Snelle en nauwkeurige detectie van plant ziekteverwekkers on-site, met name bodem overgedragen ziekteverwekkers, is van cruciaal belang om te voorkomen dat verdere entmateriaal productie en verspreiding van plantenziekten in het veld. De methode ontwikkeld die hier met behulp van een draagbaar real-time PCR detectiesysteem kunt on-site diagnose onder veldomstandigheden.
On-site diagnose van plantenziekten kan hierbij een nuttig instrument voor de telers voor tijdig beslissingen waardoor de eerdere uitvoering van strategieën voor het beheer van ziekte die vermindering van de impact van de ziekte. Momenteel in vele diagnostische laboratoria, de polymerase-kettingreactie (PCR), met name real-time PCR, wordt beschouwd als de meest gevoelige en nauwkeurige methode voor de detectie van plant pathogeen. Laboratorium gebaseerde PCRs vergen echter doorgaans dure laboratoriumapparatuur en ervaren personeel. In deze studie, bodem overgedragen ziekteverwekkers van aardappel gebruikt om aan te tonen van het potentieel voor on-site moleculaire detectie. Dit werd bereikt met behulp van een snelle en eenvoudige protocol met magnetische kraal gebaseerde nucleïnezuur extractie, draagbare PCR in real time (fluorogenic sonde gebaseerde assay). De draagbare real-time PCR aanpak gunstig in vergelijking met een laboratorium gebaseerde systeem, opsporen van slechts 100 exemplaren van DNA van Spongospora subterranea. De draagbare real-time PCR-methode ontwikkelde hier kan dienen als een alternatief voor laboratorium-gebaseerde benaderingen en een handige on-site tool voor pathogen diagnose.
Nauwkeurige en snelle identificatie van de causatieve pathogenen gevolgen aanzienlijk besluiten met betrekking tot het beheer van de ziekte van de plant. Bodem-overgebrachte ziekten zijn bijzonder moeilijk te diagnosticeren omdat de bodem omgeving zeer groot ten opzichte van de plant massa en complex is, waardoor het een uitdaging om te begrijpen van alle aspecten van de bodem-overgedragen ziekten. Bovendien, bodem-overgebrachte ziekten kunnen symptomless tijdens infectie beginfases afhankelijk milieustressoren, en sommige hebben lange latente perioden die leiden tot een vertraagde diagnoses1. Vele bodem overgedragen ziekteverwekkers hebben overleving structuren, zoals gespecialiseerde sporen of melanized schimmeldraden, die in de bodem voor vele jaren, zelfs in de afwezigheid van hun gastheren overleven kunnen ontwikkeld. Benutte benaderingen voor het beheer van de bodem overgedragen ziekte omvatten: het vermijden van bekende besmette velden, met behulp van pathogenen vrije gecertificeerde zaden en zaailingen houden apparatuur sanitaire en beperking van het verkeer van bodem en water indien mogelijk. Kennis van de aanwezigheid van pathogenen via moleculaire detectie strategieën kan ook een nuttige rol spelen door te informeren tijdig beslissingen met betrekking tot beginnende behandelingen of vooraf plant evaluaties van de velden. On-site testen biedt extra voordelen van het verstrekken van een snelle resultaat zonder het verzenden van het monster naar een diagnostisch laboratorium dat misschien enige afstand weg en ook om de teler aanspannen kan als deze een diagnose uitgevoerd ‘veld-kant’ in hun aanwezigheid.
On-site diagnose op basis van moleculaire detectie, gevoeligheid, specificiteit, robuustheid (herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid) en efficiëntie (dwz., eenvoud en kosten prestaties) zijn cruciale factoren voor de behandeling. Lateraal stroom apparaten (LFDs) zoals de Immunostrip en PocketDiagnostic, zijn populaire methoden voor de detectie van de on-site pathogen omwille van hun eenvoud als een one-step-assay. LFDs kan niet echter de juiste diagnostische tool in alle situaties omdat ze gebrek aan de gevoeligheid en specificiteit, en af en toe biedt dubbelzinnige resultaten als de target-pathogen in lage concentraties en met vergelijkbare soorten of geslachten cross-react kunt 2. Loop-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) is ook van toepassing voor on-site pathogen detectie en is vooral goedkoop te wijten aan goedkope reagentia, omstandigheden die constant blijven, en eenvoudige colorimetrische visuele analyse. Echter, zowel de LFDs als de LAMP worden doorgaans gebruikt kwalitatief, hoewel beide benaderingen kwantitatief kunnen worden gebruikt met duurdere apparatuur3. De polymerase-kettingreactie (PCR) biedt hoge specificiteit, hoge gevoeligheid en een kwantitatieve vermogen in vergelijking met de eerder genoemde methoden voor de detectie. Echter, de conventionele lab gebaseerde PCR technologie vereist dure laboratoriumapparatuur en geschoold personeel, dat is een groot nadeel bij de vaststelling van deze technologie als een detectiemethode voor on-site toepassing.
In dit protocol wordt een on-site diagnostische methode met behulp van een draagbare instrument voor real-time PCR aangetoond. Real-time PCR-technologie biedt voordelen ten opzichte van andere methoden op het gebied van kwantitatieve nauwkeurigheid, gevoeligheid en veelzijdigheid, en is wijd verbeid gebruikt voor het opsporen van een breed scala van plant ziekteverwekkers4,5, met inbegrip van verschillende aardappel ziekteverwekkers in bodem6. Vanwege de recente trends voor de snel groeiende en concurrerende markt, is nodige materiaal voor PCR technologie blijven ontwikkelen om compacter en minder dure7. Het protocol bestaat uit de volgende stappen uit: magnetische kraal gebaseerde nucleïnezuur extractie, draagbare PCR in real time (fluorogenic sonde gebaseerde assay) en de analyse van de kwantitatieve gegevens die kan worden uitgevoerd op afstand met behulp van een laptopcomputer (Figuur 1).
Hier via het draagbare PCR protocol ontwikkeld, bodemmonsters werden geanalyseerd om te detecteren het bodem-gedragen pathogeen, Spongospora subterranea. Spongospora werd gekozen omdat het een belangrijk aardappel pathogen als het oorzakelijke agens van poederachtige schurft8. In de afgelopen decennia is de aanwezigheid van deze ziekte gezien hebben verspreid naar veel regio’s waar aardappelen worden geteeld9,10. Poederachtige schurft, door de aanwezigheid van puistje zoals laesies op de knollen kan leiden tot aanzienlijke kwalitatieve opbrengst verliezen aan telers van aardappelen. Daarnaast kan S. subterranea vector aardappel Mop Top Virus (PMTV), die leiden interne laesie symptomen in knollen (ook wel spraing genoemd)11,12 tot kan. Het is daarom belangrijk om te weten als S. subterranea in velden vóór6planten aanwezig is. We tonen ook het nut van dit protocol voor de detectie van Rhizoctonia solani Anastomosis groep 3 (AG3) en PMTV. Hoewel verscheidene wapendrager groepen Rhizoctonia solani ziekten in aardappelen veroorzaken, AG3 is aantoonbaar de belangrijkste wereldwijde13, waardoor stam kanker en zwarte scurf resulterend in verhandelbare opbrengst verliezen van maximaal 30%14. PMTV veroorzaakt necrotische laesies in de knollen, die spraing worden genoemd. Dit virus heeft onlangs gemeld voor de eerste keer in verschillende staten in de Pacific Northwest15,16,17, en is van toenemende bezorgdheid aan telers in deze groeiende regio van belangrijke aardappel. Naast het bepalen van de effectiviteit van draagbare PCR voor deze belangrijke ziekten, optimale DNA extractie methodologie en bodem steekproefgrootte werden ook onderzocht in deze studie.
De resultaten suggereren dat de draagbare PCR-methode veelzijdig en die van toepassing zijn voor de detectie van verschillende ziekteverwekkers is. De on-site detectiemethode we ontwikkelden kan de frontlinie werknemers in de landbouw (bijvoorbeeld telers) eerdere beslissingen met betrekking tot het beheer van de ziekte, zoals verschillende selecties of rotaties, en kan het kwantificeren van een ziekteverwekker van de plant in de steekproef tijdens een veldonderzoek, voorafgaand aan planten, om te voorkomen dat potentiële ziekte-uitbraken.
Zoals blijkt uit tabel 1, zijn recente technologische vooruitgang in de moleculaire identificatie van ziekteverwekkers toegenomen de werkzaamheid, nauwkeurigheid en snelheid van diagnose, die hebben bijgedragen tot de opsporing van vooraf symptomatische infecties27. Met betrekking tot on-site diagnose, LAMP en laterale-flow methoden worden vaak gebruikt omdat ze draagbaar zijn en onmiddellijke resultaten tegen een lagere kostprijs bieden. In het geval van serologische methoden, kan soortspecifieke detectie echter moeilijk te bereiken. Hierdoor kunnen af en toe maken van off-target microben zoals gemeenschappelijk bodem inwoners. Bijvoorbeeld, kan er cross reactiviteit tussen de serologische tests van Phytophthora spp. en Pythium spp. in het geval van aardappel ziekteverwekkers28, waaruit blijkt dat er soms problemen opsporen van de gerichte fabriek ziekteverwekkers.
In de huidige studie, hebben we een geoptimaliseerde protocol voor on-site moleculaire detectie van aardappel bodem overgedragen ziekteverwekkers met behulp van de draagbare real-time PCR-systeem door het vergelijken van haar vermogens met die van een conventionele lab gebaseerde real-time PCR-systeem ontwikkeld. We vonden dat de on-site methode specifiek de aardappel ziekteverwekkers in het bodemmonster detecteert, hoewel gevoeligheid ~ 10 keer lager dan die van een gelijkwaardige lab gebaseerde bepaling is. Het is ook overwogen dat in dit geval zowel het laboratorium als het veld test niet een biologisch relevante steekproefgrootte gebruikten. Grote steekproeven zijn vereist voor gebruik bij routinematig bevolkingsonderzoek veld bodems als eerder beschreven29,30, waar de omvang van de steekproeven van tussen de 250 g tot 1 kg zijn verwerkt, hoewel deze methodes bekwame operatoren vereisen en geavanceerde apparatuur om uit te pakken van DNA. Typisch, een grootschalige bodem DNA-extract is overgenomen van een representatief monster getrokken enkele statistische bodem van talrijke deelmonsters 1 tot en met 4 hectare6,29,30. Echter het protocol hier ontwikkeld is snel, vlot-voor-toepassing voor gebruikers met geen voorafgaande ervaring in moleculaire diagnostiek en bruikbaar zijn buiten een lab. Als de methode is snel en relatief goedkoop in vergelijking met de grootschalige bodem aardgaswinning, kan worden gebruikt om vele kleinschalige monsters uit een soortgelijk gebied aan grootschalige verzamelmonsters scherm. Dit kon overwinnen van de tekortkomingen van de grootte van een kleine steekproef en bepalen van extra informatie over de ruimtelijke verspreiding van het pathogene agens in het veld. Bovendien, de portabiliteit en snelheid van de methode betekent dat het kan ook worden gebruikt in de demonstratie aan telers voor educatieve en betrokkenheid doeleinden.
Een andere overweging is dat vele real-time PCR-testen zijn al gepubliceerd voor een breed scala van plant ziekteverwekkers5. Dit systeem kan maken gebruik van deze bestaande testen zonder de behoefte aan ontwerp nieuwe inleidingen van de LAMP om in veldproeven. Een frequente kritiek van LAMP testen is dat ze moeilijk kunnen te ontwerpen van31. Draagbare PCR, staat dan ook toe de relatief eenvoudige implementatie van een breed scala van beschikbaar pathogen tests voor on-site testen.
Traditionele methoden kunnen vaak kostbare, moeizaam, onjuist en tijdrovend. De eenvoud van de on-site methode die we ontwikkeld kan telers en arbeiders detectieproces van de ziekteverwekker zelf en veel sneller dan het verzenden naar een diagnostisch laboratorium dat kan sommige afstand gevolg misschien te genereren. De promptheid en de gevoeligheid van de draagbare PCR-methode kunnen helpen telers te voorkomen dat potentieel secundaire infecties, die verder kunnen van de ziekteverwekker bevolking en onopzettelijk worden verspreid (via apparatuur of mensen verhogen). Kortom, kunt de on-site methode ontwikkeld in de huidige studie nauwkeurig en relatief gevoelig detectie van belangrijke bodem overgedragen ziekteverwekkers in het veld. Onze hoop is dat de on-site methode ontwikkeld in deze studie zal bijdragen in een huidige diagnostische pijpleiding (Figuur 6), niet alleen door middel van snelle en nauwkeurige antwoorden op epidemiologische vragen over plantenziekten in het veld, maar ook door het verstrekken van meer inzicht in de biologie en epidemiologie van ziekteverwekkers van de plant.
The authors have nothing to disclose.
Wij zijn dankbaar aan Dr. Neil C. Gudmestad aan de Staatsuniversiteit van North Dakota voor het verstrekken van S. subterranea plasmide DNA, Dr. Hanu Pappu bij Washington State University (WSU) voor het verstrekken van PMTV RNA, en Dr. Debra Inglis op WSU voor het verstrekken van R. solani AG3. Speciale dank aan Dr Jeremy Jewell op WSU voor het verstrekken van opmerkingen over het manuscript en de WSU CAHNRS communicatie voor videografie. Dit onderzoek werd gesteund door de Northwest aardappel onderzoek Consortium en de Washington State Department of Agriculture – specialiteit gewas blok Grant programma (verlenen neen. K1764). PPNS No. 0741, departement van fytopathologie, College van landbouw, Wetenschappen van de menselijke en natuurlijke hulpbronnen, landbouw Research Center, Hatch Project nr. WNP00833, de Universiteit van de staat van Washington, Pullman, WA, USA.
White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
Masterclear cap strips & real‑time PCR tube strips | Eppendorf | 9510222109 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |