Cancer Research

מודל מאתר בעצב In Vivo של הפלישה Perineural

Published: April 23, 2018 doi: 10.3791/56857

Sylvie Deborde*¹, Yasong Yu*¹, Andrea Marcadis¹, Chun-Hao Chen¹, Ning Fan², Richard L. Bakst³, Richard J. Wong¹

¹Department of Surgery, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, ²Molecular Cytology Core Facility, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, ³Department of Radiation Oncology, Mount Sinai Hospital

* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים ויוו מאתר מודל של הפלישה perineural באמצעות הזרקת תאי סרטן הלבלב syngeneic לתוך בעצב. המודל מאפשר כימות היקף הפלישה עצב ותומך החקירה של המנגנונים תאית ומולקולרית של פלישה perineural.

Abstract

תאים סרטניים לפלוש העצבים באמצעות תהליך הנקרא perineural הפלישה (PNI), שבה סרטן התאים להתרבות ולהעביר ב microenvironment העצב. סוג זה של הפלישה מוצגת על ידי מגוון רחב של סוגי סרטן, והוא לעיתים קרובות מאוד נמצא סרטן הלבלב. הגודל המיקרוסקופי של סיבי עצב בתוך הלבלב העכבר הופך את המחקר של PNI קשה במודלים מאתר orthotopic. כאן נתאר מודל הטרוטופי ויוו של PNI, איפה אנחנו מזריקים syngeneic סרטן הלבלב תא קו Panc02-H7 לתוך בעצב מאתר... במודל זה, בירך את העצבים של עכברים ומורדמת חשוף, מוזרק עם תאים סרטניים. תאים סרטניים לפלוש ב העצבים הציר הקרוב לכיוון חוט השדרה מנקודת הזריקה. העצבים ממוגלה פלשו ואז חילוץ, מעובד עם OCT עבור חלוקתה קפוא. H & E ו- immunofluorescence מכתים סעיפים אלה מאפשרים כימות של שני מידת הפלישה ושינויים בביטוי חלבונים. מודל זה ניתן ליישם מגוון רחב של מחקרים על PNI בהתחשב צדדיות שלה. שימוש בעכברים עם שינויים גנטיים שונים ו/או סוגים שונים של תאים סרטניים מאפשר חקירה של מנגנונים תאית ומולקולרית PNI ועבור סוגי סרטן שונים. יתר על כן, ההשפעות של סוכני טיפולית על הפלישה עצב ניתן יהיה ללמוד על-ידי החלת טיפול אלו עכברים.

Introduction

העצבים בצורת microenvironment של גידול ספציפי מעורר סרטן הצמיחה והעברה¹^,²^,³. הפלישה Perineural (PNI) הוא התהליך דרך איזה סרטן תאים לפלוש העצבים בולטים. זה עשוי להיחשב מסלול מיוחד של גרורות מאז הפלישה סרטן משתרע מן האתרים ממוצא לאורך העצבים. PNI נמצא בכמה סוגי סרטן כולל, הלבלב, הערמונית, ראש & צוואר, הרוק, צוואר הרחם, סרטן המעי הגס עם שכיחות 22% ועד 100%¹^,². PNI מזוהה עם הכאב, מופיע עם פרוגנוזה גרועה הישרדות המחירים¹^,².

פיתוח מודלים הפלישה perineural חיוני התירי את המנגנונים תאית ומולקולרית של תהליך זה, לבחון את המועמד סוכני טיפולית להפחתת PNI. שיטות במבחנה של הלומדים האינטראקציות בין סרטן ועצבים כוללות את תרבות משותפת של תאים סרטניים עם עצב explants⁴, עם השורש העזוב ganglions⁵^,⁶^,⁷, או עם תאים ספציפיים מן העצב microenvironment כגון שוואן תאים⁷. In vivo גישות, עם זאת, רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית, כוללים את השימוש מודלים העכבר סרטן שבו סרטן הנגרם או מושתלים, יש את היתרון של הנהלת חשבונות עבור microenvironment כל העצבים. Orthotopic מודלים של סרטן הלבלב או הערמונית, PNI כבר דווח על⁸^,⁹^,¹⁰ , ניתן להקליט את שכיחות PNI, אך בגלל גודלו הקטן של העצבים באיברים האלה, קשה לראות העצב כולו ולכן כדי לכמת את מידת PNI. המודל שנתאר כאן הוא מודל ויוו של PNI שבה סרטן תאים מוזרקים לתוך בעצב של עכברים באמצעות הליך כירורגי פשוט¹¹. ההשתלה הטרוטופי פולש בתוך העצב לכיוון חוט השדרה. האורך של הפלישה עצב מהאתר של הזרקת בחוט השדרה יכול למדוד, כמו גם אמצעי האחסון של הסרטן בתוך העצב. חשוב, ניתן גם לאסוף העצב פלש עבור מגוון של מבחני ובהם ניתוח מיקרוסקופי, ומולקולרית. ניתן לבחון את מגוון של תאים סרטניים, העכברים מארח גנטית שונה או מטופלים עם תרכובות מסוימות עשוי לשמש גם כן. Assay חזק זה מאפשר את התאים הסרטניים microenvironment מארח את כדי להיות שונה עבור החקירה המנגנונים PNI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה-ממוריאל סלואן קטרינג Cancer Center.

1. הכנה של תאים סרטניים

קציר תאים Panc02-H7 תת confluent עם 0.25% טריפסין למשך 5 דקות ב 37 º C. איסוף התאים שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל.
הערה: התאים גדלים T-225 את הבקבוק, המכיל כ 12 x 10⁶תאים לכל הבקבוק ב 80% confluency ו 4 מ"ל טריפסין / הבקבוק משמש.
Centrifuge התאים ב x 900 גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. לשטוף התאים על ידי resuspending התא הצניפה ב 1 מ"ל ל- PBS (על-ידי pipetting למעלה ולמטה פעמיים), ולהעביר ההשעיה צינור microcentrifuge 1.5 mL על קרח.
Centrifuge התאים שוב ב x 900 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. לשמור את התאים pelleted על הקרח עד זריקה.

2. הכנה של עכברים, ניתוח

הערה: בן שבוע 8, זכר ונקבה C57BL/6J עכברים משמשים במחקר זה. התנאים ניתוח בעקבות החוקים IACUC של מוסדנו. כלי הנגינה סטריליים, משטח העבודה כירורגי הוא מחוטא, החיה הוא מחוטא, המנתח חובש כפפות סטריליות.

ביום שלפני הניתוח, עזים ומתנגד העכבר באמצעות 2% איזופלוריין ולאחר מכן להסיר את הפרווה לאורכו של עצם הירך בצד הגבי עם תער דק או סוכן להסרת שיער כימית.
ביום של הניתוח, עזים ומתנגד העכברים באמצעות 2% isofluorane ב חדר אינדוקציה. לאשר האסתטיזציה על ידי גירוי קמצוץ הבוהן ואת חוסר תגובה.
הוטרינר משחה למרוח את העיניים למניעת יובש תחת הרדמה.
הנח את העכבר anesthetized על הצד הבטני, ולאבטח בעדינות כל איבר עם קלטת היפואלרגניים כדי ליצור מתח מתון האיבר כדי להיות מוזרק. הרדמה נשמר באמצעות איזופלוריין מועברת באמצעות מכשיר אידוי דיוק עם האף חרוט.
נקה ההזרקה עם Betadine, ואז שוב עם אלכוהול 70%. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות. ודא כי אין ופזור נשאר על המגרש כירורגי.
עושים חתך 1 ס מ עם מספריים קטנות בערך 2 מ מ מתחת, במקביל עצם הירך. משכי את העור עם מלקחיים רוחבית לחשוף את השרירים שמתחת.
בעצב נוסע עמוק שרירי העכוז, הדו-ראשי. להפריד בין אלה השרירים שני לאורך מטוס fascial עם מספריים קטנים ולחשוף בעצב מתחת. חינם העצב מן השרירים המקיפים באמצעות עמום.
שואבים μL 3 של תאים סרטניים (כ-50,000 תאים) בגדר לתוך מזרק 10 μL.
הערה: לחלופין, צייר μL 3 ל- PBS כפקד.
המקום מרית מתכת קטן מתחת העצב בנקודת ההזרקה לקבלת תמיכה. תחת הדמיה עם מיקרוסקופ ויבתר, הכנס את המחט לתוך העצב נגד בסיס מתכת, להשאיר את המחט להוות מקבילה העצב ככל האפשר על ההכנסה. יש להיזהר לא לנקב דרך החלק האחורי של העצב. מזער את הטיפול של עצב ככל האפשר לאורך כל התהליך הזה.
לאט לאט להחדיר לתוך העצב מעל 5 s. היווצרות של נורת באזור ההזרקה מציין זריקה טובה. אז להשאיר את המחט במקום 3 s לפני הסרת את המחט בעדינות. להשאיר את המחט במקום 3 s ממזער זרם אחורי של התאים מתוך העצב.
הערה: ניתן לבצע הזרקה לכיוון העצב או חוט השדרה. חשוב להישאר עקבי בתוך קבוצה של ניסויים. אם התאים לשפוך בחוץ, החיה לא ייכללו בגליון הניתוח של הניסוי. עם ניסיון, אירועים אלה הם נדירים מאוד.
להחזיר את האומץ למיקום המקורי. מכסים את העצב עם השרירים שמעליה. מתייחסים העכברים עם שיכוך כאבים הנכון ולאחר מכן סגור את העור עם התפרים ניילון 5-0.
הנח את העכבר לבד בתוך כלוב נקי להשגחה במהלך ההתאוששות, עד הוא מתעורר לחלוטין מן ההרדמה.
הערה: זה לוקח 5-15 דקות לבעל החיים להכרה מלאה. החיה ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. החיה לא יוחזר אל החברה של בעלי חיים אחרים עד החלים לחלוטין. לאחר מכן, להעריך התאוששות לפחות פעם אחת בכל 24 שעות במשך 72 h.

3. חילוץ בעצב

ביום מנותחות #7, המתת חסד העכברים עם CO₂. הנח את העכבר בצד הגחוני, לייצב את הגפיים דיסטלי באמצעות סיכות.
מסירים את העור בצד הגבי של האיבר מוזרק ואת פלג הגוף העליון.
באמצעות עמום, לחשוף בעצב עמוק בשריר.
הקורסים העצב בין הכסל של עצם העצה. כדי לקבל גישה אל העצב על האזור חוט השדרה, הפרד בין שתי העצמות. להוסיף קודם ומספריים סגור בתחום הצר שבו ממוקם בעצב ולאחר מכן פתח את המספריים תוך החזקת העכבר. עדין, לשמור על היושרה של בעצב בזמן.
בזהירות לנתח בעצב רחוק עד הסוף של עצם הירך, הציר הקרוב בחוט השדרה.
הערה: פלש מרוטים. שביר מאוד ונוטה שבירת תחת מתח או טיפול כוחני.
הקציר האומץ על ידי חיתוך הראשונה סופו דיסטלי. בזהירות להרים את העצב החריד את זה מרקמות סמוכים. חותכים את העצב בסוף צינתור, קרוב ככל האפשר אל היציאה שלה מן השדרה.
שיא ואז דוחה אורך הפלישה באמצעות של caliper ורניה. שערוך מאקרוסקופית הזה הוא רק מעיד.

4. עצבים כימות ועיבוד

להטביע את העצב גזור ב אוקטובר מתחם. לעשות כדי למקם את העצבים longitudinally שטוח לחלוטין על החלק התחתון של העובש ככל האפשר.
מצביעים על קלטת הצד הפרוקסימלית ו דיסטלי של העצב על ידי סימון האות P ו- d
המקום העצבים המוטבע על גבי קרח יבש, אם הם לא נמצאים למחלקה מיד. לדוגמה יכול להישמר ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
דוגמאות מקטע באמצעות מיקרוטום Cryostat ב 5 μm עובי ומקום מקטעים בשקופיות זכוכית. במידת האפשר, להתאים מקטעים עצב 2 עבור כל שקופית. מצביעים על הצד הפרוקסימלית של העצב.
כתם השקופיות באמצעות H & E צביעת¹².
סריקה דיגיטלית סעיפים מוכתמים עצב עם סורק שקופיות המספק נתונים דיגיטליים ברזולוציה גבוהה.
באמצעות תוכנת הדמיה, לכמת את האורך של הפלישה על ידי לחיצה על לחצן מרחק מדידה, אזור של הפלישה, או אחרים הרצוי פרמטרים. לשימוש הערכה טובה של אורך הפלישה, מקטעים מרובים (2-4) של אותו עצב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטה זו מתארת השתלה כירורגית של תאי סרטן הלבלב לתוך בעצב מאתר כדי ליצור מודל ויוו הפלישה עצב לכימות. איור 1 מדגימה את המיקום האנטומי של בעצב, באתר של הזרקה. איור 2 מציג את העצבים בירך שני של עכבר ערום. ניתן להשוות בעצב PBS מוזרק (משמאל) בעצב הזריק MiaPaCa-2 תאים סרטניים (מימין). העצב מוזרק עם תאים סרטניים ובלטה על-ידי הגידול, ומופיע עבה יותר והן כהה יותר אומץ הזריק PBS.

איור 3 מראה את ההבדלים לכימות הפלישה בעצב בתא סרטן הלבלב Panc02H7 פראי סוג ועכברים NCAM קו. NCAM KO עכברים הם עכברים שבה מולקולת הידבקות תאים עצביים מולקולה אדהזיה 1 הוא לקוי¹³. אורך ואזור של הפלישה יש כבר לכמת באמצעות תוכנת הדמיה. הפלישה נמצאה מופחתת באופן משמעותי ב עכברים NCAM קו⁷.

איור 1 : את העכבר בעצב, באתר של הזרקת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : השני גזור ממוגלה העצבים של עכבר. PBS מוזרק העצב (משמאל) ואת עצב מוזרק עם סרטן MiaPaCa-2 תאים (מימין) מוצגים. חצים שחורים להראות האתר של הזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : סעיפים H & E האורך של עצבים ממוגלה מוזרק עם תאים סרטניים Panc02H7 פראי סוג ועכברים NCAM KO. החצים הלבנים מצביעים על האתר של הזרקת וצד הפרוקסימלית של חוט השדרה. החצים השחורים מצביעים על האורך של פלישה עם ערכים מתאימים (מ מ). סרגל קנה מידה: 5 מ מ (תמונות העליון) ו- 0.2 מ מ (תמונות התחתון). כימות של עצב הפלישה, כפי שהיא נמדדת באורך ואזור של פלישה. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SD. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (קו NCAM1), * * P < 0.005, * * * P < 0.0005 באמצעות מבחן t. (נובעת Deborde et al., ריו דה ז'ניירו⁷). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ב פרוטוקול זה נתאר ויוו מאתר מודל של הפלישה perineural המאפשר כימות של הפלישה בעצב על-ידי תאי סרטן הלבלב. מודל זה מאפשר חקר המנגנונים המולקולריים של עצב הפלישה. ניסויים מוצלחים בעזרת טכניקה זו דורשים גישה זהירה שלושה שלבים קריטיים בתהליך: 1) הזרקה של תאים סרטניים (שלבים 2.7, 2.8), 2) החילוץ של עצבים פלש (שלב 3.4) ולאחר 3) עיבוד של עצבים שנקטפו (שלב 4.1).

הזריקה צריך להיעשות בזהירות רבה כדי להימנע ניקב דרך הקיר האחורי של העצב, מה שמוביל לאובדן של תאים סרטניים. ברגע שהמחט נמצאת במקום, הזריקה צריך להיעשות בקצב איטי ויציב מעל 5 s כדי למנוע את כוח הידראולי קדימה את הסרטן תאים יותר מדי מקדימה מנקודת הזריקה. להשאיר את המחט העצב לאחר ההזרקה עבור שלושה נוספים s יצמצם זליגת התא האחורי של זרימה וסרטן. במהלך החילוץ בעצב, דיסקציה חייבים להיות עדין מאוד בעצב פלש הוא שברירי. סרטן הפלישה משבש ארגון סלולרית רגילה בעצב. למרות העצבים פלשו מופיעים לעבות בקוטר בהשוואה ללא הזרקת או ללא פלש העצבים, הם נוטים יותר נפרד מתיחות אפילו מזערי ומניפולציה. במהלך ההטמעה של העצב נכרת ב אוקטובר לעיבוד, חשוב מאוד לבטח העצב מונח שטוח לגמרי על העובש. שלב זה מאפשר חלוקתה של המדגם ללכוד לכל אורכה של העצב לניתוח הנכון. גידולים מוצקים על העצב זקוק לעיתים קרובות חיתוך כדי למנוע על קטע העצב proximal לגידול מגידול העצב מתחתית העובש. לכל אורכה של העצב חייב להיות מונח שטוח לגמרי נגד העובש.

שינויים רבים יכול להיחשב תוך שימוש בפרוטוקול זה. מרית מתכת קטן אינו זמין מתחת בעצב, ניתן להשתמש במקום זאת השטח של זוג מלקחיים רחב. מלקחיים עשוי לשמש כדי להחזיק את המחט במקום לאחר ההוספה, למרות המגרעות של גישה זו הם נוף פחת של הזרקת ואת הפוטנציאל לרסק את העצב אם נעשה שימוש בכוח מופרז. דרך נוספת היא להשתמש מלקחיים בסדר כדי להרים את העצב, מכן פתיחת המלקחיים למתוח את העצבים. שיטה זו קל יותר לבצע מספק מתח והן מייצב במהלך ההזרקה, אך עלול לגרום נזק העצב עם מתיחה מוגזמת של העצב. הזריקה יכול להיעשות בשני הכיוונים צינתור או דיסטלי, אבל מצאנו כי בשני המקרים, הכיוון של הפלישה סרטן הוא בדרך כלל לכיוון חוט השדרה. לכן, אנו מעדיפים הזרקת רחוק כדי להוסיף ולצמצם את כוח הידראולי עשויים לדחוף את התאים הסרטניים לכיוון חוט השדרה, וחיסול מאוחר יותר למדידת אורך הפלישה. אנו ממליצים כי חשוב להיות עקבי בבחירת הכיוון של הזרקת בתוך ערכת ניסויים.

אמנם אנו מציגים מודל של הרכבה syngeneic, ניתן להשתמש בטכניקה דומה על תאים סרטניים אנושיים xenografts לתוך עכברים immunodeficient, בשינויים קלים בלבד. Xenografts בעכברים עירום מאי נדרש תקופות ארוכות יותר של סרטן הפלישה להניב תשואה דומה אורכים של עצב לפלישה כמו מודלים syngeneic. שורות תאים סרטן שונים עשוי גם לשמש. PNI אינה שכיחה סרטן הלבלב, אלא גם של ראש, צוואר, הערמונית, סרטן העור בלבד. המעבדה שלנו בהצלחה הזריקה עכברים עירום בעצב עם שורות תאים אנושיים סרטן הלבלב MiaPaCa-2 ו- Panc1⁷^,¹⁴^,¹⁵.

תופעות לוואי אפשריות כוללות התבקעות הפצע, העכברים ללעוס מדי פעם את התפרים שלהם וכתוצאה מכך הפתיחה של הפצע. במקרה כזה, הפצע צריך להיות תפור מחדש. אנחנו לבדוק את הפצע מדי יום קודם בשלושת הימים שלאחר הניתוח. העכברים עלול גם בצליעה קלה במשככי, ככל הנראה עקב כאב הן הליך כירורגי וכן הפלישה שלהם בעצב עם סרטן. זה בדרך כלל לא חמורה דיה כדי לדרוש משכחי כאבים.

מודל זה יש מגבלות. יש כמות מסוימת של מתיחות, התכווצות של העצב במהלך ההליך עשוי ליצור נזקים העצב. בנוסף, קשה לשלוט המספר המדויק של תאים לתוך העצב. יתר על כן, המודל הזה הוא מוגבל במחקר של התאים כבר פלשו העצבים. . זה לא מודל ללמוד את האינטראקציה של עצבים עם תאים סרטניים ממוקם הגידול העיקרי... החיסרון העיקרי של שימוש העצבים ממוגלה לעומת עצבי מערכת העיכול היא בעצב אינה אתר גרורתית של סרטן הלבלב. ההבדל בין ההרכב ואופי של סיבי העצב יכול להשפיע על הפלישה. עם זאת, הנגישות וגודל קטן מאוד של העצבים הלבלב לא תאפשר מחקר כזה.

שלנו הצעות מפתח למתחילים יהיה להסיר את השיער באיזור נרחב סביב האתרים החתך המתוכנן כך ציוני הדרך ניתן לזהות בקלות וכדי לוודא שיש משרה קבועה לפני שאתם מתחילים להזריק. לאחר זריקות רבות, המבצע צריך להיות מסוגל לקבל 100% של בעלי חיים עם הפלישה עצב.

דגם זה מאפשר המחקר את האינטראקציות בין סרטן לבין העצבים במודל חיה. זה יכול להיות מיושם למגוון רחב של מחקרים oncologic באמצעות עכברים מהונדסים, תאים סרטניים או שניהם. טיפול תרופתי נגד הפלישה גידול לאורך העצבים יכול להיבדק גם על-ידי השוואת אורך ואזור של הפלישה בין קבוצות הטיפול ושליטה. יישומים אפשריים שונים אלה להפוך את המודל כלי רב-תכליתי מאוד חזק ללמוד PNI הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים להכיר את השירותים הטכניים המסופקים על ידי המתקן ציטולוגיה מולקולרית, המתקן בעלי חיים במרכז הסרטן סלואן קטרינג אנדרטת. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים CA157686 (וונג אר) ו- P30 CA008748 (ממוריאל סלואן קטרינג לסרטן מרכז תמיכה גרנט).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1