Summary
여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.
Abstract
꼬마 선 충 은 생리학에 화학 효과 테스트 하기 위한 유용한 유기 체입니다. 전체 유기 체 분자 스크린 수명 등 복잡 한 고기를 수정할 수 있는 생물 학적 활성 화학 구조를 식별 하는 데 상당한 이점을 제공 합니다. 여기에 설명 된 각 잘에서 C. 선 충 의 상당히 일관 된 번호 96 잘 문화 접시의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜이입니다. 다음으로, 우리는 선 충 류 C. 선 충의 수명에 미치는 영향에 대 한 이러한 문화 화면 화학 물질의 수천을 사용 하는 방법을 지정 합니다. 이 프로토콜 온도 민감한 살 균 긴장, 한 천 격판덮개 조건 및 심사에 대 한 동기화 된 동물 문화의 신속 하 고 높은 처리량 생산을 촉진 하기 위하여 처리 하는 간단한 동물의 사용.
Introduction
여기는 프로토콜 꼬마 선 충 수명에 미치는 영향에 대 한 화합물의 높은 처리량 검열을 위한 개발 된 설명 합니다. 프로토콜 자체는 기자 C. 선 충 종자를 이용 하 여 연구를 포함 하 여 다른 phenotypic 스크린에 쉽게 적응할 수입니다. 이 프로토콜 NP1 소설 생물학적 활성 화합물을 식별 하기 위해 성공적으로 이용 되었다 (nitrophenyl-piperazine 1), 하 강하게 식이 제한 메커니즘을 통해 C. 선 충 의 수명 연장. NP1과 놀이, 유전 통로의 설명을 포함 하 여 수명에 미치는 영향의 특성은 이전1설명 되어. 그 보고서에는 대규모 구현의 화면에서 결과의 설명도 포함 됩니다. 여기 우리가 설명 훨씬 더 자세히 방법론 및 화면 자체의 설치는 모두 작은 큰 규모 응용 프로그램에 대 한 확장 가능한.
목표는 여기에 설명 된 프로토콜의 창조에 주도 소설 생물학적 활성 화합물에 대 한 큰 화학 라이브러리의 신속한 심사에 대 한 허용 하는 C. 선 충 문화 플랫폼을 개발 했다. 화학 화면이이 프로토콜의 개발에 앞서 수행 되었습니다, 하지만 이들은 주로 소규모 또는 후보 형식 접근2,3. 실제로, 대부분의 화합물의 수만에 실험실에서 수행 하는 화면 장 수 효과4상영 되 고 안타와 스트레스 저항 분석 실험, 활용. 이 연구 하고자 했다 대신 직접 수명 효과 대 한 화면. 놀랍게도, 수행 하는 대규모 화학 스크린 C. 선 충의 때에 과학 문학에서 몇 가지 설명 했다. 실제로, 화면5,,67의 다른 유형에 비해, C. 선 충 을 사용 하 여 대규모 화학 심사에서 고용 것 같았다.
이 접근 방법을 개발 하는 기초로 사용 된 C. 선 충 에서 대규모 화학 화면 두 설명 했다. 이 중 첫 번째 화학 화면을 사용 하 여 동물의 개발을 교란 할 수 있는 화합물을 식별 하는 피터로이 실험실에서 우아한 연구 했다. 연구는 다음8이러한 화학 물질 유전 목표를 식별 하기 위해 앞으로 mutagenesis 화면 따라. 그 연구에서 설명 하는 프로토콜 사용 24 잘 pates,이 연구의 특정 요구 사항 (제한 된 양의 화학 라이브러리에 제한 된 사용 가능한 보육 공간)를 위해 간단 하 게 실행할 수 아니었다. 다른 연구는 수명 연장 화학9,10마이클 Petrascheck의 혁신적이 고 야심찬 작은 분자 화면을 했다. 그 연구는 384-잘 접시와 액체 문화를 사용합니다. 이 스크린의 다른 주요 기능 FUDR (5-fluorodeoxyuridine) 화학적으로 자손 생산을 억제 하기 위해 사용 했다. 그 연구에서 설명 하는 프로토콜의 상당한 고려 후 화학 살 균과 액체 문화 C. 선 충 의 피해 했다.
비록 FUDR C. 선 충 수명 실험에서 널리 이용 된다, FUDR 예기치 못한 약물 상호 작용을 발생할 수 있습니다 또는 그 FUDR 자체 수명에 어떤 영향을 미칠 수 있습니다 우려 했다. 최근이 후자의 문제는 검증, 적어도 일부 농도 및 25 ° C11에서 특히. 자손 오염의 문제 회피, C. 선 충 스트레인 TJ1060 사용 되었다는 두 개의 독립적인 온도 민감한 돌연변이 항구 (spe-9 (hc88) 나, 정자 생산을 폐지 하 고 유용한 것으로 입증 되었습니다 rrf-3(b26)II) 대 한 동기 인구12의 대량 문화. 이 긴장은 25 ° C에서 완전히 살 균 하지만 15-20 ° c.에 교양 때 자손을 생산할 예정 이다 이 연구 액체 문화 얻은 결과 항상 기존의 한 천 배지와 재현 한 천의 표면에 크롤 링 하는 벌레와 함께 기존의 문화 조건, 사용. 이 현상을 완전히 이해 되지 않습니다, 그러나 그것은 입증 되었습니다 그 웜 교양 교양 표준 미디어13,14에 웜 보다 다른 방식으로 박사 (식이 제한) 액체 반응에. 따라서 액체 미디어 화면 식별 것입니다 그렇지 않으면 일부 박사 mimetics 마스크 수 그럴 듯 하 게 이다.
한 천 문화 조건에 정착 하는 데,이 분석 결과에서 우물의 성능 점수에 대 한 다른 옵션 고려 되었다. 다양 한 자동화 또는 이미징 기반된 분석 사용할 수 있는 동안, 그들은 필요한 수집 및 배포의 기술적으로 도전적인 장치, 대부분의 엄청나게 비싼 했다. 이 옵션을 고려 하는 동안 모든 종류의 이전 수명 화면 참조 필수적 이었다. 궁극적으로,이 연구 수명 고기15시 우 실비아 리 연구소의 전체 게놈 RNAi 스크린에서 적응 점수 메서드를 사용 합니다. 특히, 모든 수명 접시 같은 방식으로 설정 하지만 부정적인 컨트롤만 감시 되었다. 일단 부정적인 컨트롤 플레이트 근처 전체 사망률을 확인 했다, 테스트 플레이트 손으로 득점 했다. 이 대형 스크린에서 긍정 주 반응의 3 중 반복 갓 화학 물질을 사용 하 여 다시 테스트 하 여 확인 되었다.
Protocol
1. 버퍼를 준비
-
국물 LB
- 미리 혼합된과 립 ( 자료 표참조)를 사용 하 고 준비에 대 한 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
-
선 충 류 성장 미디어 (NGM) 한 천
- 믹스 23 agar의 g, NaCl의 3 세대, bacto 펩의 2.5 g 및 0.972 L. 압력솥에 이온된 수와 60 ° C에 게 멋진 추가 25 mL의 1 M 칼륨 인산 (KPO4) 버퍼 (pH 6.0), 1 M 황산 마그네슘 (MgSO4)의 1 mL 1 mL의 1 M 칼슘 염화 물 (CaCl2), 그리고 (에탄올)에 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL.
-
차 아 염소 산 솔루션
- 5 M 코의 5 mL 염소 솔루션 (6%), 그리고 이온된 H2O 50 mL의 총 볼륨의 4 mL를 혼합.
-
S 기저
- 5 g의 NaCl, K2HPO4, KH2포4와 드 이온된 수 1 l, 다음 압력솥 6 g 1 g을 혼합.
2. 집중된 대장균 (OP50)의 준비
참고:이 단계는 S 기저 버퍼의 25 mL로 포화 대장균 솔루션의 1 리터를 집중 한다.
- 대장균 (스트레인 OP50)의 단일 식민지와 압력가 파운드 국물 (단계 1.1)의 5 mL를 접종 하 고 진동 (250rpm) 37 ° C에서 4-6 h에 품 어. 이 솔루션의 0.1 mL를 사용 하 여 파운드의 1 L 2 L 삼각 플라스 크에 접종. 1 L 플라스 크 하룻밤 (12-16 h) 진동 (250rpm) 37 ° C에서 품 어.
- 500 mL 원심 병 10000 x g와 박테리아를 작은 멀리 나머지 미디어를 가만히 따르다 하 4 ° C에서 5 분에 1 L 숙박 문화 원심 S 기저 (1.4 단계) 25 mL에 펠 릿을 resuspend. 4 ° c.에 게
3입니다. NGM 문화 접시의 준비
- 대량 배양 배지 벌레의 많은 수를 생성 하는 데 사용, 한 층 류 캐비닛 자동된 유체 디스 펜스 장치 또는 혈 청 학적인 피 펫 10 cm 배양 접시에에 녹은 (60 ° C) NGM 천의 (1.2 단계) 30 mL를 분배 하십시오. 하룻밤 건조를 허용 합니다.
- 각 10 cm 접시, 기울이기 및 회전 접시, agar 표면 표지 확산에 집중된 OP50의 2 개 mL를 피펫으로 다음 접시 건조를 허용 합니다. 최대 2 주까지 4 ° C에서 접시를 저장.
- 높은 처리량 분석 결과 문화 접시 심사에 대 한 사용, 층 류 캐비닛에 96 잘 접시의 각 음에 녹은 NGM agar의 0.15 mL를 분배 하는 자동화 된 8 채널 디스펜서를 활용 합니다. 이 내에 그 잘 분석 결과 손상 것 이다 벌레의 하면 있는지 우물을 주의 거품 없는 있습니다. 하룻밤 건조를 허용 합니다. 최대 2 주까지 4 ° C에서 접시를 저장.
4. 온도 (ts)에 민감한 살 균 C. 선 충 대량 문화의 준비
- 문화는 ' 웜 ' (연결 된 백 금 철사 또는 제조 웜 유리 피펫은 골라 골라) 해 현미경을 사용 하 여 시작 하려면 전송 20 계란 (TJ1060 변형: spe-9 (hc88) 나, 단계 3.1에서에서 준비 중 문화의 plate(s)에 rrf-3(b26)II). 다음, 6 일 동안 20 ° C에서 번호판을 품 어 (이동 20 계란의 자손의 컬렉션에 대 한 대상으로 성장 한 세대 이상에 대 한 허용 한다).
- 시각적으로 해 현미경으로 벗 성인 (자 궁에 계란)의 존재를 확인 합니다. 2-3 mL의 유리 피 펫을 사용 하 여 접시에 기저를 분배 하 여 벗 성인을 수집 합니다. 접시 주위 액체를 손으로, 소용돌이 다음 유리 피 펫을 사용 하 여 15 mL 튜브에 액체를 수집 합니다.
- 튜브 (1000 x g 20 ° C에서 1.5 분) 작은 벌레, 그리고 상쾌한에서 발음을 회전 합니다. 웜 펠 릿을 10 mL 차 아 염소 산 솔루션 (1.3 단계)를 추가 하 고 빠르게 모든 2.5 분 떨고 5 분, 5 미 품에 대 한 위쪽-아래쪽 방향으로 손으로 튜브를 흔들.
- 또, 회전 튜브 (1.5 분 1000 x g); 펠 릿은 노란 갈색 이어야 한다. 상쾌한에서 발음. 계란 펠 릿을 10 mL 차 아 염소 산 솔루션을 추가 하 고 튜브를 적극적으로 악수. 1-3 분, 가끔 흔들어와 해 현미경 외관을 모니터링 하는 동안 품 어. 시각적으로 확인 계란만 남아, 다음 단계를 진행 합니다.
- 튜브 (1000 x g 1.5 분) 아래로 회전 시키십시오 그리고는 상쾌한에서 발음. 펠 릿은 아무 갈색 채색 흰색 이어야 한다.
참고: 후 차 아 염소 산 솔루션의 제거, 그것은 오염부터 살 균 기술 및 버퍼를 사용 하 여 중요 한 (세균 및 곰 팡이, 특히) 낭비 귀중 한 시간과 시 약 실험을 망칠 수 있습니다. 이 연구는 필터링 된 층 류 캐비닛을 사용 하 고 액체 살 균 펫과 팁을 사용 하 여 이동. - 살 균 공간에서 튜브를 엽니다. 3 번 S와 펠 릿 기저 (1.5 분 1000 x g) 아래로 회전 하 고 발음 멀리는 상쾌한 때마다 씻어. 다시 2-3 mL S 기저에 계란 펠 릿을 일시 중단 합니다. 이 계란 지금 L1 유 충 (5 단계) 수집을 버퍼에 하룻밤 해치에 대 한 사용할 수 있습니다.
5. 동기 문화 (L1 애벌레 C. 선 충 을 준비)를 버퍼에 C. 선 충 알을 부 화
- 커버와 멸 균 유리 페 트리 접시에 달걀 펠 릿 및 버퍼를 가만히 따르다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 S 기저의 2-3 mL와 함께 접시에 튜브에서 나머지 계란을 씻어. 로이 (희 궤도 셰이 커와 20 rpm) 떨고 빛으로 해칭, 격려 수 있습니다 크롤 링을 쉽게 하기 위해 기저 S의 5 mL를 추가 합니다. 계란 해치 (16-24 h) 시간에 20 ° C에서 하룻밤를 품 어. 모든 파묻혀 식품의 부재로 인해 1세인트 애벌레 단계 (L1)에서 체포 됩니다.
참고: 일화 적 증거는 신선한 L1 준비 (달걀 수집 후 16-36 h) 성인 벌레의 가장 동기 인구를 생성을 나타냅니다. - 혈 청 학적인 피 펫 15 mL 튜브에 L1s를 수집 합니다. 원심 분리기 (1000 x g 1.5 분)에서 L1s 아래로 회전 시키십시오, 멀리 상쾌한, 발음 하 고 단계에 대 한 기저 S의 10 mL를 떠나 있는 동안 격판덮개, 부 화에서 모든 L1s가 수집 될 때까지 반복 합니다.
- L1s를 포함 하는 관에서 micropipette 0.01 mL (즉시 혼합) 후 고는 unseeded에 분배 (아니 대장균) NGM 접시. 접시에 L1s의 수를 계산 합니다. 10 번 반복 하 고 각 약 수에 있는 L1s의 수에 대 한 평균을 구하십시오. 일반적으로, (때 20 계란을 포함 하는 1 대량 문화 접시와 함께 시작) µ L 당 1-3 L1s 사이 기대 합니다.
- 혈 청 학적인 피 펫과 S는 L1s를 들고 기저의 볼륨을 결정 합니다. 그런 다음 L1s의 총 수를 추정 하는 이전 단계에서 얻은 0.01 mL 당 벌레의 평균 수 결정된으로 추정. 일반적으로, (20 계란을 포함 하는 대량 문화 접시) 당 10000-30000 L1s 사이 기대 합니다.
- 이 문화를 사용 하 여 96 잘 분석 결과에서, 살 균 라운드 미디어 병 µ L 당 1 L1 L1 현 탁 액을 희석 다음 7 단계로 진행 합니다. 이 문화를 추가 생성 하는 데 사용 되는 경우 C. 선 충 문화, 대량 다음 6 단계로 진행 합니다.
6. 대규모 동기 문화 준비
참고: L1 솔루션은 신속 하 게 벌레 인구 증가를 사용할 수 있습니다.
- 큰 벌레 번호 L1 솔루션을 생성 하려면 대량 배양 배지 원하는 수의 각 최대 5000 L1s 분배. 4.1-2 단계에 설명 된 대로 벗 성인 2.5 일 후 (20 ° C)을 수집 하 고 달걀을 수집 하는 4.3 단계로 진행.
- Anecdotally 관찰 되었다는 차 아 염소 산 컬렉션 스트레스 정복 된 인구 수, 인구에 의해 분할 반복으로 따기 계란 그래서 차 아 염소 산 치료에 잔여 인구를 겪고 전에 전파에 대 한 그의 여러 인구의 세대 반복적으로 차 아 염소 산 솔루션 치료 대상이 되지 됩니다.
7. 분석 결과 96 잘 접시의 설치
- 실내 온도 도달 (단계 3.3에서에서 준비) 분석 결과 접시를 수 있습니다. 다음, 층 류 캐비닛에서 각 음에 집중된 OP50 (준비 단계 2.2에서에서)의 5 µ L를 추가 합니다. 이전 처럼 자동된 8 채널 디스펜서를 사용 하 여.
- 자동된 8 채널 디스펜서를 사용 하 여 각 음에 L1 정지의 10 µ L를 추가 합니다. 이 때문에 1 µ L 당 L1 정지에 있는 잘, 당 평균 10 벌레에 얻을 것입니다. 슬러리에서 L1s의 동등한 배급을 홍보, 분배 섞인 적극적으로 적당히 천천히 돌고 라운드 미디어 병에서 L1s 저 어 바.
- 뚜껑, 상자 일괄 플레이트, 플레이트 커버 하 고 2 일에 25 ° C에서 품 어.
8. 1 성 화학 물질과 하루 성인 C. 선 충 을 치료
- 화학 라이브러리 접시는 냉장고에서 제거 하 고 진행 하기 전에 실내 온도 도달 하는 격판덮개를 허용.
참고: 여기에 설명 된 대로 화학 라이브러리 접시 96 잘 접시에 각 잘, 모두는 동일한 농도에 있으며 DMSO에 용 해 분리 된 화합물을 포함 하는. 이러한 라이브러리 외부 열을 사용 하지 않는 그리고 이렇게 각 플레이트는 80 가지 화학 물질의 최대. 여기에 설명 된 프로토콜에서 라이브러리 농도 10 m m 이다. 그것은 고기에 용 매 효과 고려 하는 것이 중요입니다. 이 연구는 0.5%의 DMSO 농도에 스크린, 하는 동안이 수준 결코 이러한 수명 분석 실험 및 낮은 처리량 분석 실험, 어디 그것은 더 많은 복합 소재 솔루션의 농도 선택을 초과 했습니다. 이 프로토콜 수준에서 수명 수정 발생 하지 않습니다16, 적어도 N2 스트레인에 0.25%를 초과 하지 않습니다. - 부드럽게 흔들 플레이트 1 분 미 판 통에 60 rpm에서 즉시 사용 하기 전에.
- 또는 사용 하는 자동화 된 96-잘 액체 처리기, 화합물의 전송 0.75 µ L (DMSO) 분석 결과 접시에 라이브러리 접시에서. 그런 액체 처리기의 피 펫 팁 (와 웜 단계 7.1에서에서 집중된 OP50 agar의 표면에 액체의 ~ 15 µ L을 0.75 µ L 볼륨을 제공 하는 시험 접시에 액체 전달 중 피 펫의 깊이, 신중 하 게 제어 됩니다. -2)와 agar 표면에 잘 관통 하지 않습니다. 매우 작은 화면에 수동 8 또는 12 채널 펫을 제외 하 고를 사용 하지 마십시오 (< 10 접시), 그들은 오류와 타협 분석 결과 agar 표면 puncturing에 자주 결과 높일 수 있습니다.
- 테스트 중인 라이브러리 DMSO를 사용 하 여 용 매로 가정 하 DMSO (디 메 틸 sulfoxide)와 화학 라이브러리 부정적인 제어 플레이트를 준비 합니다. 10 부정적인 제어 플레이트까지 접시 테스트 모든 5 1 부정적인 컨트롤 플레이트를 확인 합니다. 가능 하다 면, 또한 긍정적인 제어 접시 만들기 (NP11 20 m m, 0.1 m m의 최종 분석 결과 농도이 목적;에 대 한 효과적인 대표적인 결과 섹션 참조). 그들은 건조에 특히 취약는 격판덮개의 2 외부 열에 화학 물질 (테스트 또는 컨트롤)을 추가 하지 마십시오.
9. 건조 문화
- agar의 표면에서 액체를 제거, 층 류 4-8 h에 대 한 캐비닛에 접시를 건조. 그것은 중요이 판을 완전히 건조 하지만 포장해 될 하지 않습니다. 몇몇 접시는 다른 사람 보다 건조 하 고, 모든 접시를 밀접 하 게 모니터링 하 고 최대한 빨리 그들은 건조를 제거 하는 데 시간이 오래 걸릴 것입니다. 접시의 개별 우물의 주의 깊은 검사에 의해 건조를 확인 합니다.
참고: 캐비닛의 배기 속도 포함 하는 요소에 따라이 작업에 걸리는 시간은 수 경험적으로 결정 합니다. 이 건조 단계 전체 캐비닛에 대 한 약 4-8 h 걸릴 수 있습니다. - 투명 필름, 번호판 봉인 다음 접시 뚜껑에 넣어.
- 45에 대 한 분석 결과 96 잘 접시를 회전 1000 x g에서 s.
- 매장 판 25 ° c.에서 반전
10. 장 수에 대 한 선 충 C. 문화 점수
- 부정적인 제어 플레이트까지 모니터링 > 95% 사망률이 관찰 됩니다. 주 매일 이후 첫 2 주간에 대 한 번호판을 확인 하십시오. 동일한 긴장 및 종 꼬마 동료 재판17크게 다른 수명을 표시할 수 있습니다.
참고: 설명, 25 ° C에서 배양 하는 TJ1060 동물 수명 분석 결과 대 한 95% 사망률이이 인구에 있는 성인 하루 16-20에서 발생 했습니다. - 때 부정적인 제어 우물에 도달 했습니다 간주 됩니다는 > 95%, 45에 대 한 모든 분석 결과 96 잘 접시를 회전 s는 미 판으로 탁상용 원심 분리기에 적응로 터 (45 250 x g s 20 ° C에서).
- 제어 판 모든 우물을 점수. 이것은 계산 하 고 각 잘에서 살아 있고 죽은 동물의 수를 기록 하 여 이루어집니다. 죽은 벌레는 움직임의 그들의 완전 한 부족에 의해 살아있는 벌레에서 분화 될 수 있다. 갖는 응답에 대 한 접 안 렌즈를 통해 찾고 있는 동안 해 현미경 표면에 약 7 cm에서 96 잘 접시를 놓아 살아 벌레에 움직임을 자극 합니다. 죽은 벌레는 응답 하지 않습니다, 그리고 인근 연구소 동료 반복적인 소음을 감사 하지 않을 수 있습니다.
- 테스트 판에 대 한 계산 하 고 살아있는 벌레를 포함 하는 우물만을 기록 합니다. 살아있는 벌레를 관찰 하는 경우에 잘 위치 및 접시는 잘 모든 살아있는 죽은 동물 계산 합니다.
참고: 그것은 종종 다시 점수 후 접시에 유용한 > 부정적인 제어 벌레의 99%는 죽 었 다. 대형 화면에서 초기 득점 할 최고의 포인트 수 있습니다. 두 경우 모두, 점수/다시-score 위에서 설명한 대로
11. 다시 테스트 화합물
- 소수의 후보 화합물을 테스트할 때 (< 320 화합물), 다시 테스트 또는 후보 화면 (대표 결과 참조), 분석 결과를 제한 32 중앙 우물 가능한 판 효과 최소화 하기 위해 노력에서. 이것은 2 우물 접시의 가장자리에 가까운 치료 하지만 여전히 한 천, 음식, 그리고 벌레.
Representative Results
우리 96-잘 수명 분석 실험을 위해이 프로토콜을 채용에서 대표적인 결과 검토 하 여 시작 합니다. 첫 번째 예제에서 메서드는 30000 화학 물질을 통해 성공적으로 스크린에 사용 되었다 C. 선 충 의 수명을 확장 하 고 또한 화학 물질을 사용 하 여 수행 하는 최고의 후속 다시 테스트 화면에서 결과 포함 하는 화학 물질 확인에 동일한 프로토콜입니다. 이러한 결과 앞에서 설명한1했다입니다. 두 번째 예에서는 후보 화합물의 작은 규모 스크린에 동일한 프로토콜을 사용합니다.
대형 스크린 및 다시 테스트: 30000 화합물을 테스트 하는 대형 화면 중복에 단 하나의 복용량에서 수행 되었다. 각 화학 따라서 20의 예상된 총 동물 인구와 가진 2 개의 우물에서 시험 되었다. 이 위해 3 개의 개별 세트 (중복)에서 10000 화합물의 전체 30000 화합물을 충당 하기 위해 3 개월의 기간 동안 상영 했다. 이 부분에서 수동 분석 결과의 끝에 득점의 관리 금액을 보장 하기 위해 수행 했다 하 고 각 집합에서 분석 결과 96 잘 접시의 260의 총 필요 합니다. 도서관 사진 판, 80만 웰 스 포함 화합물; 10000 화합물에의 한 복제 125 분석 결과 접시를 만든다. 이 연구 각 세트에서 10 부정적인 컨트롤 플레이트 2 복제 사용. 처리량을 증가, 접시 때 부정적인 제어 인구 ~ 99% 사망 경험 평가 했다 득점 했다. 살아있는 벌레에 대 한 모든 테스트 웰 스 다음 조사 했다.
한 라이브 벌레 스에서 화학 안타 라고 했다. 웰 스 되었고 또한 라는 안타, 그리고 그 우물에 또한 모든 벌레 (살아있는 죽은) 이상 1 웜 살아에 포함 된 화학 물질 간단한 점수 생성을 계산 했다 (백분율 살아 점수, 살아있는 벌레 죽은 벌레의 수로 나눈 수). 라이브러리에 있는 각 화학 수 따라서 히트 두 번 그리고 그 안타, 하지만 수도, 그들과 관련 된 점수를가지고. 512 가지 화학 30000 화합물의 화면에서 조회 수 (적어도 한 번) 전화를 했다. 화면 강력한 그리고/또한 강력한 (재현성) 프로 장 수 효과 식별 목적으로 수행 되었다. 이러한 두 가지 다른 속성 뚜렷한 효과 있을 수 있습니다. 강력한 화학 물질 수 극적으로 어떤 경우에 우리는 그 화학 물질의 잘 살아있을 벌레의 높은 % 기대 수명을 증가. 강력한 화학 물질에 대 한 두 복제 살아있는 벌레를가지고 것으로 예상 것입니다. 히트 리스트는 이러한 기준에 따라 평가 되었다. 화학 물질의 179 높은 백분율 살아 점수, 굴복 또는 두 복제에 성공 했 고 따라서 다시 테스트를 위해 선정 됐다. 라는 안타, 하지만 다시 테스트를 위해 선택 하지 나머지 화학의 대부분 복제 우물 중 하나에서 단일 웜 살아 포함만 했다.
다시는 안타의 테스트, 3 복제 (예상된 총 동물의 인구 30), 그리고 치료 제어 판에서 동물의 수명의 주의 정량화를 제외 하 고 기본 화면으로 유사 했다. 이러한 변화는 비교 테스트 및 제어 우물에 도움이 추가 되었습니다. 화학 안타의 179 다시 주문, 10mm, 희석 되었고 96 잘 접시에 이동. 다시 테스트 분석 결과 대 한 내부 24 웰 스만 사용 되었다 (이 프로토콜의 현재 버전 사용 했 내부 32 우물 다시 테스트 화면에 대 한 프로토콜 섹션에 설명 된 대로) 화합물 6 부정적인 제어 분석 결과 플레이트와 3 중에서 다시 테스트 했다 DMSO 용 매로 처리. 한 부정적인 컨트롤 플레이트 총 생존 (그림 1A)에 대 한 주기적으로 득점 했다. 모든 플레이트 득점 했다 완전히 제어 동물의 약 95% 죽은 때, (치료 모든 생활과 죽은 벌레 계산 했다).
다시 테스트 결과에서 안타를 호출 하는 커트 오프 부정적인 컨트롤 + 2 표준 편차 (SD)의 평균 백분율 살아있는 점수에서 만들어졌다. 테스트 웰 스에 대 한 % (득점의 시간)에서 살아 평균 점수는 각 음에 대 한 세 가지 복제에서 살아 백분율 점수를 평균 하 여 계산 했다. 이 특정 분석 결과 대 한 부정적인 제어 우물의 평균 백분율 살아 점수 48 우물 (triplicate 부정적인 컨트롤 플레이트 2 세트) 3 복제의 평균으로 계산 했다. 다시 테스트 화학 세트에서 안타를 호출 하는 데 사용 하는 SD 48 부정적인 제어를 통해 SD % 살아있는 점수를 평균 했다. 이 전략을 사용 하 여,이 연구 발견의 179, 다시 테스트 화학 물질의 32%의 총 양성 시연 (그림 1B) 테스트 다시 도서관에서 57 안타. 부정적인 제어 및 테스트 웰 스에 대 한 평균된 % 살아있는 점수의 binning 테스트 웰 스 제어 웰 스 (그림 1C) 실적이 표시 됩니다.
후보 스크린: 작은 규모 스크린 위에서 설명한 재 시험을 유사한 방식으로 수행할 수 있습니다. 여기, 우리는 139 화합물과 후보 화면에서 결과 설명합니다. 이 후보는 장 수를 촉진 가능성이 구조로 조립 했다. 이 화면에 대 한 우리는 두 개의 다른 복용량 (50 µ M, 100 µ M)에서 테스트 판의 5 복제 수행. 또한, 우리가 포함 하는 두 개의 다른 복용량; 단일 긍정적인 컨트롤 (NP1) 접시 8 부정적인 컨트롤 플레이트, 사용 50 µ M, 100 µ M
부정적인 통제 격판덮개는 동물의 ~ 90% 죽 었 때까지 감시 되었다. 그 당시, 웰 스는 모든 제어 웰 스, 그리고 살아있는 벌레를 포함 하는 테스트 웰 스에서 라이브 하 고 죽은 벌레를 계산 하 여 득점 했다. 득점의 시간에서 살아 % 각 우물에 대 한 평균된 % 살아있는 점수를 계산에 사용 되었다. 부정적인 컨트롤 32 웰 스 8 복제에서 % 살아있는 점수를 했다. 긍정적인 컨트롤에 대 한 각 복용량에 대 한 4 복제에 걸쳐 평균 4 잘 점수 있었다. 조회 수는 평균 보다 큰 한 평균된 백분율 살아 점수와 웰 스에 대 한 전화를 했다 부정적인 제어 % 살아 점수 + 2 sd. 이 컷오프 후보 화면에서 14 안타와 모든 부정적인 제어 웰 스 제외. 그 구분 또한 긍정적인 컨트롤의 모든 포함 100 µ M와 긍정적인 컨트롤의 50%에서 치료 하는 우물 50 µ M에서 치료. 이러한 결과 제시 여기 범주화 50 µ M (그림 2A) 및 100 µ M (그림 2B) 테스트 화면에 대 한 백분율 살아있는 점수를 평균 했다.
마지막으로, 모든 접시 늦은 시간이 시점에서 한 번에 대응 다시 득점 했다 부정적인 컨트롤의 99% 보다 큰 치료 동물 죽 었다고. 그 결과 긍정적인 통제 우물까지 밖 수행 부정적인 제어 및 시험 우물 (그림 2C) 표시. 동안 테스트 웰 스 부정적인 컨트롤 보다 약간 더 나은 했다. 이 후자의 결과 테스트 웰 스의 많은 제어 치료 (표 1), 따라서이 간단한 해석 혼동 상대적인 독성을 전시에 등장 하는 표시에 의해 편 파. 이것은 이후 후보 라이브러리 C. 선 충에서 알 수 없는 생물학 활동 화학 물질의 진정한 화면 다시 테스트 화면 했다 독성 화합물에 대 한 본질적으로 사전 검사 동안에, 예상 될 것 이었다. 이 기본 화면 수명 길어 화합물에 대 한 이후, 크게 독성 화학 물질 해야 하지 다시 테스트에 설정 되었습니다.
그림 1 : 대표 결과 높은 처리량 화면 하 고 다시 테스트
(A) Survivorship 다시 테스트 분석 결과에 사용 된 대표적인 부정적인 컨트롤 플레이트에서 곡선. 이 곡선 분석 결과의 18 일 동안 4 번이이 시험에 사용 되는 24 스에서 모든 라이브 및 죽은 벌레를 점수에서 건설 되었다. 성년의 날 18, 컨트롤 ~ 5% 생존을 평가 했다 그리고 모든 제어 테스트 및 플레이트 또한 득점 후 했다. (B) 테이블 화면 및 재 시험의 결과 요약. (C) Binning 다시 테스트 화면에서 제어 및 테스트 조건에 대 한 웰 스 평균 백분율 살아 점수. 컨트롤에 대 한 점수는 48 우물에서 각 구성 3 복제의 평균. 테스트 결과 179 우물에서 각 구성 3 복제에서 평균된 점수. 그림 1 은 이전 게시1에서 재생 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 대표 후보 화면에서 결과
(A) Binning 50 µ M 후보 화면에서 결과의. 139 테스트 잘 결과 5 복제에서 평균된 백분율 살아있는 점수를 나타냅니다. 8 복제에서 평균된 백분율 살아 점수 32 부정적인 제어 결과 의하여 이루어져 있다. 4 복제 (16 총 50 µ M에 포함 NP1 우물)에서 평균된 백분율 살아 점수 4 긍정적인 제어 결과 의하여 이루어져 있다. (B) 100 µ M 후보 화면에서 결과의 Binning. 모두는 (A)에서 같이 테스트 웰 스와 긍정적인 컨트롤 100 μ M 농도에서 치료. 같은 부정적인 컨트롤 플레이트는 모두 (A 와 B)에 표시 됩니다. (C) 대표는 상대적으로 극단적인 늦은 시간에 접시를 다시 점수에서 결과. 그냥이 시간 시점에서 주요 텍스트 및 표 1에 설명 된 대로 테스트 웰 스에 대 한 편견을 라이브 벌레와 우물의 %를 차지 하는 경우 긍정적인 컨트롤은 극적으로 모든 다른 사람 보다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 평균된 백분율 살아 점수의 binning | ||||||
| 그룹화 된 점수 | 모든 죽은 (0) | 1-10 | 11-20 | 21-30 | 31-40 | > 41 |
| 다시 테스트 | ||||||
| # (-) 제어 | 16 | 31 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| # 테스트 웰 스 (50µM)의 | 46 | 69 | 50 | 8 | 3 | 3 |
| 후보 스크린 | ||||||
| # (-) 제어 | 0 | 11 | 21 | 0 | 0 | 0 |
| (+)의 # 제어 (50µM) | 0 | 0 | 2 | 2 | 0 | 0 |
| (+)의 # 제어 (100µM) | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| # 테스트 웰 스 (50µM)의 | 94 | 22 | 21 | 2 | 0 | 0 |
| # 테스트 웰 스 (100µM)의 | 86 | 25 | 21 | 6 | 1 | 0 |
표 1: 대표 binning 다른 화면에서 결과
여기 두 화면 (다시 테스트 및 후보)에서 평균된 백분율 살아 점수의 binning 선물이. 다시 테스트 화면에서 피크는 부정적인 컨트롤과 유사 하 게 테스트 다시 오른쪽에 극적으로 부정적인 제어를 능가 (수명이 긴) 사이드 테이블의. 이 다시 테스트 집합에 여러 개의 프로 장 수 화합물의 존재를 나타냅니다. 후보 화면에서 우리는 피크는 모든 죽은 카테고리에는 또한 테이블의 오른쪽에서 명백한 신호를 참조 하십시오. 이 후보 세트에서 프로 장 수 화합물의 존재를 나타냅니다 하지만 또한 중요 한 독성 화합물에 대 한 후보 집합 중의 존재를 나타냅니다.
Discussion
여기 우리 96 잘 접시에 C. 선 충 배양을 위한 간단한 방법을 설명 했습니다. 우리 화학 검사 및 수명 분석 실험에서 사용 하기 위해 이러한 문화를 설명 하지만 많은 유형의 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다. 동안 멀티 잘 문화 조건 화학 심사에 대 한 이전 보고8, 여러 가지 방법으로 여기에 설명 된 분석 결과가 다릅니다 수명 분석10를 포함 하 여. 여기에 설명 된 수명 분석 결과 96 잘 접시를 활용 하 여, (대신 화학 살 균) 살 균 돌연변이에 의존, 천 문화 조건을 사용 하 여, 웜, 이동 처리 하는 간단한 액체를 사용 하 여 하며 수동으로 끝점에서 득점. 이 분석 결과에서 사용 하는 다른 접근 상영이 조건을 포함 하는 방법을 찾고 연구 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜에 중요 한 요소는 주로 분석 결과 대 한 생산 하는 접시의 품질에 센터. 첫째, 플레이트를 만들 때 한 천 표면 거품 및 다른 결점의 무료입니다 필수적입니다. 한 천 표면에이 변이 거의 항상 이어질 내 우물의 손실. 둘째,이 프로토콜 설치 및 약물 중독자 단계 입금 액체 떨어져 건조에 의존 합니다. 그것은 중요 이러한 액체는 완전히 제거 하 고, 하지만 한 천 밖으로 건조 될 하지 않습니다. Anecdotally, 그것 되지 않은 완전히 스 웜 (액체에서 수영) 건조 나타납니다 건조 및 균열 웜 내과 손실에 이르게 agar의 리드 플레이트의 이상 건조 하는 동안 제대로 건조 웰 스 보다 오래 산다. 이 프로토콜의 또 다른 중요 한 요소는 무 균 상태를 유지 하 고. 와 마찬가지로 모든 수명 분석 결과, 거기 많은 일 판 설치와 관련 된 그리고 많은 기회와 시간 시험 망치고 정착 하 고 성장 판에 오염에 대 한 존재.
여기에 설명 된 수명 분석 결과 C. 선 충에서 화합물의 심사에 대 한 유용 하지만, 그것은 특정 유전 배경, 제한 온도 (ts)에 민감한 살 균 스트레인;에 의존 우리는 높은 불 임 penetrance TJ1060를 사용 합니다. 이이 방법으로 심사에 사용할 수 있는 긴장을 제한합니다. 대체 원하는 배경으로 ts 메 마른 돌연변이 건너 등 화학 살 균을 사용 하 여 접근 한다. 우리는이 분석 결과와 화학 소독을 시도 하지 않은 하지만 가능 해야 한다. 잠재적인 장애물 배치는 소독 기는 벌레에 올바른 단계에서 적절 한 복용량에 포함 됩니다. 설명 하는 프로토콜은 여기 액체 디스펜서는 빠르고, 그러나 성인을 효과적으로 분배 하는 표시 되지 않습니다을 사용 합니다. 그래서,이 벌레는 접시에 개발 하 고 살 균 판에 화학으로 대우 되어야 한다. 최적의 복용량을 결정 하 고 타이밍 성공을 위해 중요 한 것입니다. 대체 전략 성인 이동할 수 있는 분배 방법을 사용 하 여 포함 됩니다. 과거에는, 우리 식별 하 고 성인 정렬 기계는 일반적으로 일시 중단 된 유 충의 균질 슬러리 분배 수 있습니다 간단한 액체 처리기 보다 훨씬 느린 것으로 나타났습니다.
일반적으로, 빠르게 화면 화학 물질과 치료가이 메서드 사용 하 여 수명에 큰 긍정적인 영향에 대 한. 방법은 여러 복용과 함께 사용 될 때 특히 효과적, 높은 숫자, 및 부정적인 컨트롤을 항상 유지 하 고 시험 접시 중 산재의 모니터링을 닫습니다. 긍정적인 컨트롤은 또한 디자인 하 고 구현 하는이 원고에서 설명 하는 스크린 경우에 유용 합니다. 그러나, 효과적인 긍정적인 것, 컨트롤 상당히 유력한 매우 강력한 될 필요가 것입니다. 화면 원래 배포 되 면 적당히 강력 하 고 강력한 화합물 확인 하지 않을 수 있습니다. 현재, 많은 보고가 있다 긍정적인 컨트롤에 대 한 가능성이 후보 '노화' 문학에 여기에서 설명 하는 스크린에 유용. 이 원고의 예상된 결과 섹션의 후보 화면 섹션에서 하 고 그림 2 및 표 1에서 설명한 대로 복합 NP1은이 화면에 대 한 효과적인 긍정적인 컨트롤. 우리는 일반적으로 3mm 문화 접시에 표준 수명 분석으로이 화면에서 긍정적인 안타를 확인합니다.
Disclosures
저자는이 작품을 지 원하는 아무 자금 엔터티 데이터, 결과, 분석 또는 게시 하는 결정에 입력 했다 선언 합니다.
Acknowledgments
우리 기술 지원 Dipa Bhaumik, 아론 밀러와 밥 휴즈 감사합니다. 변종은 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 우리는 조지아 우즈와 유용한 토론에 대 한 리스 고 우, Kapahi 및 Melov 실험실의 구성원 감사입니다. 메이저 리그는 국립 보건원 (NIH) 훈련 그랜트 T32 AG000266와는 엘리슨 의료 재단/미국 연맹의 노화 연구 장래가 친목에 의해 지원 되었다. 이 작품은 BioAge 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다, 건강의 국가 학회로 서 래리 L. 럼 재단 부여, 부여 UL1024917, Geroscience, 및 G.J.L.에 1R01AG029631-01A1 학 제 연구 컨소시엄을 지 원하는
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
- Lucanic, M., et al. Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan. Aging Cell. , (2016).
- Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307 (5707), 258-262 (2005).
- Melov, S., et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).
- Benedetti, M. G., et al. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen. PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).
- Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans. Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).
- Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
- Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).
- Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).
- Frankowski, H., et al. Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid. Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).
- Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nat Commun. 8, 14256 (2017).
