Summary
Vi beskriver en i vivo murine modell perineural invasjon ved å injisere syngeneic kreft i bukspyttkjertelen celler i sciatic nerve. Modellen gir kvantifisering av omfanget av nerve invasjon, og støtter undersøkelse av mobilnettet og molekylære mekanismer perineural invasjon.
Abstract
Kreftceller invadere nervene gjennom en prosess kalt perineural invasjonen (PNI), som kreft celler sprer og overføre i nerve microenvironment. Denne typen invasjonen er utstilt ved en rekke typer kreft, og veldig ofte finnes i bukspyttkjertelkreft. Mikroskopiske størrelsen på nerve fiber innen musen bukspyttkjertelen gjengir studiet av PNI vanskelig orthotopic murint modeller. Her beskriver vi en heterotopic i vivo modell av PNI, hvor vi injisere syngeneic bukspyttkjertelkreft celle linje Panc02-H7 i murine sciatic nerve. I denne modellen er sciatic nerver bedøvet mus utsatt og injisert kreftceller. Kreftceller invadere i nervene proximally mot ryggmargen fra poenget med injeksjon. Invaderte sciatic nerver er deretter trekkes ut og behandles med OCT frosne snitting. H & E og immunofluorescence flekker av disse delene at kvantifisering av både graden av invasjonen og endringer i protein uttrykk. Denne modellen kan brukes til en rekke studier på PNI gitt dens allsidighet. Hvis du bruker mus med forskjellige genetiske modifikasjoner og/eller ulike typer av kreftceller kan for undersøkelse av mobilnettet og molekylære mekanismer for PNI og forskjellige kreftformene. Videre kan effekten av terapeutisk agenter på nerve invasjonen studeres ved å bruke behandling mus.
Introduction
Nervene danner en bestemt svulst microenvironment som stimulerer kreft vekst og migrasjon1,2,3. Perineural invasjonen (PNI) er prosessen gjennom som kreft celler invadere i og rundt nerver. Det kan betraktes som en unik måte av metastasering siden kreft invasjonen strekker seg fra webområdene opprinnelsesland langs nervene. PNI finnes i flere typer kreft inkludert bukspyttkjertelen, prostata, hode og nakke, salivary, livmorhalsen, og kolorektal kreft med en forekomst, fra 22% til 100%1,2. PNI er forbundet med smerte og korrelerer med dårlig prognose og verre overlevelse priser1,2.
Utvikle perineural invasjonen er viktig å belyse cellulære og molekylære mekanismer for denne prosessen, og å teste kandidat terapeutiske agenter for å redusere PNI. In vitro -metoder for å studere interaksjonen mellom kreft og nerver inkluderer co kulturen av kreftceller med nerve explants4, med dorsal root ganglions5,6,7, eller bestemte celler fra nerve celler microenvironment som Schwann7. I vivo tilnærminger, er imidlertid mer fysiologisk relevante, omfatter bruk av kreft musen modeller som har kreft indusert eller transplantert og har fordelen av hele nerve microenvironment. I orthotopic modeller av bukspyttkjertelen eller prostata kreft, PNI har vært rapportert8,9,10 og forekomsten av PNI kan registreres, men på grunn av den lille størrelsen på nervene i disse organene, er det vanskelig å se hele nerve og derfor å kvantifisere omfanget av PNI. Modellen vi beskriver her er en i vivo modell av PNI i som kreft celler blir injisert i sciatic nerve mus gjennom et enkelt kirurgisk inngrep11. Heterotopic transplantasjon invaderer innen nerve mot ryggmargen. Lengden på nerve invasjon fra området av injeksjon i ryggmargen kan måles, og volumet av kreft i nerve. Viktigere, kan invaderte nerve også samles for en rekke analyser inkludert mikroskopiske, og molekylær analyser. En rekke kreftceller kan testes, og vert musene som er genetisk endret eller behandlet med bestemte forbindelser kan brukes også. Denne kraftige analysen gir kreftceller og vert microenvironment endres for etterforskning mekanismer av PNI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer med dyr fag ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved Memorial Sloan Kettering Cancer Center.
1. forberedelse av kreftceller
- Høste sub confluent Panc02-H7 celler med 0,25% trypsin i 5 min på 37 ° C. Samle inn cellene i et 15 mL sentrifuge rør.
Merk: Cellene er dyrket i T-225 kolbe, som inneholder ca 12 x 106 celler per kolbe på 80% confluency og 4 mL trypsin / kolbe brukes. - Sentrifuge cellene på x 900 g på 4° C i 5 min. vask cellene av resuspending cellen pellets i 1 mL av PBS (av pipettering opp og ned to ganger), og overføre suspensjon slik 1,5 mL microcentrifuge på is.
- Sentrifuge cellene igjen på x 900 g på 4° C i 5 minutter, og forkaste nedbryting uten å forstyrre pellet. Holde pelleted cellene på is til injeksjon.
2. forberedelse av mus og kirurgi
Merk: 8-uke-gamle, mannlige og kvinnelige C57BL/6J mus brukes i denne studien. Kirurgi vilkårene følger de IACUC reglene i institusjon våre. Instrumentene er sterilisert, kirurgisk arbeidsgruppen overflaten er desinfisert, dyret er desinfisert og kirurgen bærer sterilt hansker.
- Dagen før operasjonen, bedøve musen bruker 2% isoflurane og fjern pelsen langs femur på dorsal side med en tynn barberhøvel eller en kjemisk hår fjerning agent.
- På dagen for kirurgi, bedøve mus med 2% isofluorane i en induksjon kammer. Bekrefte anesthetization ved en tå knipe stimulans og manglende respons.
- Bruk vet salve øyne å hindre tørrhet under narkose.
- Plasser bedøvet musen på ventral side, og forsiktig sikre hvert lem med allergivennlige tape å skape mild spenning i legemsdelen skal injiseres. Anestesi opprettholdes ved hjelp isoflurane levert via en presisjon fordamper og nesen kjegle.
- Rengjør injeksjonsstedet med Betadine, igjen med 70% alkohol. Gjenta denne prosessen to ganger. Kontroller at ingen løs hår forblir på kirurgiske feltet.
- Gjøre en 1 cm snitt med liten saks ca 2 mm under og parallell til femur. Trekke huden med tang sidelengs å avsløre musklene under.
- Ischias nerven går dypt til de gluteus maximus og biceps femoris musklene. Skille disse to musklene langs fascial flyet med liten saks og utsette sciatic nerve under. Gratis nerve fra omkringliggende musklene bruker sløv disseksjon.
- Trekke 3 μL av kreftceller (rundt 50 000 celler) fra pellet 10 μL sprøyter til.
Merk: Tegn også 3 μL PBS som en kontroll. - Plasser små metall spatula under nerve ved injeksjon for støtte. Under visualisering dissecting mikroskop, setter du inn nålen inn i nerve mot metall basen, holde nålen som parallelt nerve som mulig på innsettingen. Pass på at du ikke punktere gjennom baksiden av nerve. Minimere håndtering av nerve som mulig gjennom denne prosessen.
- Sakte injisere i nerve over 5 s. En formasjon av en lyspære i injeksjonsstedet området angir en god injeksjon. Så la nålen i stedet for 3 s før nålen forsiktig. Holde nålen i stedet for 3 s minimerer tilbakestrømming cellene av nerve.
Merk: Injeksjon kan utføres mot den distale nerven eller ryggmargen. Det er viktig å forbli konsekvente innenfor et sett av eksperimenter. Hvis cellene søl utenfor, skal dyret ikke inkluderes i analysen av eksperimentet. Med erfaring er disse hendelsene svært sjeldne. - Tilbake nerve til sin opprinnelige posisjon. Dekk nerve med overliggende musklene. Behandle mus med riktig analgesi, og Lukk huden med 5-0 Nylon sømmer.
- Plasser musen alene i en ren bur for observasjon under gjenoppretting til det fullt vekker bedøvelsen.
Merk: Det tar 5-15 min for dyret å gjenvinne full bevissthet. Dyr er ikke tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Dyr er ikke tilbake til selskapet av andre dyr til helt frisk. Deretter vurdere utvinning minst en gang hver 24 h 72 h.
3. Sciatic Nerve utvinning
- Postop dag #7, euthanize mus med CO2. Plasser musen på ventral side, og stabilisere distale lemmer med pinner.
- Fjern skinnet på dorsal side injisert lemmer og overkropp.
- Bruker sløv disseksjon, utsette sciatic nerve dyp til musklene.
- Nerve kursene mellom Tarmben og sacrum. For å ha tilgang til nerve i ryggmargen regionen, kan du skille de to beina. Først sette inn lukket saks i smale hvor ischias nerven ligger og åpne saksen mens du holder musen. Være delikat og opprettholde integriteten til sciatic nerve under dissection.
- Nøye analysere sciatic nerve distally til slutten av femur og proximally ryggmargen.
- Merk: Invaderte nerver er ytterst skjør og utsatt for brudd under spenning eller kraftig håndtering.
- Høste nerve ved første kutte den klubbeformede enden. Nøye løft nerve mens frigjøre den fra nærliggende vev. Kuttet nerve ved den proksimale enden, så nært som mulig til sin exit fra ryggraden.
- Post og brutto lengden på invasjonen med en Vernier caliper. Denne makroskopiske estimering er bare veiledende.
4. nerve behandling og måling
- Bygge inn dissekert nerve i OCT sammensatte. Pass på at nerver langs og så flat på bunnen av mold som mulig.
- Angi båndet den proksimale og distale siden av nerve ved å merke bokstaven P og D.
- Sett innebygde nerver over tørris, hvis de ikke er delt umiddelbart. Prøven kan bli bevart ved-80 ° C i flere uker.
- Delen prøver ved en kryostaten mikrotomen på 5 μm tykkelse og sted deler på glass lysbilder. Hvis mulig, passe 2 nerve seksjoner per lysbilde. Angi proksimale side av nerve.
- Stain lysbilder ved hjelp av H & E flekker12.
- Digitalt skanne farget nerve deler med en lysbilde-skanner som gir høyoppløselige digitale data.
- Ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare, kvantifisere lengden på invasjonen ved å klikke måle avstand, område med invasjonen, eller andre ønskede parametere. For en god estimering av lengden på invasjonen, bruke flere inndelinger (2 til 4) i samme nerve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden beskriver kirurgisk implantering av kreft i bukspyttkjertelen celler i murine sciatic nerve til å opprette en i vivo modell kvantifiserbare nerve invasjon. Figur 1 illustrerer anatomiske plasseringen av ischias nerven og injeksjonsstedet. Figur 2 viser to sciatic nerver av en naken mus. En PBS injisert nerve (venstre) kan sammenlignes med en nerve injisert med MiaPaCa-2 kreftceller (høyre). Nerve injisert kreftceller er infiltrert av svulst, og opptrer både tykkere og mørkere enn nerve injisert med PBS.
Figur 3 viser målbare forskjellene av ischias nerven invasjon av bukspyttkjertelkreft celle Panc02H7 i wild type og NCAM KO mus. NCAM KO mus er mus som vedheft molekyl neural-celle adhesjon molekyl 1 er mangelfull13. Og området av invasjonen har vært kvantifisert ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Invasjonen ble funnet betydelig redusert i NCAM KO mus7.
Figur 1 : Mus sciatic nerve og injeksjonsstedet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : To dissekert sciatic nerver museklikk. En PBS injisert nerve (venstre) og en nerve injisert med MiaPaCa-2 kreft celler (høyre) vises. Svarte pilene viser injeksjonsstedet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : H & E langsgående deler av sciatic nerver injisert med Panc02H7 kreftceller i vill type og NCAM KO mus. Hvite pilene angir området av injeksjon og proksimale siden av ryggmargen. De svarte pilene angir lengden på invasjonen med tilsvarende verdier (mm). Skala bar: 5 mm (topp bilder) og 0.2 mm (bunnen bilder). Kvantifisering av nerve invasjon, målt ved og området av invasjonen. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), ** P < 0.005, *** P < 0,0005 bruk av t-test. (Resultater fra Deborde et al., 20167). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en i vivo murine modell av perineural invasjonen som gir mulighet for kvantifisering av ischias nerven invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler. Denne modellen muliggjør studiet av molekylære mekanismer nerve invasjon. Vellykket eksperimenter ved hjelp av denne teknikken krever en forsiktig tilnærming til tre viktige trinn i prosessen: 1) injeksjon av kreftceller (trinn 2.7, 2.8), 2) utvinning av invaderte nerver (trinn 3.4), og 3) behandling av høstet nerver (trinn 4.1).
Injeksjon bør gjøres forsiktig å unngå punktering gjennom bakveggen av nerve, som fører til tap av kreftceller. Når nålen er på plass, injeksjon bør gjøres på en langsom og jevn tempo over 5 s å hindre hydrauliske kraft propelling kreft celler for langt frem fra punktet av injeksjon. La nålen i nerve etter injeksjon for ytterligere 3 s vil redusere tilbake flyt og kreft cellen lekkasje. Under ischias nerven utvinning, må disseksjon være svært skånsom som invaderte sciatic nerve er svært skjøre. Kreft invasjonen forstyrrer vanlig mobilnettet organiseringen av ischias nerven. Selv om invaderte nerver vises tykkere i diameter sammenlignet med ikke-injisert eller ikke-invaderte nerver, de er mer utsatt for å bryte med selv mindre strekking og manipulasjon. Under innebygging av forbrukeravgift nerve i OCT for behandling, er det svært viktig å sikre at nerve er lagt helt flatt på mold. Dette trinnet gir inndeling av prøven å fange hele lengden av nerve tilsvarende analysemuligheter. Solid svulst på nerve må ofte trimmes for å hindre nerve segmentet proksimale til svulsten fra heve nerve av bunnen av mold. Hele lengden av nerve må legges helt flatt mot mold.
Mange endringer kan betraktes mens du bruker denne protokollen. Når små metall spatula ikke finnes plasseres under sciatic nerve, kan overflaten av et par bredt tang brukes i stedet. En tang kan brukes til å holde nålen på plass etter innsetting, men ulempene med denne tilnærmingen er en redusert visning av injeksjon og potensial til å knuse nerve hvis overdreven kraft. En annen måte er å bruke en fin tang for å løfte nerve, deretter åpne tang strekke nerver. Denne metoden er lettere å utføre og gir både spenning og stabilisering under injeksjon, men kan skade nerve med overdreven strekk i nerve. Injeksjon kan gjøres enten proksimale eller distale retning, men vi har funnet at i begge tilfeller mot kreft invasjonen er vanligvis mot ryggmargen. Derfor foretrekker vi injisere distally til ytterligere minimere hydraulisk kraft som kan presse kreftcellene mot ryggmargen og forvirre senere lengdemål invasjon. Vi anbefaler at det er viktig å være konsekvent i valg av kjøreretning injeksjon i et sett av eksperimenter.
Selv om vi presentere en modell av syngeneic pode, kan en lignende teknikk brukes for xenografts menneskelige celler i immunodeficient mus, med bare små variasjoner. Xenografts i naken mus kan kreves lengre perioder kreft invasjonen å gi tilsvarende lengder av nerve invasjonen som syngeneic modeller. Forskjellige kreftcelle linjer kan også brukes. PNI er ikke bare utbredt i kreft i bukspyttkjertelen, men også av hodet og nakke, prostata og hudkreft. Våre lab har ble injisert naken mus i sciatic nerve med menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer MiaPaCa-2 og Panc17,14,15.
Mulige bivirkninger inkluderer sår dehiscence, som mus noen ganger tygge deres masker som resulterer i åpningen av såret. I så fall må såret være re sydd. Vi sjekker såret daglig for de 3 første postoperativ dagene. Musene kan også gå med en liten haltende postoperatively, sannsynligvis på grunn av smerter fra både den kirurgiske prosedyren som invasjonen av deres ischias nerven med kreft. Dette er vanligvis ikke alvorlig nok til å kreve smertestillende medikamenter.
Denne modellen har begrensninger. Noen mye strekking og klemming av nerve under prosedyren kan opprette skader i nerve. Dessuten, er det vanskelig å kontrollere antallet celler kommer inn i nerve. Videre, denne modellen er begrenset til studiet av celler som har allerede invadert nerver. Det er ikke en modell for å studere samspillet av nerver kreftceller i den primære svulsten. Det hovedavdeling ulempen av benytter sciatic nerver versus nerver av fordøyelsessystemet er at ischias nerven ikke er et metastatisk nettsted på kreft i bukspyttkjertelen. Forskjellen i sammensetning og natur nervefibrene kan påvirke invasjonen. Imidlertid ville tilgjengelighet og svært liten størrelse av bukspyttkjertelen nerver ikke tillate slik studie.
Våre viktigste tips for nybegynnere ville være å fjerne håret i et bredt område rundt planlagt snitt nettsteder slik at landemerkene kan lett identifiseres og sørge for å ha en fast stilling før du begynner å injisere. Etter mange injeksjoner skal utøveren kunne få 100% av dyr med nerve invasjon.
Denne modellen muliggjør studiet samspillet mellom kreft og nerver i en dyremodell. Den kan brukes til en rekke oncologic studier ved hjelp av genmodifiserte mus, kreftceller eller begge. Farmakologiske behandlinger mot svulst invasjon langs nervene kan også bli testet ved å sammenligne og området av invasjonen mellom behandling og kontroll grupper. Disse ulike mulige anvendelser gjør denne modellen en ekstremt allsidig og kraftig verktøy for å studere PNI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter tekniske tjenestene som tilbys av molekylære cytologi anlegget og dyr anlegget av Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd CA157686 (til RJ Wong) og P30 CA008748 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center støtte grant).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse | Number and age variable depending on experimental needs | ||
| Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) | Any | Steps 1.1, 1.2, 1.3. | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Falcon | 352098 | Step 1.1 |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Axygen | MCT-150-C-S | Step 1.2 |
| Electric razor | WAHL | 9962 | Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent |
| Isoflurane, 250 mL | Baxter | 1001936060 | Step 2.2 |
| Hypoallergenic surgical tape | 3M Blenderm | 70200419342 | Step 2.3 |
| Betadine Swapsticks | PDI | SKU 41350 | Step 2.4 |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 | Step 2.4 |
| Sterile surgical tools (scissors and forceps) | Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5 | ||
| 10 μL Hamilton syringe | Hamilton | 80308 | Steps 2.7, 2.8 |
| Steel Micro spatula | Fisher Scientific | S50823 | Step 2.7 |
| Dissecting microscope | Step 2.7 | ||
| Bupivacine, 1 g | Enzo Life Sciences | BML-NA139-0001 | Step 2.9. Reconstitute to 0.5% |
| 5-0 Nylon suture | Ethicon | 698H | Step 2.9 |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Step 4.1 |
| Tissue-Tek Cryomold Molds | VWR | 25608-916 | Step 4.1 |
References
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11 (10), 695-707 (2011).
- Deborde, S., Wong, R. J. How Schwann cells facilitate cancer progression in nerves. Cell Mol Life Sci. 341 (177-186), 1236361-1236416 (2017).
- Abiatari, I., et al. Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma. Mol Cancer Ther. 8 (6), 1494-1504 (2009).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Gil, Z., Cavel, O., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- Deborde, S. T., et al. Schwann cells induce cancer cell dispersion and invasion. J Clin Invest. 126 (4), 1538-1554 (2016).
- Pour, P. M., Egami, H., Takiyama, Y. Patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implications. Gastroenterology. 100 (2), 529-536 (1991).
- Eibl, G., Reber, H. A. A xenograft nude mouse model for perineural invasion and recurrence in pancreatic cancer. Pancreas. 31 (3), 258-262 (2005).
- Stopczynski, R. E., et al. Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Res. 74 (6), 1718-1727 (2014).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13 (21), 6479-6485 (2007).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Cremer, H., et al. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- He, S., et al. GFRα1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. P Natl Acad Sci USA. , 02944 (2014).
