여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.
꼬마 선 충 은 생리학에 화학 효과 테스트 하기 위한 유용한 유기 체입니다. 전체 유기 체 분자 스크린 수명 등 복잡 한 고기를 수정할 수 있는 생물 학적 활성 화학 구조를 식별 하는 데 상당한 이점을 제공 합니다. 여기에 설명 된 각 잘에서 C. 선 충 의 상당히 일관 된 번호 96 잘 문화 접시의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜이입니다. 다음으로, 우리는 선 충 류 C. 선 충의 수명에 미치는 영향에 대 한 이러한 문화 화면 화학 물질의 수천을 사용 하는 방법을 지정 합니다. 이 프로토콜 온도 민감한 살 균 긴장, 한 천 격판덮개 조건 및 심사에 대 한 동기화 된 동물 문화의 신속 하 고 높은 처리량 생산을 촉진 하기 위하여 처리 하는 간단한 동물의 사용.
여기는 프로토콜 꼬마 선 충 수명에 미치는 영향에 대 한 화합물의 높은 처리량 검열을 위한 개발 된 설명 합니다. 프로토콜 자체는 기자 C. 선 충 종자를 이용 하 여 연구를 포함 하 여 다른 phenotypic 스크린에 쉽게 적응할 수입니다. 이 프로토콜 NP1 소설 생물학적 활성 화합물을 식별 하기 위해 성공적으로 이용 되었다 (nitrophenyl-piperazine 1), 하 강하게 식이 제한 메커니즘을 통해 C. 선 충 의 수명 연장. NP1과 놀이, 유전 통로의 설명을 포함 하 여 수명에 미치는 영향의 특성은 이전1설명 되어. 그 보고서에는 대규모 구현의 화면에서 결과의 설명도 포함 됩니다. 여기 우리가 설명 훨씬 더 자세히 방법론 및 화면 자체의 설치는 모두 작은 큰 규모 응용 프로그램에 대 한 확장 가능한.
목표는 여기에 설명 된 프로토콜의 창조에 주도 소설 생물학적 활성 화합물에 대 한 큰 화학 라이브러리의 신속한 심사에 대 한 허용 하는 C. 선 충 문화 플랫폼을 개발 했다. 화학 화면이이 프로토콜의 개발에 앞서 수행 되었습니다, 하지만 이들은 주로 소규모 또는 후보 형식 접근2,3. 실제로, 대부분의 화합물의 수만에 실험실에서 수행 하는 화면 장 수 효과4상영 되 고 안타와 스트레스 저항 분석 실험, 활용. 이 연구 하고자 했다 대신 직접 수명 효과 대 한 화면. 놀랍게도, 수행 하는 대규모 화학 스크린 C. 선 충의 때에 과학 문학에서 몇 가지 설명 했다. 실제로, 화면5,,67의 다른 유형에 비해, C. 선 충 을 사용 하 여 대규모 화학 심사에서 고용 것 같았다.
이 접근 방법을 개발 하는 기초로 사용 된 C. 선 충 에서 대규모 화학 화면 두 설명 했다. 이 중 첫 번째 화학 화면을 사용 하 여 동물의 개발을 교란 할 수 있는 화합물을 식별 하는 피터로이 실험실에서 우아한 연구 했다. 연구는 다음8이러한 화학 물질 유전 목표를 식별 하기 위해 앞으로 mutagenesis 화면 따라. 그 연구에서 설명 하는 프로토콜 사용 24 잘 pates,이 연구의 특정 요구 사항 (제한 된 양의 화학 라이브러리에 제한 된 사용 가능한 보육 공간)를 위해 간단 하 게 실행할 수 아니었다. 다른 연구는 수명 연장 화학9,10마이클 Petrascheck의 혁신적이 고 야심찬 작은 분자 화면을 했다. 그 연구는 384-잘 접시와 액체 문화를 사용합니다. 이 스크린의 다른 주요 기능 FUDR (5-fluorodeoxyuridine) 화학적으로 자손 생산을 억제 하기 위해 사용 했다. 그 연구에서 설명 하는 프로토콜의 상당한 고려 후 화학 살 균과 액체 문화 C. 선 충 의 피해 했다.
비록 FUDR C. 선 충 수명 실험에서 널리 이용 된다, FUDR 예기치 못한 약물 상호 작용을 발생할 수 있습니다 또는 그 FUDR 자체 수명에 어떤 영향을 미칠 수 있습니다 우려 했다. 최근이 후자의 문제는 검증, 적어도 일부 농도 및 25 ° C11에서 특히. 자손 오염의 문제 회피, C. 선 충 스트레인 TJ1060 사용 되었다는 두 개의 독립적인 온도 민감한 돌연변이 항구 (spe-9 (hc88) 나, 정자 생산을 폐지 하 고 유용한 것으로 입증 되었습니다 rrf-3(b26)II) 대 한 동기 인구12의 대량 문화. 이 긴장은 25 ° C에서 완전히 살 균 하지만 15-20 ° c.에 교양 때 자손을 생산할 예정 이다 이 연구 액체 문화 얻은 결과 항상 기존의 한 천 배지와 재현 한 천의 표면에 크롤 링 하는 벌레와 함께 기존의 문화 조건, 사용. 이 현상을 완전히 이해 되지 않습니다, 그러나 그것은 입증 되었습니다 그 웜 교양 교양 표준 미디어13,14에 웜 보다 다른 방식으로 박사 (식이 제한) 액체 반응에. 따라서 액체 미디어 화면 식별 것입니다 그렇지 않으면 일부 박사 mimetics 마스크 수 그럴 듯 하 게 이다.
한 천 문화 조건에 정착 하는 데,이 분석 결과에서 우물의 성능 점수에 대 한 다른 옵션 고려 되었다. 다양 한 자동화 또는 이미징 기반된 분석 사용할 수 있는 동안, 그들은 필요한 수집 및 배포의 기술적으로 도전적인 장치, 대부분의 엄청나게 비싼 했다. 이 옵션을 고려 하는 동안 모든 종류의 이전 수명 화면 참조 필수적 이었다. 궁극적으로,이 연구 수명 고기15시 우 실비아 리 연구소의 전체 게놈 RNAi 스크린에서 적응 점수 메서드를 사용 합니다. 특히, 모든 수명 접시 같은 방식으로 설정 하지만 부정적인 컨트롤만 감시 되었다. 일단 부정적인 컨트롤 플레이트 근처 전체 사망률을 확인 했다, 테스트 플레이트 손으로 득점 했다. 이 대형 스크린에서 긍정 주 반응의 3 중 반복 갓 화학 물질을 사용 하 여 다시 테스트 하 여 확인 되었다.
여기 우리 96 잘 접시에 C. 선 충 배양을 위한 간단한 방법을 설명 했습니다. 우리 화학 검사 및 수명 분석 실험에서 사용 하기 위해 이러한 문화를 설명 하지만 많은 유형의 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다. 동안 멀티 잘 문화 조건 화학 심사에 대 한 이전 보고8, 여러 가지 방법으로 여기에 설명 된 분석 결과가 다릅니다 수명 분석10를 포함 하 여. 여기에 설명 된 수명 분석 결과 96 잘 접시를 활용 하 여, (대신 화학 살 균) 살 균 돌연변이에 의존, 천 문화 조건을 사용 하 여, 웜, 이동 처리 하는 간단한 액체를 사용 하 여 하며 수동으로 끝점에서 득점. 이 분석 결과에서 사용 하는 다른 접근 상영이 조건을 포함 하는 방법을 찾고 연구 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜에 중요 한 요소는 주로 분석 결과 대 한 생산 하는 접시의 품질에 센터. 첫째, 플레이트를 만들 때 한 천 표면 거품 및 다른 결점의 무료입니다 필수적입니다. 한 천 표면에이 변이 거의 항상 이어질 내 우물의 손실. 둘째,이 프로토콜 설치 및 약물 중독자 단계 입금 액체 떨어져 건조에 의존 합니다. 그것은 중요 이러한 액체는 완전히 제거 하 고, 하지만 한 천 밖으로 건조 될 하지 않습니다. Anecdotally, 그것 되지 않은 완전히 스 웜 (액체에서 수영) 건조 나타납니다 건조 및 균열 웜 내과 손실에 이르게 agar의 리드 플레이트의 이상 건조 하는 동안 제대로 건조 웰 스 보다 오래 산다. 이 프로토콜의 또 다른 중요 한 요소는 무 균 상태를 유지 하 고. 와 마찬가지로 모든 수명 분석 결과, 거기 많은 일 판 설치와 관련 된 그리고 많은 기회와 시간 시험 망치고 정착 하 고 성장 판에 오염에 대 한 존재.
여기에 설명 된 수명 분석 결과 C. 선 충에서 화합물의 심사에 대 한 유용 하지만, 그것은 특정 유전 배경, 제한 온도 (ts)에 민감한 살 균 스트레인;에 의존 우리는 높은 불 임 penetrance TJ1060를 사용 합니다. 이이 방법으로 심사에 사용할 수 있는 긴장을 제한합니다. 대체 원하는 배경으로 ts 메 마른 돌연변이 건너 등 화학 살 균을 사용 하 여 접근 한다. 우리는이 분석 결과와 화학 소독을 시도 하지 않은 하지만 가능 해야 한다. 잠재적인 장애물 배치는 소독 기는 벌레에 올바른 단계에서 적절 한 복용량에 포함 됩니다. 설명 하는 프로토콜은 여기 액체 디스펜서는 빠르고, 그러나 성인을 효과적으로 분배 하는 표시 되지 않습니다을 사용 합니다. 그래서,이 벌레는 접시에 개발 하 고 살 균 판에 화학으로 대우 되어야 한다. 최적의 복용량을 결정 하 고 타이밍 성공을 위해 중요 한 것입니다. 대체 전략 성인 이동할 수 있는 분배 방법을 사용 하 여 포함 됩니다. 과거에는, 우리 식별 하 고 성인 정렬 기계는 일반적으로 일시 중단 된 유 충의 균질 슬러리 분배 수 있습니다 간단한 액체 처리기 보다 훨씬 느린 것으로 나타났습니다.
일반적으로, 빠르게 화면 화학 물질과 치료가이 메서드 사용 하 여 수명에 큰 긍정적인 영향에 대 한. 방법은 여러 복용과 함께 사용 될 때 특히 효과적, 높은 숫자, 및 부정적인 컨트롤을 항상 유지 하 고 시험 접시 중 산재의 모니터링을 닫습니다. 긍정적인 컨트롤은 또한 디자인 하 고 구현 하는이 원고에서 설명 하는 스크린 경우에 유용 합니다. 그러나, 효과적인 긍정적인 것, 컨트롤 상당히 유력한 매우 강력한 될 필요가 것입니다. 화면 원래 배포 되 면 적당히 강력 하 고 강력한 화합물 확인 하지 않을 수 있습니다. 현재, 많은 보고가 있다 긍정적인 컨트롤에 대 한 가능성이 후보 ‘노화’ 문학에 여기에서 설명 하는 스크린에 유용. 이 원고의 예상된 결과 섹션의 후보 화면 섹션에서 하 고 그림 2 및 표 1에서 설명한 대로 복합 NP1은이 화면에 대 한 효과적인 긍정적인 컨트롤. 우리는 일반적으로 3mm 문화 접시에 표준 수명 분석으로이 화면에서 긍정적인 안타를 확인합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리 기술 지원 Dipa Bhaumik, 아론 밀러와 밥 휴즈 감사합니다. 변종은 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 우리는 조지아 우즈와 유용한 토론에 대 한 리스 고 우, Kapahi 및 Melov 실험실의 구성원 감사입니다. 메이저 리그는 국립 보건원 (NIH) 훈련 그랜트 T32 AG000266와는 엘리슨 의료 재단/미국 연맹의 노화 연구 장래가 친목에 의해 지원 되었다. 이 작품은 BioAge 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다, 건강의 국가 학회로 서 래리 L. 럼 재단 부여, 부여 UL1024917, Geroscience, 및 G.J.L.에 1R01AG029631-01A1 학 제 연구 컨소시엄을 지 원하는
LB Broth Miller Granules | VWR | ||
Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |