.
Selv om vi præsentere en model af syngeneic podning, kan en lignende teknik bruges til xenografts menneskelige kræftceller til immundefekte mus, med kun små variationer. Xenografts i nøgen mus kan kræves længere perioder af kræft invasion at give lignende længder af nerve invasion i syngeneic modeller. Forskellige kræft cellelinjer kan også bruges. PNI er ikke kun udbredt i kræft i bugspytkirtlen, men også af hoved og hals, prostata og hudkræft. Vores lab har med held injiceres nøgen mus i iskiasnerven med menneskelige pancreas cancer cellelinjer MiaPaCa-2 og Panc17,14,15.
Mulige utilsigtede hændelser omfatter sår opspringning, som musene lejlighedsvis tygge deres sting, der resulterer i åbning af såret. Såret ville i så fald skal være re syet. Vi kontrollere såret dagligt i de første 3 postoperative dage. Mus kan også gå med en lille halte efter operationen, sandsynligvis på grund af smerter fra både kirurgisk procedure samt invasion af deres iskiasnerven med kræft. Dette er normalt ikke alvorlige nok til at kræve smertestillende medicin.
Denne model har sine begrænsninger. Nogle mængden af stretching og klemme af nerve under proceduren kan oprette skader i nerven. Desuden er det vanskeligt at kontrollere det nøjagtige antal celler går ind i nerven. Endvidere, denne model er begrænset til undersøgelse af celler, der allerede har invaderet nerver. Det er ikke en model til at studere samspillet mellem nerver med kræftceller i den primære tumor. Den største ulempe ved hjælp af ischiadicus nerver versus nerver i mave-tarmkanalen er, at ischiadicusnerven ikke er en metastatisk site af kræft i bugspytkirtlen. Forskellen i sammensætningen og arten af nervefibre kan påvirke invasionen. Men tilgængelighed og meget lille størrelse af pancreas nerver ville ikke tillade sådan undersøgelse.
Vores vigtigste forslag for begyndere ville være at fjerne håret i et stort område omkring planlagte indsnit websteder, så seværdigheder let kan identificeres og at sørge for at have en stabil stilling før begyndelsen at injicere. Efter mange indsprøjtninger, bør performer kunne få 100% af dyr med nerve invasion.
Denne model giver mulighed for undersøgelsen interaktioner mellem kræft og nerver i en dyremodel. Det kan anvendes til en bred vifte af oncologic undersøgelser ved hjælp af genmodificerede mus og/eller kræftceller. Farmakologiske behandlinger mod tumor invasion langs nerverne kan også testes ved at sammenligne længden og område af invasionen mellem behandling og kontrol grupper. Disse forskellige mulige applikationer gør denne model en ekstremt alsidigt og kraftfuldt værktøj til at studere PNI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender de tekniske tjenester, som molekylære cytologi facilitet og Dyrefacilitet af Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud CA157686 (til R.J. Wong) og P30 CA008748 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center støtte grant).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse | Number and age variable depending on experimental needs | ||
| Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) | Any | Steps 1.1, 1.2, 1.3. | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Falcon | 352098 | Step 1.1 |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Axygen | MCT-150-C-S | Step 1.2 |
| Electric razor | WAHL | 9962 | Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent |
| Isoflurane, 250 mL | Baxter | 1001936060 | Step 2.2 |
| Hypoallergenic surgical tape | 3M Blenderm | 70200419342 | Step 2.3 |
| Betadine Swapsticks | PDI | SKU 41350 | Step 2.4 |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 | Step 2.4 |
| Sterile surgical tools (scissors and forceps) | Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5 | ||
| 10 μL Hamilton syringe | Hamilton | 80308 | Steps 2.7, 2.8 |
| Steel Micro spatula | Fisher Scientific | S50823 | Step 2.7 |
| Dissecting microscope | Step 2.7 | ||
| Bupivacine, 1 g | Enzo Life Sciences | BML-NA139-0001 | Step 2.9. Reconstitute to 0.5% |
| 5-0 Nylon suture | Ethicon | 698H | Step 2.9 |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Step 4.1 |
| Tissue-Tek Cryomold Molds | VWR | 25608-916 | Step 4.1 |
References
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11 (10), 695-707 (2011).
- Deborde, S., Wong, R. J. How Schwann cells facilitate cancer progression in nerves. Cell Mol Life Sci. 341 (177-186), 1236361-1236416 (2017).
- Abiatari, I., et al. Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma. Mol Cancer Ther. 8 (6), 1494-1504 (2009).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Gil, Z., Cavel, O., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- Deborde, S. T., et al. Schwann cells induce cancer cell dispersion and invasion. J Clin Invest. 126 (4), 1538-1554 (2016).
- Pour, P. M., Egami, H., Takiyama, Y. Patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implications. Gastroenterology. 100 (2), 529-536 (1991).
- Eibl, G., Reber, H. A. A xenograft nude mouse model for perineural invasion and recurrence in pancreatic cancer. Pancreas. 31 (3), 258-262 (2005).
- Stopczynski, R. E., et al. Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Res. 74 (6), 1718-1727 (2014).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13 (21), 6479-6485 (2007).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Cremer, H., et al. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- He, S., et al. GFRα1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. P Natl Acad Sci USA. , 02944 (2014).
