En In Vivo murina ischiasnerven modell av Perineural Invasion

Summary

Vi beskriver en i vivo murina modell av perineural invasion genom att injicera syngena pankreascancer celler i ischiasnerven. Modellen möjliggör kvantifiering av omfattningen av nerv invasion, och stöder utredningen av de cellulära och molekylära mekanismerna av perineural invasion.

Abstract

Cancercellerna invaderar nerver genom en process som kallas perineural invasion (PNI), i vilken cancer celler förökar sig och vandrar i den nerv mikromiljö. Denna typ av invasion är utställda av en mängd olika typer av cancer, och mycket ofta finns cancer i bukspottskörteln. Mikroskopiska storlek av nervfibrer inom mus bukspottkörteln gör studien av PNI svårt i ortotop murina modeller. Här beskriver vi en heterotopisk i vivo modell av PNI, där vi injicera syngena pankreascancer cellinje Panc02-H7 i murina ischiasnerven. I den här modellen är höftnerver sövda möss utsatta och injiceras med cancerceller. Cancercellerna invaderar i nerverna proximalt mot ryggmärgen från peka av injektion. Invaderade höftnerver sedan extraheras och bearbetas med OCT för frysta snittning. H & E och immunofluorescens färgning av dessa avsnitt kan kvantifiering av både graden av invasionen och förändringar i proteinuttryck. Denna modell kan tillämpas på en mängd studier på PNI ges dess mångsidighet. Om du använder möss med olika genetiska modifieringar och/eller olika typer av cancerceller kan för utredning av PNI cellulära och molekylära mekanismer och för olika cancertyper. Dessutom kan effekterna av terapeutiska medel på nerv invasion studeras genom att dessa möss behandling.

Introduction

Nerverna bildar en specifik tumör närmiljön som främjar cancer tillväxt och migration^1,2,3. Perineural invasion (PNI) är den process genom vilken cancer celler invadera i och runt nerverna. Det kan betraktas som en unik rutt av metastaser eftersom cancer invasion sträcker sig från platserna för ursprung längs nerverna. PNI finns i flera typer av cancer inklusive bukspottskörteln, prostatacancer, huvud och hals, saliv, livmoderhalscancer, och kolorektal cancer med en incidens som sträcker sig från 22% till 100%^1,2. PNI är förknippad med smärta och korrelerar med dålig prognos och sämre överlevnad priser^1,2.

Utveckla modeller för perineural invasion är viktigt att belysa de cellulära och molekylära mekanismerna av denna process, och att testa kandidaten terapeutiska medel för att minska PNI. In vitro -metoder för att studera interaktioner mellan cancer och nerver inkluderar samtidig kulturen av cancerceller med nerv bladsticklingar⁴, dorsalrotsganglier ganglier^5,6,7, eller specifika celler från nerv celler mikromiljö såsom Schwann⁷. In vivo -metoder, men är mer fysiologiskt relevanta, inkluderar användning av cancer musmodeller där cancer har inducerad eller transplanteras och har fördelen av redovisning för den hela nerven mikromiljö. I ortotop modeller av bukspottskörteln eller prostata cancer, PNI har varit rapporterade^8,9,10 och incidensen av PNI kan registreras, men på grund av den lilla storleken på nerverna i dessa organ, det är svårt att se hela nerven och därför att kvantifiera omfattningen av PNI. Den modell som vi beskriver här är en in-vivo -modell av PNI i vilken cancer celler injiceras i ischiasnerven möss genom ett enkelt kirurgiskt ingrepp¹¹. Heterotop transplantationen invaderar inom nerven mot ryggmärgen. Längden på nerv invasionen från platsen av injektion till ryggmärgen kan mätas, liksom volymen av cancer inom nerven. Ännu viktigare, kan invaderade nerven också samlas för en mängd olika analyser inklusive mikroskopiska och molekylära analyser. En mängd cancerceller kan testas och värd möss som har modifierats genetiskt eller behandlas med specifika föreningar kan användas också. Denna kraftfulla analys gör att cancercellerna och den värd närmiljön kan ändras för utredning av mekanismerna av PNI.

Protocol

Alla förfaranden med animaliska ämnen godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén vid Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1. beredning av cancerceller

1. Skörda sub konfluenta Panc02-H7 celler med 0,25% trypsin för 5 min vid 37 ° C. Samla in cellerna i ett 15 mL centrifugrör.
   Obs: Cellerna odlas i T-225 kolv, som innehåller ca 12 x 10⁶ celler per kolv på 80% konfluens och 4 mL trypsin / kolv används.
2. Centrifugera cellerna på x 900 g vid 4° C i 5 min. Tvätta cellerna av omblandning cellen pellet i 1 mL PBS (genom pipettering upp och ner två gånger), och överför till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör på is.
3. Centrifugera cellerna igen vid x 900 g vid 4° C i 5 min, och kasta bort vätskefasen utan att störa pelleten. Hålla pelleterat cellerna på is tills injektionen.

2. upprättande av möss och kirurgi

Obs: 8 veckor gamla, manliga och kvinnliga C57BL/6J möss används i denna studie. Kirurgi villkoren följer IACUC regler för vår institution. Instrumenten är steriliserade, kirurgiska arbetsytan desinficeras, djuret desinficeras och kirurgen bär sterila handskar.

1. Dagen före operationen, söva musen använder 2% isofluran och ta sedan bort pälsen längs längden på lårbenet på ryggsidan med antingen en tunn rakblad eller en kemisk hår borttagning agent.
2. Samma dag som operationen, söva möss med 2% isofluorane i en induktion kammare. Bekräfta anesthetization av en tå nypa stimulans och en brist på svar.
3. Applicera vet salva på ögon att förhindra torrhet under narkos.
4. Placera sövda musen på dess ventrala sida och försiktigt säkra varje lem med Allergivänligt tejp för att skapa mild spänning i det ledet som skall injiceras. Anestesi upprätthålls med hjälp av isofluran levereras via en precision spridare och näsan konen.
5. Ren injektionsstället med Betadine, sedan igen med 70% alkohol. Upprepa proceduren ytterligare två gånger. Kontrollera att ingen lös hår kvar på operationsområdet.
6. Gör en 1 cm snitt med liten sax ungefär 2 mm nedanför och parallell till lårbenet. Dra tillbaka huden med pincett sidled för att utsätta musklerna under.
7. Ischiasnerven går djupt till musklerna gluteus maximus och biceps femoris. Separera dessa två muskler längs ett fascian plan med liten sax och exponera ischiasnerven under. Gratis nerven från omgivande muskler med trubbig dissektion.
8. Rita 3 μL av cancerceller (ca 50.000 celler) från pelleten i en 10 μL spruta.
   Obs: Rita alternativt 3 μL av PBS som kontroll.
9. Placera en liten metall spatel under nerven vid tidpunkten för injektion för stöd. Under visualisering med dissekera Mikroskop, stick in nålen i nerven mot metall bas, att hålla nålen som parallell till nerven som möjligt vid insättningspunkten. Var noga med att inte punktera genom baksidan av nerven. Minimera hanteringen av nerv så mycket som möjligt under hela denna process.
10. Injicera långsamt i nerven över 5 s. Ett bildande av en glödlampa i injektionsstället indikerar en bra injektion. Sedan lämnar nålen på plats för 3 s innan du tar bort nålen försiktigt. Att hålla nålen på plats för 3 s minimerar återflödet av cellerna av nerven.
    Obs: Injektion kan utföras mot den distala nerven eller ryggmärgen. Det är viktigt att vara konsekvent i en uppsättning av experiment. Om cellerna spiller utanför, bör djuret inte inkluderas i analysen av experimentet. Med erfarenhet är dessa händelser mycket sällsynta.
11. Returnera nerven till sin ursprungliga position. Täcka nerven med överliggande musklerna. Behandla möss med ordentlig smärtlindring, och stäng sedan huden med 5-0 Nylon suturer.
12. Placera musen ensam i en ren bur för observation under återhämtning, tills det fullt vaknar från anestesi.
    Obs: Det tar 5-15 min för djuret att återfå fullt medvetande. Djuret är inte lämnas utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Djuret returneras inte till företaget av andra djur tills återhämtat sig helt. Därefter utvärdera återhämtning minst en gång varje 24 h för 72 h.

3. ischiasnerven utvinning

1. På postop dagen #7, eutanasi möss med CO₂. Placera musen på dess ventrala sida och stabilisera de distala extremiteter med pinnarna.
2. Ta bort skinnet på ryggsidan av den injicerade extremiteten och torso.
3. Med trubbig dissektion, exponera ischiasnerven djup till musklerna.
4. Den nerv kurser mellan höftbenet och korsbenet. För att ha tillgång till nerven på regionen ryggmärgen, separera de två benen. Först infoga stängda saxen i det smala området där ischiasnerven ligger och öppna sedan saxen medan du håller musen. Vara känslig och behålla integriteten i ischiasnerven under dissektion.
5. Noggrant dissekera ischiasnerven distalt till slutet av lårbenet och proximalt till ryggmärgen.
6. Obs: Invaderade nerver är extremt sköra och benägna att bryta under spänning eller kraftfull hantering.
7. Skörda nerven genom att första klippa dess distala änden. Lyft försiktigt nerven samtidigt befriat den från intilliggande vävnad. Skär nerven på den proximala änden, så nära som möjligt till dess går ut från ryggraden.
8. Spela in sedan brutto längden av invasionen med hjälp av ett skjutmått. Detta makroskopiska uppskattning är endast vägledande.

4. nervskada bearbetning och kvantifiering

1. Bädda in dissekerade nerven i okt förening. Se till att placera nerver längdriktningen och lika platt på botten av formen som möjligt.
2. På kassetten ange den proximala och distala delen av nerven genom att markera bokstaven P och D.
3. Placera inbäddade nerver ovanpå torris, om de inte är delad omedelbart. Provet kunde bevaras vid-80 ° C i flera veckor.
4. Avsnitt exempel med en kryostaten mikrotom på 5 μm tjocklek och plats sektioner på glasskivor. Om möjligt passa 2 nerv sektioner per bild. Ange proximala sidan av nerven.
5. Fläcken diabilder med H & E färgning¹².
6. Digitalt scan målat nerv sektioner med en slide-scanner som ger högupplöst digital data.
7. Med programvara för bildåtergivning, kvantifiera längden på invasionen genom att klicka på knappen åtgärd avstånd, invasion, eller andra önskade parametrar. För en bra uppskattning av längden av invasionen, använda flera avsnitt (2-4) av samma nerv.

Representative Results

Denna metod beskriver kirurgisk implantation av pankreascancer celler i murina ischiasnerven att skapa en in-vivo -modell av kvantifierbara nerv invasion. Figur 1 illustrerar den anatomiska läge av ischiasnerven och injektionsstället. Figur 2 visar två höftnerver av en naken mus. En PBS injiceras-nerv (vänster) kan jämföras med en nerv som injiceras med MiaPaCa-2 cancerceller (höger). Den nerv som injiceras med cancerceller är infiltrerade av tumör och visas både tjockare och mörkare än den nerv som injiceras med PBS.

Figur 3 visar de kvantifierbara skillnaderna av ischiasnerven invasion av pankreascancer cellen Panc02H7 i vildtyp och NCAM KO möss. NCAM KO möss är möss där vidhäftning molekyl neurala-celladhesion molekylen 1 är bristfällig¹³. Längd och area av invasion har kvantifierats med programvara för bildåtergivning. Invasionen var hittade betydligt reducerad i NCAM KO möss⁷.

Figur 1 : Mus ischiasnerven och injektionsstället. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Två dissekeras höftnerver musklick. En PBS injiceras nerv (vänster) och en nerv som injiceras med MiaPaCa-2 cancer celler (höger) visas. Svarta pilarna visar injektionsstället.  Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : H & E längsgående delar av höftnerver injiceras med Panc02H7 cancerceller i vildtyp och NCAM KO möss. Vita pilar indikerar platsen för injektion och proximala sidan av ryggmärgen. De svarta pilarna visar längden på invasion med motsvarande värden (mm). Skalstapeln: 5 mm (topp bilder) och 0,2 mm (botten bilder). Kvantifiering av nerv invasion, mätt som längd och area av invasionen. Uppgifterna representerar medelvärde ± SD. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), ** P < 0,005, *** P < 0,0005 med t-testet. (Resultat från Deborde et al., 2016⁷). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I detta protokoll beskriver vi en in-vivo murina modell av perineural invasion som möjliggör kvantifiering av ischiasnerven invasion av pankreascancer celler. Denna modell gör det möjligt för studier av molekylära mekanismer av nerv invasion. Framgångsrika experiment med denna teknik kräver en noggrann inställning till tre kritiska steg i processen: 1) injektion av cancerceller (steg 2.7, 2.8), 2) utvinning av invaderade nerver (steg 3,4), och 3) bearbetning av skördade nerver (steg 4.1).

Injektionen bör göras med stor försiktighet för att undvika punktering genom den baksida väggen av nerven, vilket leder till en förlust av cancerceller. När nålen är på plats, injektionen bör göras i en långsam och stadig takt över 5 s för att förhindra att den hydrauliska kraften driver cancer celler alltför långt fram från peka av injektion. Lämna nålen i nerven efter injektion för ytterligare 3 s kommer att minimera tillbaka flöde och cancer cell läckage. Under ischiasnerven extraktion, måste dissektion vara mycket skonsam som invaderade ischiasnerven är mycket bräcklig. Cancer invasion stör den normala cellulära organisationen av ischiasnerven. Även om invaderade nerver visas tjockna i diameter jämfört med icke-injiceras eller icke-invaderade nerver, de är mer benägna att bryta med även mindre stretching och manipulation. Under inbäddning av exciderad nerv i okt för bearbetning, är det mycket viktigt att försäkra att nerven är helt platt lagd på mögel. Detta steg kan för snittning av provet att fånga hela längden av nerven för ordentlig analys. Solid tumör på nerven behöver ofta trimmas för att förhindra segmentet nerv proximalt tumören från att höja nerven från botten av formen. Hela längden av nerven måste läggas helt platt mot mögel.

Många ändringar kan anses medan du använder detta protokoll. När en liten metall spatel inte finns placeras under ischiasnerven, kan ytan av ett par breda tången användas i stället. En pincett kan användas att hålla nålen på plats efter införande, även om nackdelar med denna metod är en minskad syn på injektionsstället och potential att krossa nerven om överdrivet våld används. Ett annat sätt är att använda en fin pincett för att lyfta den nerv, sedan öppna tången för att sträcka nerverna. Denna metod är lättare att utföra och ger både spänning och stabilisering under injektion, men kan skada nerven med överdriven stretching av nerven. Injektion kan göras i antingen en proximala eller distala riktning, men vi har funnit att i båda fallen riktning mot cancer invasionen är vanligtvis mot ryggmärgen. Därför föredrar vi injicerar distalt för att ytterligare minimera hydraulisk kraft som kan driva cancercellerna mot ryggmärgen, och blanda ihop senare åtgärder av längden av invasionen. Vi rekommenderar att det är viktigt att vara konsekvent i valet av riktningen av injektion inom en uppsättning experiment.

Även om vi presenterar en modell av syngena ympning, kan en liknande teknik användas för xenograft mänskliga cancerceller i nedsatt immunförsvar möss, med endast små variationer. Xenograft i nakna möss kan krävs längre perioder av cancer invasion att ge liknande längder av nerv invasion som syngena modeller. Olika cancer cellinjer kan också användas. PNI förekommer inte bara i cancer i bukspottkörteln, men också av huvud och hals, prostata, och hudcancer. Vårt labb har framgångsrikt injiceras naken möss i ischiasnerven med mänskliga bukspottskörteln cancer cellinjer MiaPaCa-2 och Panc1^7,14,15.

Möjliga biverkningar inkluderar sår sårruptur, som möss ibland tuggar deras stygn som resulterar i öppnandet av såret. I så fall skulle såret behöver vara åter sydda. Vi kontrollera såret varje dag under de 3 första postoperativa dagarna. Möss kan också gå med en liten hälta postoperativt, sannolikt på grund av smärta från såväl den operationsmetod som invasionen av deras ischiasnerven med cancer. Detta är oftast inte tillräckligt allvarligt för att kräva smärtstillande medicin.

Denna modell har begränsningar. Viss mängd stretching och nyper av nerv under förfarandet kan skapa skador i nerven. Dessutom är det svårt att kontrollera det exakta antalet celler som kommer till nerven. Denna modell är dessutom begränsad till studier av celler som har redan invaderat nerver. Det är inte en modell för att studera samspelet mellan nerver med cancerceller som ligger i den primära tumören. Den största nackdelen med att använda höftnerver kontra nerverna i mag-tarmkanalen är att ischiasnerven inte är en metastasplats för cancer i bukspottskörteln. Skillnaden i sammansättning och arten av nervfibrerna kan påverka invasionen. Tillgänglighet och mycket litet storleksanpassar av bukspottskörteln nerver skulle dock inte tillåta sådan studie.

Våra viktigaste förslag för nybörjare vore att ta bort håret i ett stort område runt planerade snitt webbplatser så att landmärkena lätt kan identifieras och att se till att ha en stabil position innan du börjar injicera. Efter många injektioner, bör modellen kunna få 100% av djur med nerv invasion.

Denna modell tillåter för att studera interaktioner mellan cancer och nerver i en djurmodell. Det kan tillämpas på ett brett utbud av onkologiska studier med hjälp av genetiskt modifierade möss, cancerceller eller båda. Farmakologiska behandlingar mot tumören invasion längs nerverna kan också testas genom att jämföra längd och area av invasionen mellan behandlings-och kontroll. Dessa olika möjliga tillämpningar gör denna modell ett extremt mångsidig och kraftfullt verktyg för att studera PNI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1