Her beskriver vi en enkel protokol for hurtigt producere hundredvis af ødelægge vækst medier agar, 96-og kultur plader med et konsistent antal Caenorhhabditis elegans pr. brønd. Disse kulturer er nyttige for fænotypisk screening af hele organismer. Her fokuserer vi på ved hjælp af disse kulturer til skærmen kemikalier til Pro levetiden effekter.
Caenorhabditis elegans er en nyttig organisme til test kemiske virkninger på fysiologi. Hele organismen lille molekyle skærme giver betydelige fordele for at identificere biologisk aktive kemiske strukturer, der kan ændre komplekse fænotyper som levetid. Beskrevet her er en enkel protokol for at producere hundredvis af 96-og kultur plader med et nogenlunde ensartet antal C. elegans i hver brønd. Næste, vi angivet hvordan man bruger disse kulturer til skærmen tusindvis af kemikalier til effekter på levetiden for fyrretræsnematoden C. elegans. Denne protokol gør brug af temperatur følsom sterile stammer, agar plade betingelser og simple dyr håndtering for at lette hurtig og høj overførselshastighed produktion af synkroniserede animalske kulturer for screening.
Her beskrives en protokol udviklet til high throughput screening af kemiske stoffer for effekter på Caenorhabditis elegans levetid. Selve protokollen er let at tilpasse til andre fænotypiske skærme, herunder undersøgelser udnytte reporter C. elegans stammer. Denne protokol blev med succes udnyttet til at identificere en roman biologisk aktive stof, NP1 (nitrophenylfosfat-piperazin 1), der kraftigt forlænger levetiden for C. elegans gennem en kosten restriktioner mekanisme. NP1 og en karakterisering af dens virkning på levetid, herunder en beskrivelse af den genetiske veje på spil, var tidligere beskrevet andetsteds1. Denne rapport indeholder også en beskrivelse af resultaterne af en omfattende gennemførelse af skærmen. Her beskrive vi meget mere detaljeret metodologi og opsætning af skærmen selv, som er skalerbar til både små og store applikationer.
De mål, der førte til oprettelsen af protokollen beskrevet her var at udvikle en C. elegans kultur platform, der er tilladt for den hurtige screening af store kemiske biblioteker for romanen biologisk aktive forbindelser. Mens kemiske skærme er foretaget forud for udviklingen af denne protokol, disse blev primært små og/eller kandidat type tilgange2,3. Faktisk, de fleste af skærmene udføres i laboratoriet på snesevis af forbindelser udnyttet stress modstand assays, med hits bliver screenet for levetiden effekter4. Denne undersøgelse søgte i stedet at direkte skærm for levetid effekter. Bemærkelsesværdigt, var der få beskrivelser i den videnskabelige litteratur på tidspunktet for udfører store kemiske skærme med C. elegans. Faktisk, i forhold til andre typer af skærme5,6,7, omfattende kemisk screening ved hjælp af C. elegans syntes at være under-ansat.
Der var to beskrivelser af stor skala kemiske skærme i C. elegans , som blev brugt som grundlag til at udvikle denne tilgang. Først af disse var en elegant undersøgelse fra Peter Roy laboratorium ved hjælp af kemiske skærme til at identificere stoffer, der kunne forurolige udviklingen af dyr. Undersøgelsen derefter følges op med en fremad mutagenese skærmen for at identificere de genetiske mål af disse kemikalier8. Den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse anvendes 24-godt pates, som var simpelthen umuligt for denne undersøgelse specifikke behov (begrænsede mængder af kemikaliet i biblioteket og begrænset rådighed inkubator plads). Anden undersøgelsen var Michael Petrascheck ambitiøse og innovative små-molekyle skærm for levetid udvide kemikalier9,10. Denne undersøgelse bruges 384-godt plader og flydende kulturer. Den andre vigtigste funktion af denne skærm var brugen af FUDR (5-fluorodeoxyuridine) til kemisk hæmme afkom produktion. Efter store overvejelser af den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse, blev både kemiske sterilisation og flydende kulturer af C. elegans undgået.
Selvom FUDR er meget udbredt i C. elegans levetid eksperimenter, var der bekymring at FUDR kan forårsage uventede lægemiddelinteraktioner, eller at FUDR, selv kan have en vis virkning på levetid. For nylig er denne sidstnævnte bekymring blevet valideret, i det mindste på nogle koncentrationer og navnlig på 25 ° C11. For at omgå problemet med afkom forurening, C. elegans stamme TJ1060 blev brugt, som havne to uafhængige temperatur følsom mutationer (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) at afskaffe sperm produktion og har vist sig for at være nyttige for masse kulturer af synkron populationer12. Denne stamme var helt sterile ved 25 ° C, men vil producere afkom når kulturperler på 15-20 ° C. Denne undersøgelse anvendes konventionel dyrkningsbetingelser, med orm kravler på overfladen af agaren, som opnåede resultater med flydende kulturer ikke er altid reproducerbare med konventionelle agar plader. Mens dette fænomen ikke er helt forstået, er det blevet påvist, at orme kulturperler i flydende reagere på DR (kosten restriktioner) på en anden måde end orme kulturperler på standard medier13,14. Derfor er det plausibelt, at flydende medier kunne maskere nogle DR mimetics, der ellers ville blive identificeret med skærmen.
At have afgjort på agar dyrkningsbetingelser, blev anset for forskellige muligheder for scoring udførelsen af brønde i denne analyse. Mens forskellige automatiseret eller tænkelig baseret assays blev tilgængelig, nødvendiggjort de anskaffelse og implementering af teknisk udfordrende enheder, hvoraf de fleste var uoverkommeligt dyre. Samtidig overvejer disse muligheder, var det nødvendigt at henvise til tidligere levetid skærme af alle typer. I sidste ende, denne undersøgelse anvendes en scoring metode tilpasset fra Siu Sylvia Lee Labs samlede genom RNAi skærmen for levetid fænotyper15. Specifikt, alle levetid plader blev sat på samme måde, men kun de negative kontroller blev overvåget. Når negative kontrol pladerne blev bekræftet for at have nær komplet dødelighed, blev testplader scoret i hånden. I denne store skærm, blev positiver bekræftet af re-test med frisklavede kemikalier, ved hjælp af tre eksemplarer gentages i de primære positiver.
Her har vi beskrevet en simpel metode til dyrkning af C. elegans i 96-brønd plader. Vi beskriver disse kulturer til brug i kemisk screening og levetid assays, men de kan bruges til mange typer af assays. Mens multi godt kultur betingelserne for kemisk screening er tidligere blevet rapporteret8, herunder for levetid analyse10, analysen beskrives her adskiller sig på flere måder. Levetid analysen beskrives her udnytter 96-brønd plader, afhængig af sterile mutanter (i stedet for kemiske sterilisation), bruger agar dyrkningsbetingelser, bruger simpel flydende håndtering for at flytte orme og er manuelt scorede på slutpunktet. De forskellige metoder, der anvendes i dette assay kan være til hjælp for forskere søger screeningsmetoder, der omfatter disse betingelser.
Afgørende elementer i denne protokol center hovedsagelig på kvaliteten af pladerne fremstilles for analysen. Først, når du foretager plader er det bydende nødvendigt, at agar overfladen er fri af bobler og andre mangler. Disse variationer i agar overfladen føre næsten altid til gravende og tab af brønden. For det andet bygger denne protokol på goldning væsker deponeret gennemførelsesstadier setup og medicinering. Det er afgørende, at disse væsker er helt fjernet, men agaren ikke blive tørret ud. Anekdotisk, det ser ud til at orme i brønde, ikke der er helt tørret (svømning i væske) lever længere end ordentligt tørret wells, mens over tørring af pladerne fører til udtørring og revner i agar, hvilket fører til orm gravende og tab. Et andet afgørende element i denne protokol er at bevare sterile forhold. Som med enhver levetid assay, der er en masse arbejde involveret med opsætningen af pladen, og der findes mange muligheder og tid for assay ødelægger forurening for at bosætte sig og vokse på pladerne.
Mens levetiden analysen beskrevet her er nyttig for screening af forbindelser i C. elegans, er det begrænset til særlige genetiske baggrunde, som den bygger på en temperatur følsom (ts) sterile stamme; Vi brugte TJ1060, som har høj sterilitet penetrans. Dette begrænser de stammer, der er tilgængelige for screening med denne metode. Alternative metoder, herunder krydser ts sterile mutationer i ønskede baggrunden eller ved hjælp af kemiske sterilisation. Vi har ikke prøvet kemiske sterilisering med denne analyse, men det bør være muligt. Potentielle hurdler omfatter markedsføring af sterilizer ormene på det rigtige tidspunkt og i den rette dosis. Protokollen beskrevet bruger her en flydende dispenser, der er fast, men synes ikke at uddele voksne effektivt. Så disse orme udvikle på pladerne og derfor skal behandles med sterilisation kemiske på pladerne. Fastlæggelse af den optimale dosis og timing ville være vigtigt for succes. Alternative strategier omfatter brug af en udlevering metode, der kan flytte voksne. I fortiden, har vi konstateret, at maskiner kunne identificere og sortere voksne er generelt meget langsommere end de simple flydende handlere, som kan undvære homogen gylle af suspenderede larve.
Generelt bruger vi denne metode til hurtigt skærmen kemikalier og behandlinger for store positive virkninger på levetid. Metoden er særdeles effektiv, når det bruges med flere doser, høj kopiere numre, og nøje overvågning af negative kontroller, der er altid vedligeholdt og afbrudt blandt testplader. Positive kontroller er også nyttig, når designe og implementere de skærme, der er beskrevet i dette håndskrift. Men for at være en effektiv positiv, kontrol ønsker skal være temmelig potent og/eller meget robust. Når skærmen blev oprindeligt indsat, kunne en passende potent og robust stof ikke identificeres. I øjeblikket, er der mange rapporter i ‘aldring’ litteratur af sandsynlige kandidater til positive kontroller nyttige i de skærme, der er beskrevet her. Som beskrevet i afsnittet kandidat skærmen i afsnittet forventede resultater af dette manuskript, og i figur 2 og tabel 1, er den sammensatte NP1 en effektiv positiv kontrol for denne skærm. Vi bekræfter generelt positive hits fra disse skærme med standard levetid assays på 3 mm kultur plader.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dipa Bhaumik, Aaron Miller og Bob Hughes for teknisk bistand. Stammer blev leveret af CGC-udvalg, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Vi er taknemmelige for Georgien Woods og medlemmer af Lithgow, Kapahi og Melov Labs for nyttige diskussioner. M.L. blev støttet af National Institutes of Health (NIH) uddannelse Grant T32 AG000266 og en Ellison medicinsk Foundation/amerikanske Føderation for Aging Research Post-Doctoral Fellowship. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra BioAge Labs, giver Larry L. Hillblom Foundation tilskud samt National Institutes of Health, som UL1024917, støtte tværfaglig forskning konsortiet på Geroscience, og 1R01AG029631-01A1 til G.J.L.
LB Broth Miller Granules | VWR | ||
Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |