在这里, 我们描述了一个简单的协议, 快速生产数以百计的线虫生长培养基琼脂, 96 良好的文化板块, 其数量一致的Caenorhhabditis 线虫每井。这些文化对于整个有机体的表型筛选是有用的。我们专注于利用这些文化来筛选化学物质以促进长寿效果。
秀丽线虫是测试生理化学效应的有用有机体。整个有机体小分子筛为识别生物活性化学结构提供了显著的优势, 可以修改复杂的表型, 如寿命。这里描述的是一个简单的协议, 用于生产数以百计的96井文化板块, 每个井中有相当一致的数目的C. 线虫。接下来, 我们指定了如何使用这些区域性来筛选数以千计的化学物质, 以影响线虫线虫的寿命. 该协议使用温度敏感的无菌菌株, 琼脂板条件, 简单的动物处理, 以促进快速和高通量生产的同步动物文化进行筛选。
这里描述了一种用于对秀丽线虫寿命产生影响的化合物高通量筛选的协议。该协议本身很容易适应其他表型屏幕, 包括使用记者C. 线虫菌株的研究。该协议成功地用于识别一种新的生物活性化合物, NP1 (硝基苯哌嗪 1), 通过饮食限制机制, 强烈延长了线虫的寿命。NP1 及其对寿命的影响, 包括对游戏中的遗传通路的描述, 以前在别处被描述为1。该报告还包括对屏幕的大规模实现所产生的结果的描述。在这里, 我们更详细地描述了屏幕本身的方法和设置, 这对于小规模和大型应用程序都是可伸缩的。
导致创建此协议的目标是开发一个“线虫”文化平台, 允许对大型化学图书馆进行快速筛选, 以用于新的生物活性化合物。虽然在本协议开发之前已经执行了化学屏幕, 但它们主要是小规模和/或候选类型方法2,3。事实上, 实验室中的大多数屏幕上都使用了抗应力测试方法, 其中的命中被筛选为长寿效应4。这项研究只是寻求直接筛查寿命效应。值得注意的是, 在使用线虫进行大规模化学筛的时候, 科学文献中很少有描述。事实上, 与其他类型的屏幕5,6,7, 大规模化学检查使用C. 线虫似乎是在就业不足。
在C. 线虫中有两种大型化学筛的描述, 用作开发这种方法的基础。第一个是来自彼得罗伊实验室的一项优雅的研究, 它使用化学筛来识别能扰乱动物发育的化合物。随后, 该研究追踪了一个前诱变筛, 以确定这些化学物质的基因指标8。该项研究中所述的协议使用了24井酱, 这对于该研究的具体需要来说是行不通的 (图书馆的化学物质有限, 可用的孵化器空间有限)。另一项研究是迈克尔 Petrascheck 的创新和雄心勃勃的小分子筛寿命延长化学品9,10。那项研究使用了384井板材和液体文化。这个屏幕的另一个主要特点是使用 FUDR (5-fluorodeoxyuridine) 化学抑制后代生产。在对该项研究中所述的议定书进行了大量审议之后, 避免了化学杀菌和线虫的液体培养。
尽管 FUDR 被广泛应用于线虫寿命实验, 但人们担心 FUDR 可能导致意外的药物相互作用, 或者 FUDR 本身可能对寿命有一定影响。最近, 后者的关注已得到验证, 至少在某些浓度, 特别是在25°c11。为了规避子代污染的问题, 采用了线虫应变 TJ1060, 该菌株具有两种独立的温度敏感突变 (spe-9 (hc88) I; rrf-3 (b26) II), 它可以消除精子的生产并证明是有用的。对于同步种群的大众文化,12。这种菌株在25摄氏度时完全不育, 但在15-20 摄氏度培养时会产生后代。这项研究使用传统的文化条件, 蠕虫爬行在琼脂表面, 因为获得的结果与液体培养不总是重现与传统的琼脂板块。虽然这一现象尚未完全理解, 但已经证明, 在液体中培养的蠕虫以不同的方式响应 DR (饮食限制), 而不是在标准媒体13、14中培养的蠕虫。因此, 液体媒体可能会掩盖一些 mimetics 博士, 否则会被屏幕识别。
通过对琼脂培养条件的研究, 探讨了在本试验中对油井性能进行评分的不同选择。虽然有各种自动化或影像学的分析方法, 但它们需要获得和部署技术上具有挑战性的设备, 其中大部分费用高昂。在考虑这些选项的同时, 必须提到所有类型的以前的生命周期屏幕。最终, 这项研究使用了一个评分方法, 适应了小西尔维娅李实验室的整个基因组干扰屏幕的寿命表型15。具体地说, 所有的寿命板都是以同样的方式建立的, 但只有负控制被监测。当阴性控制板被证实有接近完全死亡, 测试板材由手被得分。在这个大规模的屏幕, 积极的确认通过重新测试与新鲜准备的化学品, 使用三次重复的主要阳性。
在这里, 我们描述了一个简单的方法来培养的C. 线虫在96井板块。我们描述这些文化用于化学筛选和寿命测定, 但它们可以用于多种类型的化验。虽然以前已报告了化学筛选的多井养殖条件8, 包括用于寿命分析的10, 但此处描述的检测方法在几种方面有所不同。这里描述的寿命试验利用96井板, 依靠无菌突变体 (而不是化学杀菌), 使用琼脂培养条件, 使用简单的液体处理来移动蠕虫, 并在终点手动得分。这种方法中使用的不同方法可能有助于研究人员寻找包括这些条件的筛选法。
该协议的关键要素主要集中在为检测而制作的板材的质量上。首先, 在制作盘子的时候, 琼脂表面是没有气泡和其他缺陷的。这些变化在琼脂表面几乎总是导致挖洞和损失的井。第二, 该协议依赖于干燥在安装和下药阶段储存的液体。这是至关重要的, 这些液体被完全去除, 但琼脂不会变得干燥。有趣的是, 在水井中没有完全干燥的蠕虫 (在液体中游泳) 比正常的干井活的时间长, 而过度干燥的盘子会导致琼脂的脱水和开裂, 导致蠕虫的挖洞和损失。该议定书的另一个关键内容是保持无菌条件。与任何寿命检测一样, 有很多工作涉及的板块设置, 并有许多机会和时间来破坏污染, 以解决和增长的板块。
虽然此处描述的寿命分析对于筛选线虫中的化合物非常有用, 但它仅限于特定的遗传背景, 因为它依赖于温度敏感 (ts) 无菌菌株;我们使用 TJ1060, 它有高不孕显性。这限制了可用于筛查这种方法的菌株。其他方法, 包括将ts无菌突变转化为所需的背景或使用化学杀菌。我们没有尝试化学杀菌的这种化验, 但它应该是可能的。潜在的障碍包括将灭菌器放在正确的阶段和适当剂量的蠕虫上。此处描述的协议使用的液体分配器是快速的, 但似乎没有有效地免除成年人。因此, 这些蠕虫发展的板块, 因此必须处理与灭菌化学品的板块。确定最佳剂量和时机对成功至关重要。替代策略包括使用一种可以移动成年人的配药方法。过去, 我们发现, 能够识别和排序成年人的机器通常比简单的液体处理器慢得多, 这可以免除悬浮幼虫的均匀浆料。
一般而言, 我们使用这种方法快速筛选化学药品和治疗, 以对寿命产生巨大的积极影响。当使用多剂量、高复制数和密切监视始终保持和散置在测试板之间的负控制时, 该方法特别有效。在设计和实现本手稿中描述的屏幕时, 积极的控制也很有用。然而, 要成为一个有效的积极的, 控制将需要相当强大和/或高度健壮。当屏幕最初被部署时, 无法识别出一个适当有力和健壮的化合物。目前, 有许多报告在 “老龄化” 的文学可能的候选者的积极控制有用的屏幕上描述。如本手稿的 “预期结果” 部分的 “候选屏幕” 部分所述, 在图 2和表 1中, 复合 NP1 是此屏幕的有效正控件。我们通常确认从这些屏幕上的正面命中与标准寿命测定3毫米培养板。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 Dipa Bhaumik, 艾伦. 米勒和鲍勃. 休斯的技术援助。CGC 提供的菌株是由 NIH 研究基础设施项目办公室 (P40 OD010440) 资助的。我们感谢格鲁吉亚伍兹和 Lithgow、Kapahi 和 Melov 实验室的成员进行有益的讨论。M.L. 得到国家卫生研究院 (NIH) 培训补助金 T32 AG000266 和埃里森医学基金会/美国老龄研究联合会博士后奖学金的支持。这项工作得到了来自 BioAge 实验室、拉里 l. Hillblom 基金会赠款以及国家卫生研究所赠款 UL1024917、支持 Geroscience 跨学科研究联合会的赠款和 1R01AG029631-01A1 G.J.L。
LB Broth Miller Granules | VWR | ||
Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |