Summary
Мы описываем в vivo мышиных модель рассасывании вторжения путем введения сингенных поджелудочных клеток рака в седалищный нерв. Модель позволяет для количественной оценки степени нерва вторжения и поддерживает исследование молекулярных и клеточных механизмов рассасывании вторжения.
Abstract
Раковые клетки вторгнуться нервов через процесс называется рассасывании вторжения (Пни), в котором рака клетки размножаются и мигрируют в нерв микроокружения. Этот тип вторжения выставляется различных типов рака и очень часто встречается в рак поджелудочной железы. В ортотопическая мышиных моделях микроскопических размеров нервных волокон внутри мыши поджелудочной железы затрудняет изучение PNI. Здесь мы описываем модель heterotopic в vivo пни, где мы вводим сингенных поджелудочный рак клеток линии Panc02-H7 в мышиных седалищного нерва. В этой модели седалищного нервов наркотизированных мышей подвергаются и вводят с раковых клеток. Раковые клетки вторгнуться в нервы проксимально к спинного мозга от точки инъекции. Вторглись седалищного нервов затем извлекаются и обрабатываются с октября для замороженных секционирование. H & E и иммунофлюоресценции пятнать этих разделов позволяют количественной оценки степени вторжения и изменения экспрессии белков. Эта модель может применяться для различных исследований на пни, учитывая его универсальность. С помощью мыши с различных генетических модификаций и/или различных типов раковых клеток позволяет для расследования молекулярных и клеточных механизмов пни и рака различных типов. Кроме того воздействие терапевтических агентов на нерв вторжения могут быть изучены путем применения лечения этих мышей.
Introduction
Нервы образуют конкретную опухоль микроокружения, который стимулирует рак роста и миграции1,2,3. Рассасывании вторжения (Пни) — это процесс, через который раковых клеток вторгнуться в и вокруг нервы. Он может быть рассматриваться как уникальный маршрут метастазов рака вторжения простирается от места происхождения по нервам. PNI встречается в нескольких типов рака, включая поджелудочной железы, предстательной железы, головы и шеи, слюнных, шейки матки и колоректального рака, заболеваемость, начиная от 22% до1,100%2. PNI связано с болью и коррелирует с плохим прогнозом и хуже выживание ставки1,2.
Разработка моделей рассасывании вторжения имеет важное значение для выяснения молекулярных и клеточных механизмов этого процесса и кандидат терапевтических агентов тестирования для уменьшения PNI. В vitro методы изучения взаимодействия между раком и нервы включают в себя совместное культура раковых клеток с нерва эксплантов4, Спинной корень ганглиев5,6,7или с конкретных ячеек от нерва микроокружения например Шванновские клетки7. В естественных условиях подходы, однако, являются более физиологически соответствующие, включают использование моделей мыши рака в которых рак индуцированных или пересадить и имеют преимущество приходится всего нерва микроокружения. В ортотопическая модели рака поджелудочной железы и простаты, PNI был сообщил8,9,10 и заболеваемости PNI могут быть записаны, но из-за небольшого размера нервы в этих органах, трудно увидеть весь нерв и поэтому для количественной оценки степени PNI. Модель, которую мы опишем здесь является модель в vivo пни, в котором рака клетки вводят в седалищный нерв мышей через простой хирургическая процедура11. Heterotopic трансплантация вторгается в сторону спинного нерва. Длина нерва вторжения с сайта инъекции для спинного мозга могут быть измерены, а также объем рака в течение нерва. Важно отметить, что вторглись нерва также могут быть собраны для различных анализов, включая микроскопические и молекулярного анализа. Целый ряд раковых клеток может быть проверена, и принимающей мышей, которые были генетически изменены или с конкретных соединений могут быть использованы также. Этот мощный assay раковые клетки и микроокружения хост позволяет быть модифицированы для расследования механизмы PNI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с животных темы были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом на Мемориал Слоун Kettering Рак центр.
1. Подготовка раковых клеток
- Урожай югу вырожденная Panc02-H7 клетки с трипсин 0.25% 5 минут при 37 ° C. Соберите клетки в пластиковых пробирок 15мл.
Настой используется / Примечание: Клетки растут в T-225 колбу, который содержит около 12 х 106 клеток на колбу на 80% confluency и 4 мл трипсина. - Центрифуга клетки на x 900 g при 4° C для 5 минут вымыть клетки, resuspending клетки пеллет в 1 мл PBS (по закупорить вверх и вниз дважды) и передать пробки microcentrifuge 1,5 мл подвеска на льду.
- Центрифуга клетки снова на x 900 g при 4° C за 5 мин и отбросить супернатант не нарушая гранулы. Держите гранулированных клетки на льду до инъекции.
2. Подготовка мышей и хирургии
Примечание: в этом исследовании используются 8-недельных, мужские и женские мышей C57BL/6J. IACUC хирургии условий правилам нашего учреждения. Инструменты стерилизуются, дезинфекция хирургические рабочей поверхности, вылечить животное и хирург носит стерильные перчатки.
- За день до операции анестезировать мыши, с помощью изофлюрановая 2%, а затем удалить мех по длине бедра на спинной стороне с тонкой бритвой или химической волос удаления агента.
- В день операции анестезировать мышей с использованием 2% isofluorane в камере индукции. Подтвердите анестезии мыс щепотку стимулом и отсутствием реакции.
- Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Поместите наркотизированных мыши на вентральной стороне и осторожно закрепите каждой конечности с гипоаллергенные ленты, чтобы создать мягкий напряженность в конечности, чтобы быть введены. Анестезия поддерживается с помощью изофлюрановая, доставлено через испаритель точность и носовой конус.
- Очистите место инъекции с Betadine, затем снова с 70% спирта. Повторите эту процедуру еще два раза. Убедитесь, что не распущенные волосы остается на операционном поле.
- Сделайте разрез 1 см с небольшой ножницами около 2 мм ниже и параллельно к бедренной кости. Убрать кожи пинцетом боково подвергать мышц под.
- Седалищный нерв проходит глубоких мышц ягодичной и двуглавой мышцы бедра. Разделить эти две мышцы вдоль фасциальных плоскости с маленькие ножницы и разоблачить седалищного нерва под. Бесплатный нерв от окружающих мышц с помощью тупого рассечение.
- Сделать 3 мкл раковых клеток (около 50 000 клетки) из гранул в шприц 10 мкл.
Примечание: в качестве альтернативы, нарисуйте 3 мкл PBS как элемент управления. - Место небольшой металлической лопаткой под нерва точке впрыска для поддержки. При визуализации с микроскопом рассечения Вставьте иглу в нерв против металла базы, ведение иглы параллельно нерва как можно скорее после вставки. Будьте осторожны, чтобы не проколоть через заднюю часть нерва. Свести к минимуму обработку нерва, насколько это возможно, на протяжении всего этого процесса.
- Медленно вдохнуть в нерва более 5 s. Формирование шарик в области инъекции показывает хороший инъекции. Затем оставьте иглу в место для 3 s перед удалением иглу осторожно. Сохраняя иглу в место для 3 s минимизирует обратного потока из нервных клеток.
Примечание: Инъекции могут выполняться к дистальной нервов или спинного мозга. Важно, чтобы оставаться неизменными в течение ряда экспериментов. Если клетки разлива снаружи, животное не должны включаться в анализ эксперимента. С опытом работы эти события очень редки. - Возвращение нерва в исходное положение. Обложка нерва с вышележащих мышц. Лечить мышей с надлежащей анальгезии, а затем закройте кожи с 5-0 нейлон швы.
- Поместите курсор мыши только в чистой клетке для наблюдения во время восстановления, до тех пор, пока он полностью пробуждается от анестезии.
Примечание: Это занимает 5-15 мин для животного, чтобы восстановить полное сознание. До тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency животное не присмотра. Животное не возвращается в компании других животных до тех пор, пока полностью выздоровел. После этого оценки восстановления по крайней мере один раз каждые 24 часа за 72 ч.
3. седалищного нерва добыча
- На postop день #7 усыпить мышей с CO2. Поместите курсор мыши на его вентральной стороне и стабилизировать Дистальная конечностей с помощью булавки.
- Удалите кожу на спинной стороне вводят конечностей и туловища.
- Использование тупой рассечение, разоблачить седалищного нерва глубоких мышц.
- Курсы нерва между подвздошной кости и крестце. Чтобы иметь доступ к нерва в области спинного мозга, отдельные две кости. Сначала вставьте закрытые ножницы в узкой области, где находится седалищного нерва, а затем откройте Ножницы удерживая мышь. Быть деликатной и поддерживать целостность седалищного нерва при вскрытие.
- Тщательно анализировать седалищного нерва дистально конца бедренной кости и проксимально спинного мозга.
- Примечание: Вторглись нервы чрезвычайно хрупка и подвержена разрыва при растяжении или насильственное обращение.
- Урожай нерв от первой резки его дистального конца. Аккуратно поднимите нерва, освобождая его от прилегающих тканей. Вырежьте нерва в проксимальном конце, как можно ближе к его выхода из позвоночника.
- Запись, а затем полная длина вторжения с помощью штангенциркуль. Это макроскопических оценка носит лишь ориентировочный характер.
4. нерва обработки и количественная оценка
- Внедрите расчлененных нерва в октября соединения. Убедитесь убедитесь разместить нервы продольно и как плоские в нижней части формы как можно скорее.
- Указывают на кассету в проксимальном и дистальном части нерва, отметив письмо Р и D.
- Место встраиваемых нервы на вершине сухой лед, если они не являются секционного немедленно. Образец может быть сохранены-80 ° c в течение нескольких недель.
- В разделе образцы используя микротом криостата на 5 мкм толщина и место секций на стеклянных вставках. Если возможно Установите 2 нерва секции на слайд. Укажите проксимальной части нерва.
- Пятно слайды с помощью H & E пятнать12.
- Сканировать разделы окрашенных нерва с слайд сканер, который обеспечивает высоким разрешением цифровые данные.
- С помощью изображений программное обеспечение, подсчитать длину вторжения, нажав на кнопку измерение расстояния, площадь вторжения, или других желаемых параметров. Для хорошей оценки длины вторжения используйте несколько разделов (2-4) же нерва.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод описывает хирургической имплантации поджелудочных клеток рака в мышиных седалищного нерва для создания модели в vivo количественной нерва вторжения. Рисунок 1 иллюстрирует анатомического расположения седалищного нерва и месте инъекции. Рисунок 2 показывает два седалищного нервов обнаженной мыши. PBS вводят нерва (слева) можно сравнить с нерва, вводится с MiaPaCa-2 раковые клетки (справа). Вводится с раковые клетки нерва проникли опухоли и появляется толще и темнее, чем нерва, вводится с PBS.
Рисунок 3 показывает количественные различия вторжения седалищного нерва клеток поджелудочной железы Panc02H7 дикого типа и NCAM KO мышей. NCAM KO мышей, мышей, в которых молекулы нейронные клеточной адгезии молекулы адгезии 1 является несовершенным13. С помощью изображений программное обеспечение определена длина и площадь вторжения. Вторжение было обнаружено значительно сокращена в NCAM KO мышей7.
Рисунок 1 : Мышь седалищного нерва и узел впрыска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Два расчлененный седалищного нервов мыши. PBS вводят нерва (слева) и нерва инъекции с раком MiaPaCa-2, проявленную клетки (справа). Черные стрелки показывают месте инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : H & E продольных секций седалищного нервов, вводится с Panc02H7 раковые клетки в дикого типа и NCAM KO мышей. Белые стрелки указывают на сайте инъекций и проксимальной части спинного мозга. Черные стрелки указывают длину вторжения с соответствующими значениями (мм). Линейки: 5 мм (лучших изображений) и 0,2 мм (фото внизу). Количественная оценка нерва вторжения, как измеряется длина и площадь вторжения. Данные представляют собой среднее ± SD. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), ** P < 0,005, *** P < 0.0005 с использованием t-тест. (Результаты от Deborde и др., 20167). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы описываем в vivo мышиных модель рассасывании вторжения, который позволяет для количественной оценки седалищного нерва вторжения поджелудочных клеток рака. Эта модель позволяет изучение молекулярных механизмов нерва вторжения. Успешные эксперименты с использованием этого метода требуется тщательный подход к три критических этапов процесса: 1 впрыска раковых клеток (шаги 2.7, 2.8), 2 Добыча вторглись нервов (шаг 3.4) и 3) обработка собранного нервов (шаг 4.1).
Впрыска должно быть сделано с большой осторожностью, чтобы избежать проколов через заднюю стенку нерв, который приводит к потере раковых клеток. После того, как игла находится в месте, впрыска должно быть сделано на темп медленный и стабильный свыше 5 s для предотвращения гидравлических силу от метательного рак клеток слишком далеко вперед от точки инъекции. Оставьте иглу в нерва после инъекции для дополнительных 3 s будет свести к минимуму обратно потока и рак клеток утечки. Во время извлечения седалищного нерва рассечение должен быть очень нежным, как вторглись седалищного нерва является очень хрупким. Вторжения рака нарушает нормальной клеточной организации седалищного нерва. Даже несмотря на то, что появляются вторглись нервы утолщаются в диаметре, по сравнению с не вводили или не вторглись нервы, они более подвержены разорвать даже незначительные растяжения и манипуляции. Во время внедрения подакцизным нерва в OCT для обработки, очень важно застраховать, что нерв укладывается полностью плоской на плесень. Этот шаг для разрезания образца позволяет захватить всю длину нерва для надлежащего анализа. Твердые опухоли нерва часто необходимо быть обрезаны, чтобы предотвратить сегмента нерва проксимальнее опухоли от повышения нерв от нижней части формы. По всей длине нерва должны быть заложены абсолютно плоский против плесени.
Многие изменения могут рассматриваться при использовании данного протокола. Когда небольшой металлической лопаткой не может находиться под седалищного нерва, вместо него может использоваться поверхности пару широкий щипцов. Корнцанг может использоваться держать иглу на месте после вставки, хотя минусы такого подхода являются представление уменьшилось инъекций и потенциал, чтобы раздавить нерва, если применяется чрезмерная сила. Другой способ заключается в использовании тонкой щипцы поднять нерв, затем открыть щипцы растянуть нервы. Этот метод проще выполнять и обеспечивает напряженности и стабилизации во время инъекции, но может привести к повреждению нерва с чрезмерным растяжением нерва. Инъекции может быть сделано в проксимальном и дистальном направлении, но мы обнаружили, что в обоих случаях направление вторжения рака обычно находится ближе к спинного мозга. Поэтому мы предпочитаем дистально инъекций для дальнейшей минимизации гидравлической силой, которая может подтолкнуть раковые клетки к спинного мозга и смешаем позднее меры длины вторжения. Мы рекомендуем, что важно быть последовательным в выборе направления инъекции в течение ряда экспериментов.
Хотя мы представляем модель сингенных прививки, подобный метод может использоваться для ксенотрасплантатов человеческих раковых клеток в иммунодефицитных мышей, с незначительными вариациями. Ксенотрасплантатов обнаженной мышей может требуется длительный рака вторжения произвести аналогичные длины нерва вторжения в сингенных модели. Может также использоваться различные рак клеточных линий. PNI не только широко распространены в рак поджелудочной железы, но и из головы и шеи, простаты и рак кожи. Наша лаборатория успешно придала обнаженной мышей в седалищный нерв с людского поджелудочного рака клеточных линий MiaPaCa-2 и Panc17,14,15.
Возможные неблагоприятные события включают зияние раны, как мышей иногда жевать их швы, что приводит к открытию раны. В этом случае потребуется повторно сшитые рану. Мы проверяем раны ежедневно для первых 3 послеоперационных суток. Мышей может также прихрамывать незначительные послеоперационные сутки, вероятно из-за боли от как хирургическая процедура, а также вторжение в их седалищного нерва с раком. Это обычно не достаточно тяжелыми и потребовать обезболивающее.
Эта модель имеет ограничения. Некоторое количество растяжения и защемления нерва во время процедуры может создать повреждения нерва. Кроме того трудно контролировать точное количество вдаваясь в нервных клеток. Кроме того эта модель ограничивается исследование клеток, которые уже вторглись нервы. Это не модель для изучения взаимодействия нервов с раковых клеток, расположенных в первичной опухоли. Основной недостаток использования седалищного нервов против нервов желудочно-кишечного тракта является, что седалищного нерва не является сайтом метастатического рака поджелудочной железы. Разница в состав и характер волокон нерва может повлиять вторжения. Однако доступность и очень маленький размер поджелудочной железы нервов не допустит такого исследования.
Наши основные предложения для начинающих будет удалить волосы в широкой области вокруг планируемого разрез сайтов, так что достопримечательности могут быть легко идентифицированы и чтобы убедиться, иметь устойчивое положение перед началом для вставки. После многих инъекции исполнитель должны иметь возможность получить 100% животных с нерва вторжения.
Эта модель позволяет для изучения взаимодействия между раком и нервы в животной модели. Она может применяться к широкий спектр онкологических исследований с использованием генетически измененных мышей, раковые клетки или оба. Фармакологических препаратов против вторжения опухоли по нервам также могут быть тестированны путем сравнения Длина и площадь вторжения между группами лечения и управления. Эти различные возможные приложения делают эту модель чрезвычайно универсальный и мощный инструмент для изучения PNI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают технические услуги, предоставляемые Фондом молекулярных цитологии и животных фонд Мемориал Слоун Kettering Рак центр. Эта работа была поддержана NIH грантов CA157686 (РЖ Wong) и CA008748 Р30 (Мемориал Слоун Kettering Рак центр поддержки Грант).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse | Number and age variable depending on experimental needs | ||
| Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) | Any | Steps 1.1, 1.2, 1.3. | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Falcon | 352098 | Step 1.1 |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Axygen | MCT-150-C-S | Step 1.2 |
| Electric razor | WAHL | 9962 | Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent |
| Isoflurane, 250 mL | Baxter | 1001936060 | Step 2.2 |
| Hypoallergenic surgical tape | 3M Blenderm | 70200419342 | Step 2.3 |
| Betadine Swapsticks | PDI | SKU 41350 | Step 2.4 |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 | Step 2.4 |
| Sterile surgical tools (scissors and forceps) | Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5 | ||
| 10 μL Hamilton syringe | Hamilton | 80308 | Steps 2.7, 2.8 |
| Steel Micro spatula | Fisher Scientific | S50823 | Step 2.7 |
| Dissecting microscope | Step 2.7 | ||
| Bupivacine, 1 g | Enzo Life Sciences | BML-NA139-0001 | Step 2.9. Reconstitute to 0.5% |
| 5-0 Nylon suture | Ethicon | 698H | Step 2.9 |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Step 4.1 |
| Tissue-Tek Cryomold Molds | VWR | 25608-916 | Step 4.1 |
References
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11 (10), 695-707 (2011).
- Deborde, S., Wong, R. J. How Schwann cells facilitate cancer progression in nerves. Cell Mol Life Sci. 341 (177-186), 1236361-1236416 (2017).
- Abiatari, I., et al. Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma. Mol Cancer Ther. 8 (6), 1494-1504 (2009).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Gil, Z., Cavel, O., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).
- Deborde, S. T., et al. Schwann cells induce cancer cell dispersion and invasion. J Clin Invest. 126 (4), 1538-1554 (2016).
- Pour, P. M., Egami, H., Takiyama, Y. Patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implications. Gastroenterology. 100 (2), 529-536 (1991).
- Eibl, G., Reber, H. A. A xenograft nude mouse model for perineural invasion and recurrence in pancreatic cancer. Pancreas. 31 (3), 258-262 (2005).
- Stopczynski, R. E., et al. Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Res. 74 (6), 1718-1727 (2014).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13 (21), 6479-6485 (2007).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Cremer, H., et al. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- He, S., et al. The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion. Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).
- He, S., et al. GFRα1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling. P Natl Acad Sci USA. , 02944 (2014).
