Summary
Describimos un modelo murino en vivo de invasión perineural por células de cáncer pancreático syngeneic de inyección en el nervio ciático. El modelo permite la cuantificación del grado de invasión del nervio y apoya la investigación de los mecanismos celulares y moleculares de la invasión perineural.
Abstract
Las células cancerosas invaden los nervios a través de un proceso denominado la invasión perineural (PNI), en que el cáncer de las células proliferan y migran en el microambiente del nervio. Este tipo de invasión es exhibido por una variedad de tipos de cáncer y se encuentra muy frecuentemente en el cáncer de páncreas. El tamaño microscópico de fibras nerviosas en páncreas de ratón hace que el estudio de PNI difícil en modelos murinos de orthotopic. Aquí, describimos un modelo de heterotopic en vivo de PNI, donde inyectamos la línea celular de cáncer de páncreas syngeneic Panc02-H7 en el nervio ciático murino. En este modelo, nervios ciáticos de ratones anestesiados son expuestos e inyectados con las células cancerosas. Las células cancerosas invaden en los nervios proximalmente hacia la médula espinal desde el punto de inyección. Los nervios ciáticos invadidos entonces son extraídos y procesados con OCT para secciones congeladas. H & E y tinción de inmunofluorescencia de estas secciones permiten la cuantificación del grado de invasión y los cambios en la expresión de la proteína. Este modelo puede aplicarse a una variedad de estudios sobre PNI dada su versatilidad. Usando ratones con modificaciones genéticas diferentes o diferentes tipos de células cancerosas permite para la investigación de los mecanismos celulares y moleculares de la PNI y para tipos de cáncer diferentes. Además, los efectos de agentes terapéuticos en la invasión del nervio pueden ser estudiados mediante la aplicación de tratamiento a estos ratones.
Introduction
Los nervios forman un microambiente tumoral específica que estimula cáncer crecimiento y migración1,2,3. La invasión perineural (PNI) es el proceso a través del cual cáncer células invaden en y alrededor de los nervios. Puede considerarse como una única vía de metástasis ya que invasión de cáncer se extiende a los sitios de origen a lo largo de los nervios. PNI se encuentra en varios tipos de cáncer incluyendo páncreas, próstata, cabeza y cuello, salival, cervical y cáncer colorrectal con una incidencia que van desde 22% a 100%1,2. PNI es asociado con dolor y se correlaciona con mal pronóstico y peor supervivencia tarifas1,2.
Desarrollando modelos de invasión perineural es esencial para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares de este proceso y a prueba de agentes terapéuticos candidato para disminuir PNI. In vitro métodos de estudio de las interacciones entre los cánceres y los nervios son el cocultivo de las células cancerosas con nervio explantes4, raíz dorsal ganglios5,6,7o con células específicas del nervio microambiente como Schwann las células7. Métodos in vivo , sin embargo, son más fisiológicamente relevantes, incluyen el uso de modelos de ratón de cáncer que el cáncer ha sido inducido o trasplantado y tienen la ventaja de la contabilidad para el microambiente entero del nervio. En orthotopic del modelos de cáncer de páncreas o próstata, PNI ha sido reportados8,9,10 y puede registrar la incidencia de la PNI, pero debido al pequeño tamaño de los nervios en los órganos, es difícil ver el nervio todo y por lo tanto, para cuantificar el grado de PNI. El modelo que se describe aquí es un modelo en vivo de PNI en que el cáncer de las células se inyectan en el nervio ciático de los ratones a través de una sencilla intervención quirúrgica11. El trasplante heterotópico invade dentro del nervio hacia la médula espinal. Puede medirse la longitud de la invasión del nervio desde el sitio de inyección en la médula espinal, así como el volumen del cáncer dentro del nervio. Lo importante es el nervio invadido también puede recogerse para una variedad de análisis incluyendo análisis microscópicos y moleculares. Una variedad de células de cáncer puede ser probada, y los ratones de host que han modificado genéticamente o tratados con compuestos específicos pueden utilizarse también. Este ensayo potente permite a las células cancerosas y el microambiente de host modificado para la investigación en los mecanismos de PNI.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales sujetos fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center.
1. preparación de las células cancerosas
- Cosecha el confluente Panc02 H7 células con tripsina 0.25% por 5 min a 37 ° C. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL.
Nota: Las células se cultivan en frasco T-225, que contiene aproximadamente 12 x 106 células cada frasco en la confluencia del 80% y 4 mL tripsina / matraz se utiliza. - Centrifugar las células a x 900 g a 4° C por 5 min lavado las células por resuspender las células pellet en 1 mL de PBS (transfiriendo hacia arriba y hacia abajo dos veces) y transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en hielo.
- Centrifugar las células a x 900 g a 4° C por 5 min y descarte el sobrenadante sin perturbar el pellet. No las células sedimentadas en hielo hasta su inyección.
2. preparación de la cirugía y ratones
Nota: se utilizan ratones C57BL/6J 8 semanas de edad, hombres y mujeres en este estudio. Las condiciones de la cirugía sigue las reglas IACUC de nuestra institución. Los instrumentos se esterilizan, se desinfecta la superficie de trabajo quirúrgico, se desinfecta el animal y el cirujano usa guantes estériles.
- El día antes de la cirugía, anestesiar el ratón utilizando 2% isoflurano y sacar la piel a lo largo de la longitud del fémur en el lado dorsal con una navaja fina o con un agente de eliminación de pelo químicos.
- En el día de la cirugía, anestesiar los ratones con isofluorane 2% en una cámara de inducción. Confirmar la anestesia por un estímulo del pellizco del dedo del pie y la falta de respuesta.
- Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.
- Coloque el ratón anestesiado en su lado ventral y asegure suavemente cada miembro con cinta hipoalergénica para crear tensión leve en el miembro que se inyecta. La anestesia se mantiene con isoflurano suministra a través de un vaporizador de precisión y un cono de nariz.
- Limpie el sitio de la inyección con Betadine, entonces otra vez con alcohol al 70%. Repita este proceso dos veces más. Asegúrese de que no suelta pelo permanece en el campo quirúrgico.
- Haga una incisión de 1 cm con pequeñas tijeras unos 2 mm por debajo y paralelo al fémur. Retraiga la piel con pinzas lateralmente para exponer los músculos debajo.
- El nervio ciático corre profundo a los músculos maximus del glúteo y del bíceps femoral. Separar estos dos músculos a lo largo de un plano fascial con pequeñas tijeras y exponer el nervio ciático por debajo. Liberar el nervio de los músculos circundantes mediante disección Roma.
- Dibujar 3 μL de células de cáncer (aproximadamente 50.000 células) pellets en una jeringa de 10 μL.
Nota: También puede dibujar 3 μL de PBS como un control. - Coloque una pequeña espátula de metal por debajo del nervio en el punto de inyección para apoyo. Bajo visualización con un microscopio de disección, inserte la aguja en el nervio contra la base metálica, manteniendo la aguja como paralelo al nervio como sea posible al insertar. Tenga cuidado de no perforar a través de la parte posterior del nervio. Reducir al mínimo la manipulación del nervio lo más posible a lo largo de este proceso.
- Inyectar lentamente en el nervio sobre 5 s. Una formación de un bulbo en la zona de la inyección indica una buena inyección. Entonces deje la aguja en lugar de 3 s antes de retirar la aguja suavemente. Mantener la aguja en su lugar para 3 s minimiza el reflujo de las células de los nervios.
Nota: La inyección puede realizarse hacia el distal del nervio o la médula espinal. Es importante permanecer constantes dentro de un conjunto de experimentos. Si las células se derrame fuera, el animal no debe incluir en el análisis del experimento. Con experiencia, estos eventos son muy raros. - Retorno del nervio a su posición original. Cubierta de los nervios con los músculos suprayacentes. Tratar a los ratones con analgesia adecuada y luego cierre la piel con suturas de Nylon 5-0.
- Coloque el ratón en una jaula limpia para la observación durante la recuperación, hasta que completamente despierta de la anestesia.
Nota: Tarda 5-15 min para el animal recuperar el sentido completo. El animal no quedo desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. El animal no es devuelto a la compañía de otros animales hasta que se recuperó completamente. Después de eso, evaluar la recuperación al menos una vez cada 24 h durante 72 h.
3. nervio ciático extracción
- #7 el día postop, eutanasia a los ratones con CO2. Coloque el ratón en su lado ventral y estabilizar las extremidades distales usando las clavijas.
- Retirar la piel en el lado dorsal de la extremidad inyectada y el torso.
- Mediante disección Roma, exponer el nervio ciático profundo a los músculos.
- Los cursos del nervio entre el Ilion y el sacro. Para tener acceso al nervio en la región de la médula espinal, se separan los dos huesos. Primero se debe introducir tijeras cerradas en la zona estrecha donde se encuentra el nervio ciático y luego las tijeras mientras sostiene el ratón. Ser delicado y mantener la integridad del nervio ciático durante la disección.
- Cuidadosamente se diseca el nervio ciático distal al extremo del fémur y proximal de la médula espinal.
- Nota: Los nervios invadieron son extremadamente frágiles y propensos a la rotura bajo tensión o manejo enérgico.
- Cosecha el nervio mediante la primera reducción de su extremo distal. Levante cuidadosamente el nervio mientras que liberar del tejido adyacente. Cortar el nervio en el extremo proximal, lo más cerca posible de su salida de la columna vertebral.
- Registro y longitud bruta de invasión usando un calibrador a Vernier. Esta estimación macroscópica es sólo indicativa.
4. nervio procesamiento y cuantificación
- Incrustar el nervio disecado en OCT compuesto. Asegúrese de que colocar nervios longitudinalmente y como plana en la parte inferior del molde como sea posible.
- Indicar en el cartucho de la parte proximal y distal del nervio marcando la letra P y D.
- Coloque los nervios embebidos en la cima de hielo seco, si no se seccionaron inmediatamente. Muestra puede conservarse a-80 ° C durante varias semanas.
- Muestras de la sección utilizando un micrótomo criostático a 5 μm grueso y lugar secciones sobre portaobjetos de vidrio. Si es posible, colocar 2 secciones del nervio por diapositiva. Indicar el lado proximal del nervio.
- Tinción con H & E tinción de12diapositivas.
- Analizar digitalmente las secciones manchadas del nervio con un escáner de diapositivas que proporciona datos digitales de alta resolución.
- Utilizando el software de imágenes, cuantificar la longitud de la invasión haciendo clic en el botón de medir distancia, zona de invasión, o de otro deseado parámetros. Para una buena estimación de la longitud de la invasión, utilice las secciones múltiples (2 a 4) del mismo nervio.
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Representative Results
Este método describe la implantación quirúrgica de las células de cáncer de páncreas en el nervio ciático murino para crear un modelo en vivo de invasión del nervio cuantificables. La figura 1 muestra la localización anatómica del nervio ciático y el sitio de inyección. La figura 2 muestra los dos nervios ciático de un ratón desnudo. Un nervio de PBS inyectado (izquierda) puede ser comparado con un nervio inyectado con células de cáncer de MiaPaCa-2 (derecha). El nervio inyectado con las células cancerosas es infiltrado por tumor y aparece más grueso y más oscuro que el nervio inyectado con PBS.
La figura 3 muestra las diferencias cuantificables de la invasión del nervio ciático por Panc02H7 de la célula de cáncer de páncreas en ratones KO de NCAM y tipo salvaje. Ratones KO de NCAM son ratones en la que la molécula de adhesión celular neural de la molécula de adhesión 1 es deficiente13. Longitud y área de invasión se han cuantificado utilizando el software de imágenes. Invasión se encontró una reducción significativa en ratones KO de NCAM7.
Figura 1 : El nervio ciático de ratón y en el sitio de inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Los dos disecaron los nervios ciático de un ratón. Un PBS inyecta nervio (izquierda) y un nervio inyectado con el cáncer de MiaPaCa-2 se muestran las células (derecha). Las flechas negras muestran el sitio de inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : H & E Longitudinal secciones de nervios ciático inyectados con las células de cáncer de Panc02H7 de tipo salvaje y ratones KO de NCAM. Las flechas blancas indican el sitio de inyección y parte proximal de la médula espinal. Las flechas negras indican la longitud de la invasión con los valores correspondientes (mm). Barra de escala: 5 mm (imágenes superiores) y 0,2 mm (imágenes abajo). Cuantificación de la invasión del nervio, según lo medido por la longitud y área de invasión. Los datos representan la media ± SD. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), ** P < 0.005, *** P < 0,0005 utilizando la prueba t. (Resultados del Deborde et al., 20167). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo se describe un modelo murino en vivo de la invasión perineural que permite la cuantificación de la invasión del nervio ciático por las células de cáncer de páncreas. Este modelo permite el estudio de mecanismos moleculares de la invasión del nervio. Experimentos exitosos con esta técnica requieren un cuidadoso enfoque a tres pasos críticos en el proceso de: 1) la inyección de las células cancerosas (pasos 2.7, 2.8), 2) la extracción de nervios invadidos (paso 3.4) y 3) procesamiento de nervios cosechados (paso 4.1).
La inyección debe hacerse con gran precaución para evitar punción a través de la pared posterior del nervio, que conduce a una pérdida de las células cancerosas. Una vez que la aguja esté en su lugar, la inyección debe hacerse a un ritmo lento y constante durante 5 s para evitar que la fuerza hidráulica impulsando el cáncer las células demasiado lejos hacia adelante desde el punto de inyección. Dejar la aguja en el nervio después de la inyección para 3 adicionales s será minimizar las fugas de célula posterior flujo y cáncer. Durante la extracción del nervio ciático, la disección debe ser muy suave como el nervio ciático invadido es muy frágil. Invasión de cáncer interrumpe la organización celular normal del nervio ciático. Aunque aparecen los nervios invadieron espesar en diámetro en comparación con el no inyecta o no invadieron los nervios, son más propensos a romper con incluso menor estiramiento y manipulación. Durante la inclusión del nervio suprimido en OCT para el procesamiento, es muy importante para asegurarse de que el nervio se coloca completamente plana sobre el molde. Este paso permite el seccionamiento de la muestra para capturar toda la longitud del nervio para el análisis adecuado. Tumor sólido en el nervio a menudo debe recortarse para evitar que el segmento del nervio proximal al tumor de plantear el nervio de la parte inferior del molde. Toda la longitud del nervio debe ser puesta completamente plana contra el molde.
Muchas modificaciones se pueden considerar durante el uso de este protocolo. Cuando una pequeña espátula de metal no está disponible para ser colocado bajo el nervio ciático, la superficie de un par de fórceps amplia se puede utilizar. Un fórceps puede utilizarse para mantener la aguja en su lugar después de la inserción, aunque las desventajas de este enfoque son una visión disminuida de la inyección y el potencial para aplastar el nervio si se usa fuerza excesiva. Otra forma es utilizar una pinza fina para levantar el nervio, luego abrir la pinza para estirar los nervios. Este método es más fácil de ejecutar y proporciona la tensión y la estabilización durante la inyección, pero puede dañar el nervio con un estiramiento excesivo del nervio. La inyección puede hacerse en sentido proximal o distal, pero hemos encontrado que en ambos casos, la dirección de la invasión de cáncer suele ser hacia la médula espinal. Por lo tanto, se prefiere inyectar distal para minimizar aún más la fuerza hidráulica que puede empujar a las células cancerosas hacia la médula espinal y confundir las medidas posteriores de longitud de la invasión. Se aconseja que es importante ser consistente en la elección de la dirección de la inyección dentro de un conjunto de experimentos.
Aunque se presenta un modelo de syngeneic injerto, una técnica similar puede utilizarse para las células cancerosas humanas de xenoinjertos en ratones inmunodeficientes, con sólo ligeras variaciones. Xenoinjertos en ratones desnudos mayo requiere períodos de invasión del cáncer para producir longitudes similares de invasión del nervio como en modelos syngeneic. También pueden utilizarse líneas celulares de cáncer diferentes. PNI no sólo es predominante en el cáncer de páncreas, pero también de la cabeza y cuello, próstata y cánceres de piel. Nuestro laboratorio ha inyectado con éxito ratones desnudos en el nervio ciático con líneas celulares de cáncer pancreático humano MiaPaCa-2 y Panc17,14,15.
Posibles efectos adversos incluyen dehiscencia de la herida, como los ratones de vez en cuando mastiquen sus puntadas dando por resultado la abertura de la herida. En ese caso, la herida tendría que volver a cosido. Comprobamos la herida todos los días para los 3 primeros días postoperatorios. Los ratones pueden también caminar con una leve cojera postoperatoriamente, probablemente debido al dolor tanto el procedimiento quirúrgico así como invasión de su nervio ciático con el cáncer. Esto no suele ser lo suficientemente grave como para requerir analgésicos.
Este modelo tiene limitaciones. Cierta cantidad de estiramiento y compresión del nervio durante el procedimiento podría crear daños en el nervio. Además, es difícil controlar el número exacto de las células en el nervio. Además, este modelo se limita al estudio de las células que ya han invadido los nervios. No es un modelo para el estudio de la interacción de los nervios con las células cancerosas en el tumor primario. La principal desventaja del uso de los nervios ciáticos y los nervios del tracto gastrointestinal es que el nervio ciático no es un sitio metastásico del cáncer de páncreas. La diferencia en la composición y la naturaleza de las fibras nerviosas podría influir en la invasión. Sin embargo, la accesibilidad y tamaño muy pequeño de los nervios pancreáticos no permitiría ese tipo de estudio.
Nuestras sugerencias claves para los principiantes sería eliminar el pelo en una amplia zona alrededor de los sitios de la incisión prevista para que las señales se pueden identificar fácilmente y tener una posición estable antes de comenzar a inyectar. Después de muchas inyecciones, el intérprete debe ser capaz de obtener 100% de animales con invasión del nervio.
Este modelo permite el estudio de las interacciones entre los cánceres y los nervios en un modelo animal. Puede ser aplicado a una amplia gama de estudios oncológicos mediante el uso de ratones modificados genéticamente, las células cancerosas o ambos. Tratamientos farmacológicos contra la invasión del tumor a lo largo de los nervios también pueden comprobarse comparando la longitud y área de invasión entre los grupos tratamiento y control. Estas posibles aplicaciones hacen de este modelo una herramienta extremadamente versátil y potente para el estudio de PNI.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen los servicios técnicos prestados por la citología molecular y el animal del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH CA157686 (a R.J. Wong) y P30 CA008748 (beca de apoyo del Memorial Sloan Kettering Cancer Center).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse | Number and age variable depending on experimental needs | ||
| Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) | Any | Steps 1.1, 1.2, 1.3. | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Falcon | 352098 | Step 1.1 |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Axygen | MCT-150-C-S | Step 1.2 |
| Electric razor | WAHL | 9962 | Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent |
| Isoflurane, 250 mL | Baxter | 1001936060 | Step 2.2 |
| Hypoallergenic surgical tape | 3M Blenderm | 70200419342 | Step 2.3 |
| Betadine Swapsticks | PDI | SKU 41350 | Step 2.4 |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 5110 | Step 2.4 |
| Sterile surgical tools (scissors and forceps) | Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5 | ||
| 10 μL Hamilton syringe | Hamilton | 80308 | Steps 2.7, 2.8 |
| Steel Micro spatula | Fisher Scientific | S50823 | Step 2.7 |
| Dissecting microscope | Step 2.7 | ||
| Bupivacine, 1 g | Enzo Life Sciences | BML-NA139-0001 | Step 2.9. Reconstitute to 0.5% |
| 5-0 Nylon suture | Ethicon | 698H | Step 2.9 |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Step 4.1 |
| Tissue-Tek Cryomold Molds | VWR | 25608-916 | Step 4.1 |
References
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