Summary
Bitki patojenleri yerinde, özellikle toprak kaynaklı patojenler, hızlı ve doğru tespiti daha fazla inoculum üretim ve alanında bitki hastalıklarının yayılması önlemek için çok önemli olduğunu. Burada bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR algılama sistemi kullanılarak geliştirilen yöntem yerinde tanı alan koşullarında sağlar.
Abstract
Yerinde bitki hastalıklarının tanısında yetiştiricileri için zamanında kararlar hastalığın etkilerini azaltmak hastalık yönetimi stratejileri önceki uygulanması olanaklı kılmak için yararlı bir araç olabilir. Şu anda içinde birçok tanı laboratuvarları, Polimeraz zincir tepkimesi (PCR), özellikle gerçek zamanlı PCR, bitki patojeni algılama için en hassas ve doğru yöntemi olarak kabul edilir. Ancak, laboratuvar tabanlı PCR genellikle pahalı labaratuar donanımları ve vasıflı personel gerektirir. Bu çalışmada toprak kaynaklı patojenler patates yerinde moleküler algılama için potansiyel göstermek için kullanılır. Bu hızlı ve basit iletişim kuralı oluşan manyetik boncuk tabanlı nükleik asit çıkarımı, taşınabilir gerçek zamanlı PCR (fluorogenic assay prob tabanlı) kullanarak sağlanır. Taşınabilir gerçek zamanlı PCR yaklaşım karşılaştırıldığında olumlu ile bir laboratuar tabanlı sistem, olduğunca az DNA'dan 100 kopya olarak tespit Spongospora yeraltı. Burada geliştirilen taşınabilir gerçek zamanlı PCR yöntemi alternatif laboratuvar tabanlı yaklaşımlar ve patojen tanı için yararlı bir yerinde araç olarak hizmet verebilir.
Introduction
Etken patojenler doğru ve hızlı tanımlaması kararlar bitki hastalık yönetimi ile ilgili önemli ölçüde etkiler. Toprak kaynaklı hastalıklar özellikle toprak ortamı son derece büyük bitki göre kitle ve karmaşık, yapım o toprak kaynaklı hastalıklar tüm yönleriyle anlamak için bir meydan okuma olduğu için teşhis etmek zordur. Ayrıca, toprak kaynaklı hastalıklar erken enfeksiyon aşamaları, çevresel stres üzerinde bağımlı sırasında symptomless olabilir ve bazı gecikmiş tanı1' neden uzun gizli dönemleri. Pek çok toprak kaynaklı patojenler özel sporlar veya toprakta bile yokluğunda onların ana bilgisayarlar, uzun yıllar yaşayabilir melanized hif gibi hayatta kalma yapılar geliştirdik. Toprak kaynaklı hastalık yönetimi için kullanılan bir yaklaşım içerir: bilinen infeste alan kaçınarak, patojen ücretsiz sertifikalı tohum ve fide kullanarak, ekipman sıhhi tutmak ve toprak ve su mümkün olduğunda hareketi kısıtlayan. Bilgi moleküler algılama stratejiler aracılığıyla patojen varlığının aşamasındaki bakımları zamanında kararlar bildiren tarafından yararlı bir rol oynamak veya alanların Değerlendirmeler öncesi bitki. Otel bünyesindeki test örnek bir tanı laboratuvarı için böyle bir tanı ise belki biraz mesafe uzakta ve aynı zamanda üretici çektiğini göndermeden hızlı bir sonuç sağlayan ek avantajlar 'alan tarafı' onların huzurunda gerçekleştirilen sağlar.
Yerinde Tanı dayalı moleküler algılama, duyarlılık, özgüllük, sağlamlık (tekrarlanabilirlik ve tekrarlanabilirlik) ve verimlilik için (i.e., kolaylık ve maliyet performans) değerlendirilmesi için çok önemli faktörlerdir. Akış aygıtları (LFDs) Immunostrip ve PocketDiagnostic gibi yan, onların basitlik olarak bir tek adımlı tahlil nedeniyle yerinde patojen algılama için popüler yöntem vardır. Çünkü onlar duyarlılık ve özgüllük eksikliği ve hedef patojen düşük konsantrasyonlarda ise ve benzer türler veya cins ile cross-react zaman zaman belirsiz sonuçlar sağlar ancak, LFDs her durumda doğru tanı aracı olmayabilir 2. izotermal amplifikasyon (lamba) döngü-aracılı da yerinde patojen algılama için geçerlidir ve özellikle düşük maliyetli reaktifler, sabit kalmasını reaksiyon koşulları ve basit Renkölçer görsel analiz nedeniyle ucuzdur. Her ne kadar her iki yaklaşımın kantitatif daha pahalı ekipman3ile kullanılabilir ancak, LFDs ve lamba genellikle nitelik, kullanılır. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) yüksek özgüllük, yüksek hassasiyet ve algılama söz konusu yöntemleri ile karşılaştırıldığında nicel bir yeteneği sunar. Ancak, geleneksel laboratuar tabanlı PCR teknoloji yerinde amaçlar için bir algılama yöntemi olarak bu teknoloji onaylanmasında önemli bir dezavantaj olan pahalı labaratuar donanımları ve yetenekli personeli de gerektirir.
Bu protokol için yerinde bir tanı yöntemi bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR enstrüman kullanarak gösterilmiştir. Gerçek zamanlı PCR teknoloji diğer yöntemlerine nicel doğruluğu, ışık hassasiyeti ve çok yönlülük açısından avantaj sunar ve çeşitli dahil olmak üzere bitki patojenleri4,5, geniş bir algılama için yaygın olarak kullanılmaktadır toprak6patates patojenler. Hızla büyüyen, rekabetçi piyasa son Trendler yüzünden, PCR teknoloji için gerekli ekipman daha küçük ve daha az pahalı7olmak geliştirmeye devam etmiştir. İletişim kuralı aşağıdaki adımlardan oluşur: manyetik boncuk tabanlı nükleik asit ayıklama, taşınabilir gerçek zamanlı PCR (fluorogenic assay) prob tabanlı ve tüm dizüstü bilgisayar (şekil 1) kullanarak uzaktan yapılabilir Nicel veri analizi.
Burada geliştirilen taşınabilir PCR protokolü kullanarak, toprak kaynaklı patojen, Spongospora yeraltıalgılamak için toprak örnekleri analiz edildi. Toz grev kırıcı8nedensel ajan olarak bir önemli patates patojen olduğu gibi Spongospora seçildi. Son yıllarda, bu hastalığın varlığı patates9,10nerede yetişir pek çok bölgede yayılmış kabul edilir. Sivilce gibi lezyonlar yumrular üzerinde varlığı ile toz grev bozan önemli nitel verim kayıp patates yetiştiricileri için neden olabilir. Buna ek olarak, S. yeraltı patates paspas üst virüs (iç lezyon belirtiler yumrular (spraing da bilinir)11,12' neden olabilir PMTV), vektör. Bu nedenle, S. yeraltı önce6Ekim alanlarındaki mevcut olup olmadığını bilmek önemlidir. Biz de bu protokolü Rhizoctonia solani tespiti için kullanışlılığı göstermek anastomoz grup 3 (AG3) ve PMTV. Birkaç anastomoz grupları Rhizoctonia solani hastalıkları patates neden olsa da, AG3 tartışmasız en önemli dünya çapında13, kök pamukçuk ve siyah scurf % 30 pazarlanabilir verim kayıplar sonucu neden oluyor14. PMTV içinde yaygın olarak spraing adı verilen yumrular, nekrotik lezyonlar neden olur. Bu virüs son zamanlarda ilk kez Pacific Northwest15,16,17birçok eyalette bildirdi ve bu önemli patates büyüyen bölgedeki üreticiler artan endişe etmektir. Bu önemli hastalıklar için taşınabilir PCR etkinliğini belirlemede yanı sıra, optimum DNA ekstraksiyon Metodolojisi ve toprak örnek boyutu da soruşturma bu çalışmada.
Sonuçları taşınabilir PCR yöntemi çok yönlü ve farklı patojenler tespiti için uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Geliştirdiğimiz yerinde algılama yöntemi cephe işçiler Tarım (Örneğin, üreticiler hastalık yönetimi, çeşitli seçimler veya rotasyonlar, gibi ilgili daha önceki kararları için) izin verebilir ve örnek bir bitki patojeni ölçmek dikim, potansiyel hastalık salgınları önlemek için önce bir alan araştırması sırasında.
Protocol
1. yerinde moleküler algılama patojenlerin taşınabilir bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak
Not: Bkz: şekil 1.
- Manyetik boncuk tabanlı DNA ekstraksiyon
Not: Bir manyetik boncuk tabanlı DNA ekstraksiyon Kiti (örneğin Primerdesign gelen) üreticinin talimatlarına göre kullanılan. Tüm reaktifler (18-25 ° C) oda sıcaklığında saklanmalıdır. Lyophilized İndinavir K (şişe No.1) (şişe No.1a kullanarak), askıya alınmış bir kez saklamak-20 ° C'de- 20-50 mg toprak örneği örnek hazırlık çözüm 500 µL bir microtube içinde karıştırın.
Not: Toprak: hazırlık çözüm oranı önemlidir onları diğer oranlarının karıştırma aşağı akım deneyler (Örneğin, kirlenme inhibitörleri tarafından PCR) bir hata neden olabilir. - Bulutlu bir çözümdür kadar küçük bir steril havaneli kullanarak tüp altındaki toprak eziyet. Daha fazla toprak parçacıklar microtube sallayarak çözümde askıya alma ve izin vermek o stand, parçacıklar yerleşmek tamamen toprak izin bozulmamış (genellikle 5-10 dk arasında).
- 200 µL süpernatant, taze bir microtube nakletmek ve 200 µL lizis arabelleği eklemek (şişe No 2: guanidin hidroklorür çözüm) ve 20 µL İndinavir k (şişe No.1).
- Lysate iyice karıştırın tüp ters çevirme ve 15 dakika ortam sıcaklığında kuluçkaya.
Not: Lysate microtube kapağını bulunursa, tüp dokunun veya bir santrifüj varsa kapak kaldırmak kullanır. - Bağlama arabellek/manyetik boncuk mix (şişe No.3) 500 µL lysed örnek ekleyin. Yukarı ve aşağı de pipetting tarafından mix ve manyetik tüp raf 5 dakika için ortam sıcaklığında kuluçkaya.
Not: Boncuk eşit olarak depolama şişeden bölünmemeli olduğundan emin olmak için de kullanmadan önce boncuk çözüm mix emin olun. - Microtube manyetik tüp rafa yerleştirin. En az 2 dk ya da microtube tüm boncuklar manyetik yan duvara takmak kadar bekleyin. Daha sonra kaldırmak ve süpernatant pipetting tarafından atın.
Not: Manyetik boncuklar kaldırma ve süpernatant aspirating rahatsız etmeyin. DNA şimdi manyetik boncuklar tarafından yakalandı. - Microtube manyetik tüp rafa kaldırmak, 500 µL yıkama tampon-1 eklemek (şişe No 4: sodyum perklorat/etanol çözüm) ve boncuk boncuk düzgün dağılmış kadar tekrarlanan pipetting tarafından yeniden askıya alma. Protein ve tuz örneğinden kaldırmak için bu çamaşır adımı tamamlayın. 30 için oturup karışım izin s.
- 1.1.6 arasındaki adımları yineleyin.
- Microtube manyetik tüp rafa kaldırmak, 500 µL yıkama tampon-2 eklemek (şişe No 5: sodyum perklorat/etanol çözüm) ve boncuk boncuk düzgün dağılmış kadar tekrarlanan pipetting tarafından yeniden askıya alma. 30 için oturup karışım izin s.
- 1.1.6 arasındaki adımları yineleyin.
- Microtube manyetik tüp rafa kaldırmak ve 500 µL % 80 etanol (şişe No.6) ekleyin.
Not: Bu adım örnek kalan tuzları kaldırılması için gereklidir.- Boncuk boncuk düzgün dağılmış kadar tekrarlanan pipetting tarafından yeniden askıya alma. Ara sıra INVERSION tarafından karıştırma ile 10 min için böyle kalmasına izin.
- 1.1.6 arasındaki adımları yineleyin.
- Hava Kuru manyetik boncuk Pelet açık microtube kapaklı ortam sıcaklığında 10 dakika için.
Not: Boncuk görünür herhangi bir kalıntı etanol ücretsiz olmalı ama değil tamamen kurudu. - Microtube manyetik tüp rafa kaldırmak, 50-200 µL elüsyon arabelleği (şişe No.7) eklemek ve boncuk boncuk düzgün dağılmış ve o 30 için stand izin kadar tekrarlanan pipetting tarafından yeniden askıya alma s.
Not: Yukarıdaki adımlarda saf DNA elüsyon ara belleğe manyetik boncuklar serbest bırakılır. - Microtube manyetik tüp rafa yerleştirin. En az 2 dk ya da microtube tüm boncuklar manyetik yan duvara takmak kadar bekleyin.
- Şimdi 0.5 mL microtube içinde belgili tanımlık aşağı merdiven kullanılmak için saf DNA/RNA içeren süpernatant aktarın.
- 20-50 mg toprak örneği örnek hazırlık çözüm 500 µL bir microtube içinde karıştırın.
- Taşınabilir gerçek zamanlı PCR
Not: Taşınabilir bir thermocycler ve PCR tahlil seti üreticinin talimatlarına göre kullanılan ( Tablo reçetesigörmek).- Açın ve thermocycler ilişkili yazılımı çalıştırmak, hedef algılama testi seçin ve ad & Ayrıntılar, notlar, örnekleri ve testler veri giriş alanları içine tüm açıklama bilgi giriş.
Not: Wells #1 ve #2 negatif ve pozitif denetimi yazılımı tarafından sırasıyla belirlenir. - PCR reaktif kullanmadan önce hazırlayın. Ana mix re-süspansiyon arabelleği 500 µL de INVERSION tarafından tüp içeren liyofilize ana mix ve karışımı aktarın. Tüm ana mix astar/sonda (Tablo 2) etiketli kahverengi microtube aktarın.
- Kap ve karıştırmak için microtube sallamak. Ayrıntılı karıştırma tüm bileşenlerini tamamen yeniden askıya alınır emin olmak için gereklidir. Kullanmadan önce 5 min için oturup bu karışımı bırak.
Not: Kullanımdan sonra reaksiyon mix-20 ° C'de depolayın.
- Kap ve karıştırmak için microtube sallamak. Ayrıntılı karıştırma tüm bileşenlerini tamamen yeniden askıya alınır emin olmak için gereklidir. Kullanmadan önce 5 min için oturup bu karışımı bırak.
- Hazırlanan tepki Mix 10 µL önceki adımından 0.2 mL PCR tüp içine aktararak bir negatif kontrol hazırlamak ve 10 µL nükleaz ücretsiz steril deiyonize su ekleyin.
- Hazırlanan tepki Mix 10 µL adımından 1.2.2 0.2 mL PCR tüp içine aktararak olumlu denetim hazırlamak ve olumlu denetim şablonunun 10 µL ekleyin.
- Her örnek için hazırlanan tepki Mix 10 µL önceki adımından 0.2 mL PCR tüp içine aktarmak ve 1.1.16 adımından hazırlanan örnek DNA'ın 10 µL ekleyin.
- Thermocycler içeriği ile kuyu onların anılan sıraya göre PCR tüpleri 2.1.1. adımda açıklandığı gibi yükleyin.
- Bir kez tüm gerekli bilgileri girilen ve doğruladı, Başlat Çalıştır seçin ve ethernet bağlı enstrüman veya bir USB aygıtını seçin.
Not: USB sürücü seçeneği seçili ise, çalışma dosyası sürücüdeki (örneğin, F:\genesig) thermocycler ile kullanılmak üzere kaydedilmiş olması gerekir. Sürücü thermocycler hemen eklendikten sonra çalışma başlayacak.
- Açın ve thermocycler ilişkili yazılımı çalıştırmak, hedef algılama testi seçin ve ad & Ayrıntılar, notlar, örnekleri ve testler veri giriş alanları içine tüm açıklama bilgi giriş.
- Taşınabilir gerçek zamanlı PCR veri analizi.
- Çalışma tamamlandıktan sonra çalışma dosyası (.usb) thermocycler ilişkili yazılım kullanma--dan USB götürmek açın veya doğrudan çalışma sonuçlarını yazılımda sonuçlarıgörmek için '.
- Sonuçları analiz daha önce veri kaybını önlemek için tamamlanan çalışma kaydedin.
- Sonuçları sekmesinde çalıştır durumunu görüntülemek örnekleri tarafından kategorize.
Not: Bu sekmede elde edilebilir veri sonuçları durumunu vardır ve örnek tespit numarasını kopyalayın. - Amplifikasyon eğrileri görüntülemek için Ayrıntılar sekmesini tıklatın. Hedef başarıyla algılandığında, hedef ve iç kontrol Cq (miktar döngüsü) değerleri görüntülenir.
Not: Bu değerler son raporda hesaplanır ve bir örnek için hedef pozitif olup olmadığını ve tepki ya da DNA örnekleri ile ilgili sorunlar olup olmadığını belirlemek için kullanılır.
2. diğer iletişim kuralları
-
Alternatif laboratuvar tabanlı DNA ekstraksiyon yöntemleri
-
CTAB-fenol-kloroform yöntemleri temel
- CTAB-fenol-kloroform dayalı yöntemleri, Doyle yöntemi18 ve19 Dellaporta yöntemi daha önce açıklanan izleyip gerçekleştirin.
-
DNA Mini hazırlama yöntemi
Not: Edwards yöntemi20 aşağıdaki gibi gerçekleştirildi.- Toprak, ardından beş 1.4 mm seramik boncuklar ve 750 µL Edwards arabelleği (200 mM Tris, pH 8.0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, % 0.5 SDS) 500 mg bir microtube için de ekleyip karıştırın.
- Microtube 65 ° c 5 min için kuluçkaya.
- Örnek bir boncuk çırpıcı homogenizer 60 ile homojenize s (veya bir harç ve havaneli kullanarak).
- 14.000 x g 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi.
- 500 µL süpernatant, taze bir microtube aktarmak ve soğutulmuş isopropanol 500 µL ile karıştırın. Tüpü 10 kat ters çevirme tarafından karıştırın.
- Örneği 14.000 x g DNA pelletize 15 dakika'santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant dikkatle boşaltmak ve kalan etanol buharlaşıp vardır kadar oda sıcaklığında kuru DNA Pelet hava girsin.
- DNA Pelet 750 µL soğutulmuş % 70 etanol ile yıkayın.
- Hava Kuru Pelet TE arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 1 mM EDTA) 50-100 µL içinde yeniden askıya almadan önce.
-
Diğer alternatif yöntemler
- #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) üreticilerin talimatlarına göre kit ve silika bazlı DNA ekstraksiyon kiti #1 (MP BIO DNA hızlı Spin) kullanarak gerçekleştirebilirsiniz.
-
CTAB-fenol-kloroform yöntemleri temel
-
Geleneksel laboratuar tabanlı gerçek zamanlı PCR.
Not: Geleneksel thermocycler mastermix ile soruşturma tabanlı PCR, çeşitli astar ve Oligonükleotid problar (Tablo 2) için kullanıldı.- Saydam olmayan kaynatıp PCR kullanarak tüpler veya bir PCR tabak hazırlamak 20 µL tepkilerini analiz edilecek tüm DNA örnekleri yanı sıra bir negatif kontrol (deiyonize su nükleaz ücretsiz) ve pozitif şablon kontrol şirket içinde hazır.
- Her PCR için tüp ya da dahil olmak üzere 10 µL mastermix, deiyonize su nükleaz Ücretsiz 7 µL, 2 µM astar/sonda 2 µL ve DNA örneği (Kimden adım 1.1.16 veya 2.1) veya denetim şablonu, örnek başına 1 µL bir karışım hazırlamak.
- PCR tüpleri veya plaka kapatın ve reaksiyon uygun PCR programı seçerek başlayın.
-
Geleneksel laboratuar tabanlı gerçek zamanlı PCR veri analizi
- Thermocycler ilişkili yazılım geleneksel thermocycler sonuçlarını çözümlemek için kullanın. Veri çözümlemesi'ni başlatmak için çalışma dosyası thermocycler USB sürücüye aktarmak, bir USB sürücü takın ve ver' i seçin.
- Thermocycler ilişkili yazılım veri dosyasından (.pcrd) dışa aktarılan çalışmasını açın.
- Bir örnek kuyusu onun de araç üzerinde karşılık gelen bularak vurgulayın. Amplifikasyon eğrileri ve standart eğrileri (varsa) otomatik olarak oluşturulur. Örnek bilgi girilmemişse, Plaka Kur veya benzer bir işlevi veri giriş verileri analiz daha önce başlamak için tıklatın.
- Veri miktar sekmesinde görüntüleyin; Bu CSV, XML veya HTML dosya okuyucuları gibi bir üçüncü taraf yazılımı ile veri analizi için verilebilir.
- Kararlı eşikleri dayalı Cq verileri elde etmek ve pozitif ve negatif kontrolleri ile karşılaştırın.
Not: Hedef DNA standartlarının assay olarak kullanıldıysa, bu standartların Cq kesme belirlemek için örnek Cq verileri karşılaştırmak
Representative Results
DNA ekstraksiyon yöntemlerinin karşılaştırılması
Bir manyetik boncuk tabanlı DNA ekstraksiyon yöntemi gerçek zamanlı PCR ile uyumluluk S. yeraltı DNA miktarda patojen ile enfekte alanlarda toprak örneği algılayarak değerlendirilmiştir. Tamamlayıcı şekil 1' de gösterildiği gibi manyetik boncuk tabanlı yöntemi bir CTAB-fenol-kloroform dayalı yöntem18, hızlı DNA Mini hazırlama yöntemleri19,20ve diğer dahil olmak üzere diğer yöntemlere göre yapıldı. Standart DNA ekstraksiyon kitleri silis tabanlı. Altı farklı yöntemler kullanarak çıkarılan DNA örnekleri için geleneksel laboratuar tabanlı gerçek zamanlı PCR tabi tutuldu. Sonuçları DNA ekstraksiyon kiti silis tabanlı test yöntemleri arasında en iyi performansı olsa da manyetik boncuk tabanlı yöntemi diğer yöntemleri ile karşılaştırılabilir olduğunu düşündürmektedir. Tüm setleri guanidinium thiocyanate veya guanidinium hidroklorid içerir: en RNases ve DNases gibi proteinlerin denatüre güçlü chaotropic ajanlar, ikisi de. Bu nedenle, yöntemleri kullanarak DNA ve RNA çekimi için uygundur.
Taşınabilir bir gerçek zamanlı PCR ve geleneksel bir laboratuar tabanlı gerçek zamanlı PCR arasında karşılaştırma
Duyarlılık ve özgüllük bir geleneksel laboratuar tabanlı PCR, DNA21 pGEM-T vektör tarafından gerçekleştirildiği S. yeraltı Its gen farklı miktarda kullanarak gerçekleştirilen patojenin mutlak miktar için taşınabilir bir PCR ile karşılaştırmak için . Its genin 10 kat dilutions bir dizi (106 -100 kopya) SsTQ astar/sonda set22kullanarak analiz edildi. Taşınabilir PCR yöntemi hedef patojen DNA tespit sonuçları gösterdi (~ 100 kopya), duyarlılık 10 kat olmasına rağmen daha düşük daha geleneksel laboratuar tabanlı PCR yöntemi ile hangi en az 10 kopya (Şekil 2) tespit edildi.
Doğrulama için daha fazla, yapay olarak musallat toprak test edildi. S. yeraltı sporosori toz grev kırıcı kök galls patates kökleri üzerinden üzerinden elde. Toprak sporosori süspansiyonlar, 105 sporosori/g kuru ağırlığının toprak nihai bir konsantrasyon ile istila. Manyetik boncuk tabanlı yöntem kullanarak, DNA musallat toprak örneklerinden elde ve 10 kat seri dilutions konsantrasyonları 10'a eşdeğer elde etmek için hazırlanan5, 104, 103, 102, 101ve 100 sporosori/g Kuru Ağırlık toprak. DNA örnekleri SPO astar/sonda set23kullanarak PCR için kullanılmıştır. Sonuçlar karşılaştırılabilir analitik yetenek geleneksel bir laboratuar tabanlı PCR yöntemi için taşınabilir PCR yöntemi vardır ama yine, duyarlılık ~ 10 (şekil 3) katına düşürüldü gösterdi.
Son olarak, doğal olarak S. yeraltıile kirlenmiş bir alandan toprak örneği test ettik. Manyetik boncuk tabanlı DNA ekstraksiyon farklı miktarlarda toprak (toprak ayıklama tampon çözeltinin 500 µL başına 10, 20, 50 ve 100 mg) tarihinde gerçekleştirildi. Sonuçları toprak DNA çıkarılması için bir başlangıç materyali olarak en uygun ağırlığı 50-100 mg (şekil 4) sürüldü. Toprak miktarları aralığı dışında aşağı akım PCR adımları bir arıza neden olmuş. Toprak aşırı miktarda malzeme başlangıç olarak kullanıldığında, contaminations (örneğin, fenolik bileşikler) ile PCR24etkileyebilir çünkü bu etkisi olabilir. Söz konusu olduğunda düşük miktarlar toprak miktarını ayıklanan DNA PCR (örneğin, toplam 10-20 mg topraktan çıkarılan DNA çeşitli verim) algılama sınırdan daha düşük olabilir. Duyarlılık taşınabilir PCR ile geleneksel PCR yöntemleri arasında oldukça benzer. Benzer sonuçlar DNA örneklerinde farklı çıkarma yöntemleri (tamamlayıcı Şekil 2) tarafından elde edildi
Diğer patojenleri taşınabilir gerçek zamanlı PCR kullanarak yerinde algılama sistemi tarafından algılanması
Diğer önemli patates toprak kaynaklı patojenler, R. solani AG3 ve PMTV tespit etmek için taşınabilir PCR yöntemi test ettik. Bu çalışmada, gerçek zamanlı PCR DNA ile R. solani AG3 algılama saf kültür için RsTq astar/RQP1 sonda set25 kullanarak gerçekleştirilen. Ayrıca gerçek zamanlı PCR PMTV-D astar/sonda set26 spraing semptomatik yumru örnek RNA ile PMTV algılama için kullanılan kullanılarak gerçekleştirilir. Şekil 5' te gösterildiği gibi taşınabilir PCR yöntemi her iki patojenler başarıyla algılandı. Sonuçları için gerçek zamanlı PCR tasarlanmış astar dizileri yoksa taşınabilir PCR yöntemi çok yönlü ve diğer patojen tespitleri için geçerli olduğunu düşündüren taşınabilir ve geleneksel enstrümanlar arasında karşılaştırılabilir.
Şekil 1. Taşınabilir gerçek zamanlı PCR sistemi bünyesinde patojen algılama için yordam. Protokol adımları aşağıdaki sırada oluşur: lysate hazırlık kısa homojenizasyon (A), manyetik boncuk tabanlı nükleik asit ayıklama (B), taşınabilir gerçek zamanlı PCR (C) ve (D) dizüstü bilgisayar kullanan Nicel veri analizi. Not tüm adımları ücreti tamamlanabilir.
Resim 2 . Duyarlılık bir taşınabilir PCR ve geleneksel bir laboratuar tabanlı PCR arasında karşılaştırılması. Patojenin DNA miktar gerçekleştirilen S. yeraltı Its gen farklı miktarda kullanarak (106 -100 kopya) SsTQ astar/sonda ile ayarla. Günlük değeri S. yeraltı plazmid DNA Cq karşılıklı günlük değeri geleneksel thermocycler (A) ve (B) taşınabilir thermocycler arasındaki doğrusal regresyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Tespit performansı ile yapay olarak musallat topraklarda karşılaştırılması S. yeraltı. Toprak yapay istila (105 -100 sporosori/g Kuru toprak ağırlığını) S. yeraltı sporosori süspansiyonlar ile. Manyetik boncuk tabanlı yöntem kullanarak, DNA musallat toprak örneklerinden ayıklandı. PCR SPO astar/sonda kümesiyle toprak numuneleri kullanılarak yapıldı. Günlük değeri başlangıç miktarını sporosori gram başına toprak Cq karşılıklı günlük değeri geleneksel thermocycler (A) ve (B) taşınabilir thermocycler arasındaki doğrusal regresyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Toprak örnekleri DNA ekstraksiyon miktarı karşılaştırma. 10, 20, 50 ve 100 mg toprak örnekleri DNA çıkarılması için kullanılan manyetik boncuk tabanlı yöntem. Gerçek zamanlı PCR taşınabilir thermocycler kullanılarak yapıldı. Standart eğrileri toprak örnekleri (x ekseni) çıkarılan toplam DNA miktarı ve Sss astar/sonda set tarafından güçlendirilmiş PCR ürünü (y ekseni) miktarda arasındaki ilişkiyi temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Diğer patates patojenlerin algılama R. solani ve PMTV. Gerçek zamanlı PCR kullanarak taşınabilir thermocycler ve geleneksel thermocycler yapıldı. R. solani RsTq astar ve (A) PMTV PMTV-D astar/sonda (B) ayarla bir yumru PMTV enfekte örnek kullanarak çıkarılan toplam RNA içinde tespit edildi RQP1 sonda kullanarak saf kültürden çıkarılan toplam DNA ' AG3 tespit edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . Phytopathogens için bir tanılama potansiyel. Akış çizelgesi phytopathogen tanı için genel bir iş akışı gösterilmektedir. Not yerinde moleküler algılama basit ve hızlı tanı işlemlerinin kılan kullanılmaktadır Eğer geleneksel adım örneğin, görsel tanımlama, atlanabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Taşınabilir gerçek zamanlı PCR | Gerçek zamanlı PCR | LAMBA | ELISA | Lateral akış | |
| Hedef tepki maliyet | $0.60-8,47 $ | 0,60 $ | 0,75 $ | 0,60 $ | $4,74 |
| Duyarlılık | 100 kopya | 10 kopya | 10 kopya | 1-10 sporosori33 1-10 ng/mL (protein)33 |
1-10 sporosori34 5 x 105CFU/mL35 |
| Zaman gider | 90 dakika | 80-240 dakika | 50-90 dakika32 | 3-24 Saat | 10-15 dakika |
| Gerekli hazırlık | ●Nucleic asit çıkarma ● Astar tasarım |
●Nucleic asit çıkarma ● Astar/sonda tasarım |
● Nucelic asit çıkarma ● Astar tasarım |
● Protein çıkarma ● Antikorlar |
N/A |
| Diğer malzemeler gerekli | ● Taşınabilir thermocycler | ● Geleneksel thermocycler | ● Renkölçer seçeneğini leke ● kuluçka makinesi |
● Plaka Okuyucu ● Yıkama ekipmanları |
N/A |
Tablo 1. Moleküler ve serolojik algılama yöntemleri phytopathogens için karşılaştırmalı tablosu
| Astar | (5 '-3 ')bir sıra | Hedefb | |
| SsTQ-F13 | CCGGCAGACCCAAAACC | ITS1-ITS2 S. yeraltı içinde | |
| SsTQ-R13 | CGGGCGTCACCCTTCA | ITS1-ITS2 S. yeraltı içinde | |
| SsTQ-P13 | [AİLE] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM] | ITS1-ITS2 S. yeraltı içinde | |
| Genesig S.subterranea astar/sonda | N/A | S. yeraltı aktin | |
| SPO1014 | GGTCGGTCCATGGCTTGA | S. yeraltı Its | |
| SPO1114 | GGCACGCCAATGGTTAGAGA | S. yeraltı Its | |
| SPOPRO114 | [AİLE] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM] | S. yeraltı Its | |
| RsTqF119 | AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT | ITS1-ITS2 R. solani içinde | |
| RsTqR119 | AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT | ITS1-ITS2 R. solani içinde | |
| RQP119 | [AİLE] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM] | ITS1-ITS2 R. solani içinde | |
| Genesig PMTV astar/sonda | N/A | CP-RT PMTV içinde | |
| PMTV-D-F20 | AGAATTGRCATCGAAACAGCA | CP PMTV içinde | |
| PMTV-D-R20 | GTCGCGCTCCAATTTCGTT | CP PMTV içinde | |
| PMTV-D-P20 | [AİLE] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM] | CP PMTV içinde | |
| bir Oligo DNA astar FAM (6-carboxyfluorescein) veya TAM (5-carboxytetramethylrhodamine) ile değiştirildi | |||
| b Its: İç kopya etmek mesafe tutucular, CP: kat protein; CP-RT: kat protein readthrough | |||
Tablo 2. Bu çalışmada kullanılan astar
Ek resim 1. Toz grev kırıcı patojen tespiti için DNA ekstraksiyon yöntemlerinin karşılaştırılması. Altı farklı DNA ekstraksiyon yöntemleri (A-F) toz grev kırıcı patojen, S. yeraltı toprak örneklerinde tespiti için karşılaştırıldı. (B, D, F). DNA çıkarılan silis tabanlı setleri #1 kullanarak (bakınız tüm seti adları için malzemeler tablo), Silis tabanlı seti #2 ve manyetik boncuk tabanlı seti, repsectively. PCR geleneksel laboratuar tabanlı PCR thermocycler kullanılarak gerçekleştirildi. Standart eğrileri toprak örnekleri ve PCR ürünü SsTQ astar/sonda set tarafından güçlendirilmiş miktarda çıkarılan toplam DNA miktarı arasındaki ilişkiyi temsil eder. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 2. Algılama taşınabilir bir PCR ve geleneksel bir laboratuar tabanlı PCR arasındaki sınırı karşılaştırılması. Toplam DNA üç farklı çıkarma yöntemleri kullanarak bir toprak örneğinden izole: (A, B) Doyle yöntemi, (C, D) kiti #2, Silis tabanlı ve (E, F) manyetik boncuk tabanlı kiti. Sağdaki grafikler SsTQ astar/sonda ile geleneksel laboratuar tabanlı thermocycler kullanılarak oluşturulan veri temsil ederken sol tarafta veri taşınabilir thermocycler Sss astar/sonda kümesiyle kullanıyorsanız gösterilen grafik ayarlayın. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Discussion
Tablo 1' de gösterildiği gibi patojen Ajan moleküler tanımlaması son teknolojik gelişmeler etkinliği, doğruluğu ve tanı, hızını önceden semptomatik enfeksiyonlar27algılama için katkıda artmıştır. Yerinde Tanı ile ilgili, çünkü onlar taşınabilir ve hemen sonuç daha düşük maliyetle sağlamak için lamba ve lateral akış yöntemleri sık sık kullanılır. Ancak, serolojik yöntemler söz konusu olduğunda, species-specific algılama elde etmek zor olabilir. Bu zaman zaman hedef kapalı mikroplar gibi ortak toprak nüfusu misdetection neden olur. Örneğin, olabilir çapraz reaktivite Phytophthora spp. serolojik testler ve patates patojenler28bazen zorluklar hedeflenen bitki tespit olduğunu gösteren, söz konusu olduğunda Pythium spp. arasında patojenler.
Bu da çalışmanın, yerinde moleküler algılama yeteneklerini bu geleneksel laboratuar tabanlı gerçek zamanlı PCR sistemi ile karşılaştırarak taşınabilir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak toprak kaynaklı patates patojenlerin için en iyi duruma getirilmiş bir protokol geliştirdik. Duyarlılık ~ 10 kez eşdeğer bir laboratuar tabanlı tahlil daha düşük olmasına rağmen yerinde yöntemi özellikle toprak örneği patates patojenler algılar buldum. Bu durumda alan ve laboratuvar testi biyolojik ilgili örnek boyutu kullanmak vermedi ki dikkate değer da sağlar. Örneklerin boyutu büyük her ne kadar bu yöntemler gerektiren vasıflı operatörler ve sofistike nerede örnek boyutları 250 gr 1 kg arasında işlenir rutin yukarıda açıklanan29,30, alan toprak eleme kullanmak için gerekli olan DNA ayıklamak için donanımları. Tipik olarak, DNA ayıklamak bir büyük ölçekli toprak çok sayıda subsamples bir tek toplama toprak örnek temsilcisinden 1-4 hektar6,29,30alınır. Ancak, burada geliştirilen iletişim kuralı moleküler teşhis önce hiçbir deneyiminiz olmadan hızlı ve kolay kullanımlı kullanıcılar için ve bir laboratuar dışında kullanılabilir. Yöntem için büyük ölçekli toprak ayıklama göre hızlı ve nispeten ucuz olduğu için büyük ölçekli toplu örnekleri için benzer bir örnekleme alanından alınan birçok küçük ölçekli örnekler ekran için kullanılabilir. Bu bazı küçük örnek boyutu eksikliklerin üstesinden gelmek ve patojen alanında uzamsal dağıtımı hakkında ek bilgi almak belirlemek. Buna ek olarak, taşınabilirlik ve hız yöntemi anlamına gelir de gösteri faaliyetleri için yetiştiricileri için kullanılabilmesi için bu eğitim ve nişan amaçlar.
Birçok gerçek zamanlı PCR deneyleri zaten çok çeşitli bitki patojenleri5yayınlanan başka bir noktadır. Bu sistem-ebilmek yapmak gerek kalmadan varolan bu deneyleri, alan test etkinleştirmek için yeni lamba astar tasarlamak için kullanın. LAMBA deneyleri sık bir eleştiri31tasarlamak zor olabilir olduğunu. Taşınabilir PCR, bu nedenle, yerinde test için hazır patojen testleri geniş bir nispeten kolay ve uygulanması sağlar.
Geleneksel yöntemleri çoğu zaman, yanlış zahmetli, pahalı ve zaman alıcı olabilir. Geliştirdiğimiz yerinde yöntemi sadelik yetiştiricileri ve sektör çalışanları patojen saptaması kendileri tarafından ve belki biraz mesafe uzakta olabilir bir tanı Laboratuvarı göndermekten çok daha hızlı bir sonuç oluşturmak izin verir. Çabukluk ve taşınabilir PCR yöntemi duyarlılığını yetiştiricileri potansiyel patojen nüfus ve yanlışlıkla yayılmasını (ekipman ya da insana ilişkin) yolu ile daha da fazla ikincil enfeksiyonlar artırmak önlemek yardımcı olabilir. Sonuç olarak, mevcut çalışmada geliştirilen yerinde yöntemi alanında önemli toprak kaynaklı patojenler doğru ve oldukça hassas tespiti sağlar. Bu çalışmada geliştirilen yerinde yöntemi bir geçerli tanılama boru hattı (şekil 6), katkıda bulunacak sadece bitki hastalıkları alanında ilgili epidemiyolojik sorulara hızlı ve doğru yanıtlar sağlayarak aynı zamanda sağlayarak umudumuz Biyoloji ve bitki patojenleri Epidemiyolojisi artan anlayışı.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
S. yeraltı plazmid DNA, sağlamak için Dr Hannuka Pappu, Washington State Üniversitesi (PMTV RNA sağlamak için WSU) ve Dr. Debra Inglis WSU R. solani AG3 sağlamak için Kuzey Dakota Eyalet Üniversitesi'nde Dr. Neil C. Gudmestad için minnettarız. Yorum videografisi için el yazması ve WSU CAHNRS iletişim sağlamak için özel Dr Jeremy Jewell WSU, teşekkürler. Bu araştırma kuzeybatı patates araştırma Konsorsiyumu ve Washington Devlet Tarım Bakanlığı - özel kırpma blok hibe programı tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. K1764). PPNS No 0741, bölümü bitki patoloji, Ziraat Fakültesi, insan ve doğal kaynak Bilimler, tarımsal araştırma merkezi, Hatch Proje No. WNP00833, Washington State Üniversitesi, Pullman, WA, Amerika Birleşik Devletleri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
| SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
| CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
| Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
| Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
| q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
| Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
| iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
| FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
| Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
| 0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
| Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
| genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
| Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
| Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
| Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |
References
- Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
- Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
- Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
- Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
- Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
- Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
- Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
- Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
- Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
- Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
- Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
- Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
- Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
- Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
- Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
- Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
- Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
- Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
- van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
- Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
- Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
- Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
- Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
- Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
- Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
- Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
- Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
- Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
- Notomi, T., et al.
- Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
- Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).
