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Biochemistry

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

doi: 10.3791/56892 Published: March 20, 2018

Summary

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von schnell Hunderte von Nematoden Wachstum Medien Agar, 96-Well-Kultur-Platten mit einer konsistenten Anzahl von Caenorhhabditis Elegans pro Bohrloch. Diese Kulturen sind nützlich für das phänotypische Screening von ganzen Organismen. Wir konzentrieren uns hier auf dieser Kulturen zu Bildschirm Chemikalien für pro-Langlebigkeit-Effekte verwenden.

Abstract

Caenorhabditis Elegans ist eine nützliche Organismus chemische Einflüsse auf die Physiologie zu Testzwecken. Gesamtorganismus niedermolekularer Bildschirme bieten erhebliche Vorteile für die Identifizierung von biologisch aktiver chemischer Strukturen, die komplexe Phänotypen wie Lebensdauer ändern können. Hier ist ein einfaches Protokoll für die Herstellung von Hunderten von 96-Well-Kultur-Platten mit Recht einheitlich Zahlen von C. Elegans in jede Vertiefung. Als nächstes angegeben wir wie mithilfe dieser Kulturen zum Bildschirm Tausende von Chemikalien für Auswirkungen auf die Lebensdauer der Fadenwurm C. Elegans. Dieses Protokoll nutzt Temperatur empfindliche steriler Stämme, Agar Platte Bedingungen und einfache Tier Umgang um die schnellen und hohen Durchsatz-Produktion von synchronisierten tierischen Kulturen für das Screening zu erleichtern.

Introduction

Hier wird ein Protokoll beschrieben, die für Hochdurchsatz-Screening von chemischen Verbindungen für Auswirkungen auf Caenorhabditis Elegans Lebensdauer entwickelt wurde. Das Protokoll selbst ist leicht anpassbar an andere phänotypische Bildschirme, einschließlich Studien Reporter C. Elegans Stämme nutzen. Dieses Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, um eine neuartige biologisch aktive Verbindung, NP1 identifizieren (Nitrophenyl-Piperazin 1), das stark verlängert die Lebensdauer von C. Elegans durch eine diätetische Einschränkung-Mechanismus. NP1 und eine Charakterisierung von seiner Wirkung auf Lebensdauer, einschließlich einer Beschreibung der genetischen Wege im Spiel, war zuvor an anderer Stelle1beschrieben. Dieser Bericht enthält auch eine Beschreibung der Ergebnisse aus eine großtechnische Umsetzung des Bildschirms. Hier beschreiben wir ausführlich viel grösseres die Methodik und das Setup des Bildschirms selbst, das ist für kleine und größere Anwendungen skalierbar.

Das Ziel, das zur Schaffung von dem hier beschriebenen Protokoll geführt wurde, eine C. Elegans Kultur-Plattform zu entwickeln, die für die schnelle Screening der großen chemischen Bibliotheken für neuartige biologisch aktiven Verbindungen zulässig. Während chemische Bildschirme vor der Entwicklung dieses Protokolls durchgeführt wurden, waren hauptsächlich kleine und/oder Kandidat Typ nähert sich2,3. In der Tat, die meisten von den Bildschirmen im Labor auf Zehntausende Verbindungen durchgeführt genutzt Stress-Resistenz-Assays, mit Hits für Langlebigkeit Effekte4gezeigt. Diese Studie versucht stattdessen direkt für Lebensdauer Effekte auf den Bildschirm. Bemerkenswert ist, gab es einige Beschreibungen in der wissenschaftlichen Literatur zum Zeitpunkt der Durchführung groß angelegte chemische Bildschirme mit C. Elegans. In der Tat schien im Vergleich zu anderen Arten von Bildschirmen5,6,7, groß angelegte chemische Screening mit C. Elegans unterbeschäftigt.

Es gab zwei Beschreibungen der großen Skala chemische Bildschirme in C. Elegans , die als Grundlage verwendet wurden, um diesen Ansatz zu entwickeln. Die erste davon war eine elegante Studie von Peter Roy Labor unter Verwendung chemischer Bildschirme Verbindungen zu identifizieren, die die Entwicklung der Tiere stören könnte. Die Studie folgte dann mit einen vorwärts Mutagenese-Bildschirm die genetische Ziele dieser Chemikalien8identifizieren. Das Protokoll in dieser Studie beschriebenen verwendet 24 wohlen Pasteten, das war einfach nicht praktikabel für die spezifischen Bedürfnisse dieser Studie (begrenzten Mengen der Chemikalie in die Bibliothek und die begrenzt verfügbaren Inkubator Raum). Die anderen Studie war Michael Petraschecks innovative und anspruchsvolle kleine Molekül Bildschirm für Lebensdauer verlängern Chemikalien9,10. Dieser Studie wurden 384-Well Platten und flüssige Kulturen. Das andere Hauptmerkmal dieses Bildschirms war die Verwendung von FUDR (5-Fluorodeoxyuridine), chemisch Nachkommenschaft Produktion hemmen. Nach erheblichen Überlegung des Protokolls, die in dieser Studie beschriebenen chemischen Sterilisation und flüssige Kulturen von C. Elegans vermieden werden.

Obwohl FUDR in C. Elegans Lebensdauer Experimente weit verbreitet ist, gab es Bedenken, dass FUDR unerwartete Wechselwirkungen verursachen könnte, oder dass FUDR selbst gewisse Wirkung auf Lebensdauer eine kann. Vor kurzem wurde diese letztere Sorge, zumindest bei einigen Konzentrationen und insbesondere bei 25 ° C11validiert. Um das Problem der Nachkommenschaft Kontamination zu umgehen, C. Elegans Stamm TJ1060 verwendet wurde, die birgt zwei unabhängige Temperatur empfindliche Mutationen (Spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II), die Abschaffung der Spermienproduktion und haben nachgewiesen, dass nützlich sein für Massenkulturen synchrone Populationen12. Diese Sorte war völlig steril bei 25 ° C, aber produzieren Nachkommen wenn bei 15-20 ° c kultiviert Diese Studie verwendete herkömmliche Kulturbedingungen, mit Würmern kriechen auf der Oberfläche des Nährbodens, wie Ergebnisse, die mit flüssigen Kulturen nicht immer reproduzierbar mit konventionellen Agarplatten. Während dieses Phänomen nicht vollständig verstanden ist, wurde nachgewiesen, dass Würmer in flüssigen reagieren auf DR (diätetische Einschränkung) auf eine andere Weise als Würmer kultiviert auf Standardmedien13,14kultiviert. Daher ist es plausibel, dass flüssige Medien einige DR-Mimetika verdecken könnte, die sonst mit dem Bildschirm identifiziert werden würde.

Auf Agar Kulturbedingungen niedergelassen haben, wurden verschiedene Optionen für die Bewertung der Leistung von Brunnen in diesem Test berücksichtigt. Während verschiedene automatisierte oder bildgebenden basierte Assays zur Verfügung standen, erforderte sie Erwerb und Einsatz von technisch anspruchsvollen Geräten, von denen meisten zu teuer waren. Während diese Optionen in Betracht ziehen, galt es zu den vorherigen Lebensdauer Bildschirmen aller Art beziehen. Letztlich verwendet diese Studie eine scoring-Methode aus der Siu Sylvia Lee Lab ganze Genom RNAi Bildschirm für Lebensdauer Phänotypen15angepasst. Insbesondere alle Lebensdauer Platten wurden auf die gleiche Weise aufgestellt, aber nur die Negativkontrollen wurden überwacht. Sobald die Negativkontrolle Platten bestätigt wurden, in der Nähe von kompletten Mortalität haben, wurden von hand Prüfplatten erzielte. In diesem großen Bildschirm wurden positive Ergebnisse bestätigten durch Re-Tests mit frisch zubereiteten Chemikalien, mit dreifacher Ausfertigung der das primäre positive wiederholt.

Protocol

1. Vorbereitung Puffer

  1. LB-Bouillon
    1. Verwenden Sie vorgemischte Granulat (siehe Materialtabelle) und folgen Sie des Herstellers Protokoll für Vorbereitung.
  2. Nematoden Wachstum Medien (NGM) Agar
    1. Mischen Sie 23 g Agar, 3 g NaCl, 2,5 g Bacto Pepton und deionisiertes Wasser 0.972 L. Autoklaven und abkühlen lassen, bis 60 ° C, dann fügen Sie 25 mL 1 M Kalium (KPO4) Phosphatpuffer (pH 6.0), 1 mL 1 M Magnesium-Sulfat (MgSO4) , 1 mL 1 M-Kalzium-Chlorid (CaCl2) und 1 mL von 5 mg/mL Cholesterin (in Ethanol).
  3. Hypochlorit-Lösung
    1. Mischen Sie 5 mL 5 M KOH, 4 mL Natriumhypochlorit-Lösung (6 %) und entionisiertem H2O auf ein Gesamtvolumen von 50 mL.
  4. S basal
    1. Mischen Sie 5 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4und deionisiertes Wasser, 1 L, dann Autoklaven.

2. Vorbereitung des konzentrierten E. Coli (OP50)

Hinweis: Dieser Schritt 1 L einer gesättigten E. Coli-Lösung konzentriert in 25 mL S basale Puffer.

  1. Impfen Sie 5 mL autoklaviert LB Brühe (Schritt 1.1) mit einer einzigen Kolonie von E. Coli (Stamm OP50) zu, und inkubieren Sie für 4-6 h bei 37 ° C mit schütteln (250 u/min). Verwenden Sie 0,1 mL dieser Lösung 1 L LB in einem 2 L-Erlenmeyer-Kolben zu impfen. Inkubieren Sie die 1 L Flaschen über Nacht (12-16 h) bei 37 ° C mit schütteln (250 u/min).
  2. Zentrifugieren Sie 1 L über Nacht Kulturen in 500 mL Zentrifuge Flaschen für 5 min bei 10.000 x g und 4 ° C, pellet-Bakterien und dekantieren entfernt verbleibende Medien. Aufschwemmen Sie Pellets in 25 mL S Basal (Schritt 1.4). Shop bei 4 ° C.

3. Vorbereitung der NGM Kultur Platten

  1. Massenkultur Platten verwendet, um große Anzahl von Würmern zu produzieren sind 30 mL geschmolzene (60 ° C) NGM Agar (Schritt 1.2) in eine laminare Strömung Kabinett auf 10 cm Kultur Teller mit automatisierten Fluid dispensing Vorrichtung oder einer serologischen Pipette zu verzichten. Über Nacht trocknen lassen.
  2. Pipettieren 2 mL konzentrierter OP50 auf jede 10 cm Platte, um vollständig bedecken die Agar-Oberfläche durch Kippen und drehen der Platte verteilt dann Platten trocknen lassen. Shop-Platten bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
  3. Nutzen Sie für hohen Durchsatz-Assay Kultur Platten für das Screening verwendet eine automatisierte 8-Kanal-Spender um 0,15 mL geschmolzene NGM Agar in jede Vertiefung eine 96-well-Platte in einem Laminar-Flow-Schrank zu verzichten. Darauf achten, stellen Sie sicher, dass Brunnen sind frei von Bläschen, da diese ermöglichen werden, Graben von Würmern, die die Probe in das gut Kompromisse eingehen werden. Über Nacht trocknen lassen. Shop-Platten bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.

4. Vorbereitung der Temperatur empfindlich (ts) Sterile C. Elegans Massenkulturen

  1. Zum Starten der Kulturen, mit einem "Wurm Pick" (Wählen Sie eine Glaspipette mit einer angehängten Platindraht oder hergestellten Wurm) unter dem sezierenden Mikroskop übertragen 20 Eiern (Stamm TJ1060: Spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) auf Massenkultur Chicoréeblätter in Schritt 3.1 vorbereitet. 6 Tage dann Platten bei 20 ° C inkubieren (ermöglicht mehr als eine Generation von Wachstum, da Sie für die Sammlung von den Nachkommen der 20 Eier zog Zielen).
  2. Bestätigen Sie visuell die Anwesenheit von trächtigen Erwachsene (Eiern in der Gebärmutter vorhanden) mit einem sezierenden Mikroskop. Sammeln Sie die trächtigen Erwachsenen durch den Verzicht auf 2-3 mL S basal auf die Platte mit einer Glaspipette. Schwenken Sie die Flüssigkeit um die Platte von hand, dann sammeln Sie die Flüssigkeit in eine 15 mL-Tube mit einer Glaspipette.
  3. Spin-down der Röhre (1.000 x g für 1,5 min bei 20 ° C), pellet-Würmer, dann aspirieren Sie überstand. Das Wurm-Pellet 10 mL-Hypochlorit-Lösung (Schritt 1.3) hinzu und schütteln Sie rasch das Rohr von Hand in eine Richtung von oben nach unten 5 S. Inkubation für 5 min schütteln alle 2,5 Minuten.
  4. Wieder, spin-down der Röhre (1.000 x g für 1,5 min); die Tablette sollte gelblich-braun. Aus der Überstand abgesaugt. Das Ei Pellet 10 mL-Hypochlorit-Lösung hinzu und schütteln Sie das Rohr kräftig. Inkubieren Sie 1-3 min, mit gelegentlichen schütteln und beim monitoring Aussehen mit dem sezierenden Mikroskop. Bestätigen Sie visuell nur Eiern bleiben und mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  5. Unterrohr (1.000 x g für 1,5 min) drehen und aus der Überstand abgesaugt. Die Tablette sollte weiß mit keine braune Färbung.
    Hinweis: Nach dem Entfernen der Hypochlorit-Lösung, ist es wichtig, sterile Techniken und Puffer, da Verunreinigungen verwenden (bakterielle und Pilzinfektionen, insbesondere) kann das Experiment, verschwenden Sie wertvolle Zeit und Reagenzien zu ruinieren. Diese Studie verwendet einen gefilterte Laminar-Flow-Schrank und zog Flüssigkeiten mit nur sterilen Pipetten und Spitzen.
  6. Öffnen Sie die Rohre in einem sterilen Raum. Waschen Sie das Pellet 3 Mal mit S basal, drehen nach unten (1.000 x g für 1,5 min) und Absaugen entfernt des Überstands jedes Mal. Wieder aussetzen Sie das Ei Pellet in 2-3 mL S basal. Diese Eizellen nun eine Übernachtung Schraffur im Puffer einsetzbar für L1 Larve (Schritt 5) zu sammeln.

5. C. Elegans Bruteier in Puffer zu synchronen Kulturen (Vorbereitung L1 Larven C. Elegans )

  1. Dekantieren Sie Ei Pellet und Puffer in eine Petrischale sterile Glas mit einem Deckel. Spülen Sie die restlichen Eiern aus der Tube in eine Schale mit einer serologischen Pipette mit ca. 2-3 mL S basal. Fügen Sie 5 mL S basal, Gedränge, zu erleichtern, da dies schlüpfen, ermutigen kann, wie Schütteln (20 u/min mit einer Bauchtänzerin Orbitalschüttler) leuchtet. Inkubation über Nacht bei 20 ° C um Eiern schlüpfen (16-24 h) kann. Alle Jungtiere werden aufgrund des Fehlens von Lebensmitteln an die 1St Larvenstadium (L1) verhaften.
    Hinweis: Anekdotische Evidenz zeigt, dass frische L1 Vorbereitungen (16-36 h nach der Eizellentnahme) die meisten synchronen Bevölkerungen der Erwachsenen Würmer generieren.
  2. Sammeln Sie L1s in einer 15 mL Tube mit einer serologischen Pipette. Spin-down L1s in einer Zentrifuge (1.000 x g für 1,5 min), Aspirieren entfernt des Überstands, und wiederholen Sie, bis alle L1s gesammelt worden sind, aus Platten, wobei 10 mL S basal für nächstes schlüpfen.
  3. Aus der Tube mit L1s, Mikropipette aus 0,01 mL (sofort nach dem Mischen) und verzichten sie auf eine ungesetzte (kein E. Coli) NGM Platte. Die Anzahl der L1s auf dem Teller. 10-Mal wiederholen und durchschnittlich für die Anzahl der L1s in jeder Aliquote erhalten. In der Regel zwischen 1-3 L1s pro Mikroliter (beim Starten mit 1 Massenkultur Platte mit 20 Eiern) erwarten.
  4. Festlegen Sie das Volumen der basalen halten die L1s S mit einer serologischen pipette Dann mit der ermittelten durchschnittlichen Anzahl der Würmer pro 0,01 mL, erhalten im vorherigen Schritt, um die Gesamtzahl der L1s schätzen zu extrapolieren. In der Regel zwischen 10.000-30.000 L1s (pro Massenkultur Platte mit 20 Eiern) erwarten.
  5. Um diese Kultur in 96-Well-Assay verwenden, verdünnen die L1 Aufhängung 1 L1 pro Mikroliter in einer sterilen Runde Medien-Flasche, dann fahren Sie mit Schritt 7 fort. Wenn diese Kultur soll verwendet werden, um zusätzliche generieren C. Elegans Masse Kulturen, dann fahren Sie mit Schritt 6 fort.

(6) groß angelegte synchrone Kultur Vorbereitung

Hinweis: L1 Lösungen einsetzbar, Wurm Bevölkerungen schnell zu erhöhen.

  1. Um große Wurm Zahlen mit einer L1-Lösung zu generieren, bis zu 5.000 L1s auf jeder gewünschten Anzahl der Massenkultur Platten zu verzichten. Sammeln Sie trächtigen Erwachsene 2,5 Tage später (20 ° C) zu, wie 4.1-2 beschrieben und fahren Sie mit Schritt 4.3 die Eiern zu sammeln.
  2. Wie anekdotisch festgestellt wurde, dass wiederholte Hypochlorit-Sammlung kann betonen die unterjochte Bevölkerung, split-Populationen von Eiern Kommissionierung für die Vermehrung vor die restliche Bevölkerung zu Hypochlorit Behandlungen, also zu unterwerfen, dass mehrere Generationen der Bevölkerung werden nicht wiederholt Hypochlorit-Lösung-Behandlung unterzogen.

7. Setup Assay 96-Well-Platten

  1. Lassen Sie der Assay-Platten (vorbereitet in Schritt 3.3) auf Zimmertemperatur kommen. Fügen Sie dann in eine laminare Strömung Schrank, 5 µL konzentrierte OP50 (vorbereitet in Schritt 2.2) in jede Vertiefung. Nach wie vor verwenden Sie eine automatische 8-Kanal-Dispenser.
  2. Fügen Sie 10 µL L1 Suspension in jede Vertiefung mit einem automatisierten 8-Kanal-Dispenser. Dies wird durchschnittlich 10 Würmer pro Bohrloch, Rendite, da sie in der Suspension 1 L1 pro µL vorhanden sind. Zur Förderung der Gleichverteilung der L1s aus der Gülle verzichten L1s aus einer Runde Medien Flasche aktiv gemischt mit einem mäßig langsam drehenden Stir Bar.
  3. Abdeckplatte mit Deckel, Box Chargen von Platten, und 2 Tage bei 25 ° C inkubieren.

8. Behandlung von 1 St Tag Erwachsene C. Elegans mit Chemikalien

  1. Entfernen Sie chemischen Bibliothek Platten aus der Tiefkühltruhe zu, und Platten auf Raumtemperatur bevor Sie fortfahren.
    Hinweis: Chemische Bibliothek Platten wie hier beschrieben sind 96 well Platten, diskrete Verbindungen in jedes gut, alle sind in der gleichen Konzentration und in DMSO gelöst enthalten. Diese Bibliotheken verwenden nicht die äußeren Spalten, und so hat jede Platte maximal 80 verschiedene Chemikalien. In dem hier beschriebenen Protokoll ist die Bibliothek Konzentration 10 mM. Es ist wichtig, solvente Auswirkungen auf Phänotypen zu berücksichtigen. Während dieser Studie in einer DMSO-Konzentration von 0,5 % Bildschirme, war dieses nie überschritten wird, in diese Lebensdauer-Assays und niedrigen Durchsatz Assays, wo es eher zu eine zusammengesetzten Stammlösung Konzentration zu holen ist. Dieses Protokoll überschreitet nicht 0,25 %, die eine Ebene ist mit der Lebensdauer Änderungen nicht16, zumindest in der N2-Belastung auftreten.
  2. Schütteln Sie unmittelbar vor dem Gebrauch bei 60 u/min auf einer Mikrotestplatte Shaker für 1 min es Platte.
  3. Verwendung eines automatisierten 96-Well liquid Handler, Transfer 0,75 µL Verbindung (oder DMSO) aus der Bibliothek-Platte an der Assay-Platte. Die Tiefe der Pipette während flüssige Auslieferung an der Assay-Platte ist sorgfältig, so gesteuert, dass die Pipettenspitzen liquid Handler sind 0,75 µL Volumen, ~ 15 µL Flüssigkeit auf der Oberfläche des Nährbodens (mit Würmern und konzentrierte OP50 von Schritten 7.1 liefern -2) und nicht durchbohren die Agar-Oberfläche in den Brunnen. Verwenden Sie keine manuelle 8 oder 12 Mehrkanal Pipetten außer in sehr kleinen Bildschirmen (< 10 Platten), wie sie Fehler und oft führen zu punktieren die Agar-Oberfläche, die den Assay Kompromisse zu erhöhen.
  4. Bereiten Sie chemische Bibliothek Negativkontrolle Platten mit DMSO (Dimethyl Sulfoxid), vorausgesetzt, die Bibliothek, die zu testenden DMSO als Lösungsmittel verwendet. Stellen Sie 1 Negativkontrolle Platte für alle 5 Platten bis zu 10 Negativkontrolle Platten zu testen. Wenn möglich, machen auch eine positive Steuerungsplatine (NP1-1 bei 20 mM, für eine endgültige Assay-Konzentration von 0,1 mM ist wirksam für diesen Zweck; siehe Vertreter Resultate Abschnitt). Fügen Sie keine Chemikalien (Test oder Control), die 2 äußeren Spalten der Platten, sind besonders anfällig für Austrocknung.

9. Trocknen Kulturen

  1. Zum Entfernen von Flüssigkeit aus der Oberfläche des Nährbodens trocken Sie Platten in die laminare Strömung Schrank für 4-8 h. Es ist wichtig, dass diese Platten vollständig getrocknet sind, aber nicht ausgetrocknet werden. Da einige Platten dauert länger zum Trocknen als andere, alle Platten genau zu überwachen und zu entfernen, sobald sie trocken sind. Trocknung durch sorgfältige Sichtprüfung der einzelnen Vertiefungen der Platte zu bestätigen.
    Hinweis: Abhängig von Faktoren wie der Auspuff-Preis des Kabinetts, muss die Zeit nimmt dies empirisch ermittelt werden. Diese Trocknungsschritt dauert ca. 4-8 h für einen vollen Schrank.
  2. Verschließen Sie Platten mit Klarsichtfolie, dann auf die Platte Deckel.
  3. Drehen Sie die 96-Well-Assay-Platten für 45 s bei 1.000 x g.
  4. Shop-Platten invertiert bei 25 ° C.

10. scoring C. Elegans Kulturen für Langlebigkeit

  1. Überwachen der Negativkontrolle Platten bis > 95 % Mortalität beobachtet. Platten pro Woche für die ersten beiden Wochen und täglich danach zu überprüfen. Caenorhabditis Kohorten von der gleichen Sorte und Art können deutlich unterschiedliche Laufzeiten nach Test17anzeigen.
    Hinweis: Für die Lebensdauer-Assay hier beschrieben wird, mit TJ1060 Tieren bei 25 ° C kultiviert ist 95 % Mortalität in diesen Populationen von Erwachsenen Tag 16-20 aufgetreten.
  2. Wann gelten als Negativkontrolle Brunnen erreicht haben die > 95 % Marke, spin-down alle 96-Well-Assay-Platten für 45 s auf einer Tischplatte Zentrifuge mit einer Mikrotestplatte angepasst Rotor (250 X g 45 s bei 20 ° C).
  3. Alle Bohrungen in den Platten Kontrolle der Gäste. Dies geschieht durch zählen und aufzeichnen, die Anzahl der lebendig und tote Tiere in jede Vertiefung. Tote Würmer können von lebendig Würmer durch den völligen Mangel an Bewegung unterschieden werden. Provozieren Sie Bewegung im Leben Würmer durch Fallenlassen der 96-well-Platte von ca. 7 cm auf die sezierenden Mikroskop-Oberfläche beim Blick durch das Okular für jede evozierten Reaktion. Tote Würmer reagiert nicht, und in der Nähe Lab Mates können nicht schätzen, die sich wiederholende Geräusche.
  4. Zählen Sie für die Prüfplatten und erfassen Sie nur Brunnen mit live Würmer. Wenn ein live-Wurm beobachtet wird, zählen Sie alle lebendig und tote Tiere in diesem gut, zusammen mit dem gut Lage und Platte.
    Hinweis: Es ist oft nützlich, um die Platten nach Punkten neu > 99 % der Negativkontrolle Würmer sind tot. In großem Maßstab Bildschirme dies möglicherweise der beste Punkt, die erste Bewertung zu tun. In beiden Fällen Partitur/re-score wie oben beschrieben

11. Verbindungen Wiederholungstests

  1. Wenn Sie nur eine kleine Anzahl von Kandidaten Verbindungen zu testen (< 320 Verbindungen), wie mit einem re-test oder ein Kandidat-Bildschirm (siehe repräsentative Ergebnisse), den Test auf 32 zentralen Brunnen in dem Bemühen um mögliche Platte Auswirkungen zu minimieren zu beschränken. Dadurch können 2 Brunnen am nächsten an den Rand der Platte unbehandelt aber immer noch mit Agar, Essen und Würmer.

Representative Results

Wir beginnen mit repräsentative Ergebnisse vom Einsatz dieses Protokoll für 96-Well-Lebensdauer-Assays untersucht. Im ersten Beispiel wurde die Methode erfolgreich über 30.000 Chemikalien, um den Bildschirm identifizieren, Chemikalien, verlängern die Lebensdauer von C. Elegans und auch Punktevergabe im Follow-up-re-test-Bildschirm von den leistungsstärksten Chemikalien unter Verwendung, der dasselbe Protokoll. Diese Ergebnisse waren zuvor beschriebenen1. Das zweite Beispiel verwendet das gleiche Protokoll in einem kleineren Bildschirm Kandidat Verbindungen.

Großen Bildschirm und re-test: Der große Bildschirm testen 30.000 Verbindungen erfolgte in einer einzigen Dosis, in zweifacher Ausfertigung. Jede chemische Substanz wurde daher in zwei Brunnen mit einer erwarteten gesamten Tierpopulation 20 getestet. Um dies zu erreichen, wurden drei getrennte Sätze von 10.000 Verbindungen (in zweifacher Ausfertigung) über einen Zeitraum von ca. 3 Monaten zur Deckung der gesamten 30.000 Verbindungen überprüft. Dies geschah zum Teil um eine überschaubare Menge an manuellen erzielte am Ende des Tests zu gewährleisten und insgesamt 260 der 96-Well-Assay Platten in jedem der Sätze. In Bibliothek Lager Platten enthalten nur 80 Brunnen Verbindung; eine Replikation der 10.000 Verbindungen macht 125 Assay-Platten. Diese Studie verwendete 2 Wiederholungen mit 10 Negativkontrolle Platten in jedem Satz. Um den Durchsatz zu erhöhen, wurden Platten erzielte, als Negativkontrolle Populationen beurteilt wurden, ~ 99 % Mortalität erlebt zu haben. Alle Test Brunnen wurden dann untersucht für live Würmer.

Chemikalien in Brunnen mit einem live Wurm wurden Hits genannt. Chemikalien in Brunnen mit mehr als 1 Wurm lebendig waren auch genannt Hits und zusätzlich die Würmer in den Brunnen (lebend und tot) gezählt werden, um eine einfache Punktzahl zu generieren (Prozent lebendig Partitur; die Anzahl der Leben Würmer, geteilt durch die Anzahl der toten Würmer). Jede Chemikalie in der Bibliothek könnte deshalb einen Hit genannt werden, zweimal und die Treffer könnte, aber vielleicht nicht, Partituren, die mit ihnen verbunden haben. 512 verschiedene Chemikalien wurden Hits (mindestens einmal) auf dem Bildschirm von 30.000 Verbindungen genannt. Der Bildschirm wurde mit der Absicht, potente und/oder robuste (reproduzierbare) pro-Langlebigkeit Wirkungen durchgeführt. Diese zwei unterschiedlichen Eigenschaften können unterschiedliche Auswirkungen haben. Starke Chemikalien könnte drastisch erhöhen Lebensdauer, in diesem Fall erwarten wir eine hohe Prozent der Würmer in diese Chemikalie gut zu leben. Für robuste Chemikalien dürften die beiden Wiederholungen leben Würmer haben. Die Hitliste rangierte basierend auf diesen Kriterien. 179 der Chemikalien ergab Highscores Prozent lebendig, oder wurden in beiden Wiederholungen getroffen und waren daher für erneute Tests gewählt. Die meisten der restlichen Chemikalien, die waren Hits genannt, aber nicht für die erneute Prüfung ausgewählt hatte nur einen einzigen Wurm lebt in einer der replizieren Brunnen enthalten.

Erneute Tests der Hits wurde durchgeführt, ähnlich wie bei den Primärbildschirm außer mit 3 Wiederholungen (erwartete Tier Gesamtbevölkerung von 30) und sorgfältige Quantifizierung der Lebenszeit der Tiere in den unbehandelten Kontrolle Platten. Diese Änderungen wurden hinzugefügt, um Hilfe beim Vergleich der Prüf-, Steuer- und Brunnen. 179 der chemischen Hits wurden neu geordnet, verdünnt, um 10 mM und zog in 96-well-Platten. Nur die inneren 24 Brunnen dienten für die re-test-Assay (aktuelle Versionen dieses Protokolls hätte verwendet die innere 32 Brunnen wie beschrieben im Abschnitt "Protokoll" für Testwiederholungen Bildschirme) und die Verbindungen waren erneut getestet in dreifacher Ausführung mit sechs Negativkontrolle Assay Platten mit DMSO Lösungsmittel behandelt. Eine Negativkontrolle Platte erzielte in regelmäßigen Abständen für das gesamte überleben (Abb. 1A). Bei etwa 95 % der Kontrolltiere tot waren, wurden alle Platten vollständig erzielt (alle behandelt Leben und tot Würmer wurden gezählt).

Zum Aufrufen von Hits aus der Re-Testergebnisse erfolgte ein Cut-off um die prozentuale lebendig Durchschnittsnote der Negativkontrolle + 2 Standardabweichungen (SD). Für den Test-Wells, gemittelt Prozent (zum Zeitpunkt des scoring) am Leben Scores wurden berechnet, indem von durchschnittlich Prozent lebendig Ergebnis von drei Wiederholungen für jede Vertiefung. Für diese besondere Probe wurden Negativkontrolle Wells durchschnittliche prozentuale lebendig Scores als der Durchschnitt der drei Wiederholungen für 48 Brunnen (2 Sets mit dreifacher Negativkontrolle Platten) berechnet. Die Treffer aus der re-test chemische Gruppe nannte SD war die SD über die 48 Negativkontrolle Prozent lebendige Noten gemittelt. Mit dieser Strategie, diese Studie ergab 57 Treffer aus der re-test Bibliothek 179 Verbindungen, was zeigt, dass insgesamt 32 % der Chemikalien re-test positiv getestet (Abbildung 1B). Der gemittelten Prozent lebendig Scores für die negative Kontrolle und Test Brunnen Binning darauf hingewiesen, dass die Testgefäße die Kontroll-Vertiefungen (Abbildung 1C) übertroffen.

Kandidat Bildschirm: Kleinen Bildschirmen können in gewissem Sinne ähnlich wie der oben beschriebene Test durchgeführt werden. Hier beschreiben wir die Ergebnisse von einem Kandidaten Bildschirm mit 139 Verbindungen. Diese Kandidaten wurden als wahrscheinlich um Langlebigkeit zu fördern Strukturen montiert. Für diesen Bildschirm haben wir 5 Wiederholungen von Prüfplatten in zwei verschiedenen Dosierungen (50 µM und 100 µM) durchgeführt. Darüber hinaus haben wir 8 Negativkontrolle Teller, mit einer einzigen Positivkontrolle (NP1)-Platte mit zwei verschiedenen Dosierungen verwendet. 50 µM und 100 µM.

Negativkontrolle Platten wurden überwacht, bis ca. 90 % der Tiere tot waren. Zu diesem Zeitpunkt wurden Brunnen erzielte durch Zählung der lebenden und toten Würmer in alle Kontroll-Vertiefungen und von Test-Wells, die live Würmer enthalten. Die Prozent lebendig zum Zeitpunkt des scoring dienten gemittelten Prozent lebendig Ergebnisse für jedes gut berechnen. Für den Negativkontrollen hatten 32 Brunnen Prozent lebendige Partituren von 8 Wiederholungen. Für die Positivkontrollen wurden 4 gut Noten gemittelt über 4 Wiederholungen für jede Dosis. Treffer für Brunnen mit einer gemittelten Prozent lebendig Kerbe, die größer als die gemittelten war hießen Negativkontrolle Prozent lebendig Gäste + 2 SD Dieser Abschlag 14 Treffer aus dem Kandidaten-Bildschirm links und all die negativen Kontroll-Vertiefungen ausgeschlossen. Dieser Abschlag ebenfalls enthalten alle die Positivkontrolle Brunnen zu 100 µM und 50 % der positiven Kontrollen behandelt behandelt bei 50 µM. Diese Ergebnisse werden hier als Makulatur gemittelt Prozent lebendig Scores für die 50 µM (Abb. 2A) und 100 µM (Abbildung 2B) Test-Bildschirme.

Schließlich wurden alle Platten neu bewerteten zu einem späten Zeitpunkt, was eine Zeit entsprach bei mehr als 99 % von der negativen Kontrolle behandelt Tiere waren tot. Die Ergebnisse zeigten, dass die Positivkontrolle Brunnen weit die negative Kontrolle und Test-Brunnen (Abbildung 2C) überholt. Während der Test-Wells etwas besser als den Negativkontrollen waren. Dieses letztere Ergebnis vorgespannt ist durch die Angabe, dass viele die Testgefäße erschienen Toxizität im Vergleich zu der Steuerung der Behandlung (Tabelle 1), wodurch Störfaktoren diese einfache Interpretation auszustellen. Dies war zu erwarten, da die Kandidat Bibliothek eine wahre Bildschirm von Chemikalien mit unbekannter biologischer Aktivität in C. Elegans, war während der re-test Bildschirm war im wesentlichen sorgfältig geprüften für Verbindungen, die nicht giftig sind. Da war dieser primären Bildschirm für Verbindungen, die Lebensdauer verlängert, sollte deutlich giftige Chemikalien nicht in dem re-test festgelegt haben.

Figure 1
Abbildung 1 : Vertreter ergibt sich aus einem hohen Durchsatz Bildschirm und Re-Tests
(A) Survivorship Kurve von einer repräsentativen Negativkontrolle Platte in der re-test-Test verwendet. Diese Kurve wurde gebaut von scoring alle lebenden und toten Würmer in den 24 Vertiefungen in diesem Assay 4 Mal in den 18 Tagen des Tests verwendet. Am 18. Tag des Erwachsenenalters Kontrollen wurden um ca. 5 % ige Überlebensrate haben bewertet und alle Kontroll-Test und Platten wurden dann auch bewertet. (B) Tabelle fasst die Ergebnisse des Bildschirms und erneut testen. (C) Binning der Brunnen im Durchschnitt Prozent lebendig Partituren für Kontrolle und Test Bedingungen vom Bildschirm erneut testen. Für Steuerelemente bestehen Partituren aus 48 Brunnen jeweils der Durchschnitt der 3 Wiederholungen aus. Testergebnisse bestehen aus 179 Brunnen jeweils die gemittelten Ergebnis von drei Wiederholungen aus. Abbildung 1 wird von einer früheren Veröffentlichung1wiedergegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Vertreter ergibt sich aus einem Kandidaten-Bildschirm
(A) Binning der Ergebnisse aus den 50 µM Kandidat Bildschirm. 139 Test-gut-Ergebnisse stellen die gemittelten Prozent lebendig Partitur aus 5 Wiederholungen. Die 32 Negativkontrolle Ergebnisse bestehen aus gemittelten Prozent lebendig Partituren von 8 Wiederholungen. Die 4 Positivkontrolle Ergebnisse bestehen aus gemittelten Prozent lebendig Partituren aus 4 Wiederholungen (16 insgesamt Brunnen mit NP1 bei 50 µM). (B) Binning der Ergebnisse aus dem 100 µM Kandidat Bildschirm. Alles ist das gleiche wie in (A), außer dass die Testgefäße und Positivkontrollen bei 100 µM Konzentrationen behandelt wurden. Die gleichen negativen Steuerplatten entnehmen Sie bitte sowohl (A und B). (C) Vertreter ergibt sich aus neu erzielte die Platten einen relativ extreme späten Zeitpunkt. Positivkontrollen dramatisch besser als alle anderen wenn nur Bilanzierung der Prozent der Brunnen mit live Würmer zu diesem Zeitpunkt die gegen Testgefäße voreingenommen ist, wie im Haupt-Text und Tabelle 1beschrieben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Binning von gemittelten Prozent lebendig Partituren
Gruppierte Scores Alle Toten (0) 1-10 11-20 21-30 31-40 > 41
Re-test
# (-) Steuerung 16 31 1 0 0 0
# der Test-Wells (50 µm) 46 69 50 8 3 3
Kandidaten-Bildschirm
# (-) Steuerung 0 11 21 0 0 0
# der (+) Steuern (50 µm) 0 0 2 2 0 0
# der (+) Steuern (100µM) 0 0 0 0 2 2
# der Test-Wells (50 µm) 94 22 21 2 0 0
# der Test-Wells (100µM) 86 25 21 6 1 0

Tabelle 1: Vertreter ergibt sich aus verschiedene Bildschirmen binning
Hier präsentieren wir Ihnen das binning von der gemittelten Prozent lebendigen Partituren aus den beiden Bildschirmen (erneut testen und Kandidat). Im re-test-Bildschirm die Spitze ist ähnlich wie die negativ-Kontrolle mit der Re-tests übertrifft die Negativkontrolle dramatisch auf der rechten Seite (langlebig) Seite des Tisches. Dies zeigt das Vorhandensein von mehreren pro-Langlebigkeit-Verbindungen in der re-test vorhanden. Bildschirm "Kandidat" sehen wir, dass die Spitze in der alle Toten Kategorie, zwar gibt es auch eine scheinbare Signal von der rechten Seite der Tabelle. Dies zeigt das Vorhandensein von pro-Langlebigkeit Verbindungen in der Kandidat Satz, sondern auch zeigt das Vorhandensein von erheblichen Toxizität unter der Kandidat Satz von Verbindungen.

Discussion

Hier haben wir eine einfache Methode zur Kultivierung von C. Elegans in 96-Well Platten beschrieben. Wir beschreiben diese Kulturen für den Einsatz in chemischen Screening und Lebensdauer Assays, aber sie eignet sich für viele Arten von Tests. Während Multi-gut Kulturbedingungen für chemische Screening gemeldeten8 bisher, weicht Lebensdauer Analyse10einschließlich, der hier beschriebenen Test in mehrfacher Hinsicht. Hier beschriebenen Lebensdauer-Assay nutzt 96-Well Platten, stützt sich auf sterile Mutanten (anstelle von chemischen Sterilisation), Agar Kulturbedingungen verwendet, nutzt einfache Flüssigkeit, die Handhabung, um Würmer zu verschieben und wird manuell am Endpunkt ausgewertet. Die unterschiedlichen Ansätze in diesem Assay verwendet möglicherweise Hilfe für Forscher auf der Suche nach screening-Verfahren, die zu diesen Bedingungen gehören.

Wesentliche Elemente dieses Protokolls im Zentrum vor allem der Qualität der Platten produziert für den Assay. Erstens bei der Platten ist es zwingend notwendig, dass die Agar-Oberfläche Blasen-und andere Mängel ist. Diese Variationen in der Agar-Oberfläche führen fast immer zu wühlen und Verlust des Brunnens. Zweitens setzt dieses Protokoll auf abtrocknen Flüssigkeiten, die während der Installation und betäubte hinterlegt. Es ist wichtig, dass diese Flüssigkeiten werden vollständig entfernt, aber der Agar wird nicht austrocknen. Gerüchten zufolge scheint es, dass Würmer in Vertiefungen, die nicht vollständig getrocknet (Schwimmen in Flüssigkeit) länger leben als ordnungsgemäß getrockneten Brunnen während übermäßig Trocknen der Platten zu Austrocknung und Rissbildung des Nährbodens, das führt führt zu wühlen und Verlust Wurm. Ein weiterer entscheidender Bestandteil dieses Protokolls ist sterile Bedingungen beibehalten. Wie bei jedem Assay Lebensdauer gibt es eine Menge Arbeit beteiligt mit dem Teller-Setup, und viele Möglichkeiten und Zeit für Assay Kontamination zu begleichen und wachsen auf den Tellern zu ruinieren.

Während der hier beschriebenen Lebensdauer-Test für das Screening von Verbindungen in C. Elegansnützlich ist, ist es beschränkt sich auf bestimmte genetische Hintergründe, wie es stützt sich auf eine Temperatur empfindlich (ts) sterile Sorte; Wir verwendeten TJ1060, die hohe Sterilität Penetranz hat. Dies schränkt die Stämme zur Verfügung für das Screening mit dieser Methode. Alternative Ansätze einschließlich Kreuzung ts sterile Mutationen in den gewünschten Hintergrund oder mit chemischen Sterilisation. Chemische Sterilisation mit diesem Test haben wir nicht versucht, aber es sollte möglich sein. Mögliche Hürden gehören die Würmer den Sterilisator Inverkehrbringen, zum richtigen Zeitpunkt und in der richtigen Dosis. Das Protokoll beschrieben verwendet hier einen liquiden Dispenser, der ist schnell, aber erscheint nicht auf Erwachsene effektiv zu verzichten. Also, diese Würmer auf den Tellern zu entwickeln und müssen daher mit der Sterilisation chemische auf den Tellern behandelt werden. Bestimmung der optimalen Dosis und Zeitpunkt wäre wichtig für den Erfolg. Alternative Strategien gehören mit einer Abgabe Methode, die Erwachsene bewegen können. In der Vergangenheit haben wir festgestellt, dass Maschinen in der Lage zu erkennen und sortieren Erwachsene in der Regel viel langsamer als die einfache liquid Handler die homogene Schlämme von suspendierten Larve verzichten kann.

Im Allgemeinen verwenden wir diese Methode, um schnell Bildschirm Chemikalien und Behandlungen für große positive Auswirkungen auf die Lebensdauer. Die Methode ist besonders effektiv, wenn Sie mit mehreren Dosen verwendet, hohe Zahlen zu replizieren, und eine engmaschige Überwachung der Negativkontrollen, die immer gepflegt und unter den Prüfplatten durchsetzt. Positivkontrollen sind auch nützlich beim Entwerfen und implementieren die Bildschirme in diesem Manuskript beschrieben. Jedoch um eine effektive positiv zu sein, müsste die Steuerung ziemlich potent und/oder sehr robust sein. Wenn der Bildschirm ursprünglich bereitgestellt wurde, konnte eine entsprechend starke und robuste Verbindung nicht identifiziert werden. Derzeit gibt es viele Berichte in der Literatur "Altern" der wahrscheinliche Kandidaten für Positivkontrollen nützlich in den Bildschirmen des hier beschriebenen. Wie im Abschnitt Kandidat Bildschirm des Abschnitts erwarteten Ergebnisse dieser Handschrift und in Abbildung 2 und Tabelle 1beschrieben, ist die Verbindung NP1 eine wirksame positive Kontrolle für diesen Bildschirm. Wir bestätigen im Allgemeinen positiven Hits aus dieser Bildschirme mit standard-Lebensdauer-Assays auf 3 mm Kultur Platten.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass keine Finanzierung Entität, die diese Arbeit unterstützen jede Eingabe auf Sammlung von Daten, Analyse der Ergebnisse oder die Entscheidung, zu veröffentlichen.

Acknowledgments

Wir danken Dipa Bhaumik, Aaron Miller und Bob Hughes für technische Hilfe. Stämme lieferte die CGC, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Wir sind dankbar für Georgia Woods und Mitglieder der Lithgow, Kapahi und Melov Labs für nützliche Diskussionen. M.l. wurde vom National Institute of Health (NIH) Ausbildung Grant T32 AG000266 und ein Ellison Medical Foundation/American Federation von Aging Postdoc Forschungsstipendium gefördert. Diese Arbeit durch einen Zuschuss von BioAge Labs unterstützt wurde, ein Larry L. Hillblom Foundation Grant sowie National Institutes of Health gewährt UL1024917, Förderung der interdisziplinären Forschungs-Konsortium auf Geroscience und 1R01AG029631-01A1, G.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Miller Granules VWR
Unispense  Wheaton Science Products automated fluid dispensing apparatus
96 well assay plate; COSTAR 3370 Corning
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser Thermo Fisher Scientific
manufactored worm pick Genesee Scientific
Belly Dancer Orbital Shaker Stovall Life Science inc.
microplate shaker; MTS 2/4 Digital IKA Works, inc. 
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler  Beckman Coulter
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor  Sorenson Bioscience, inc.
manual 8 or 12 multi-channel pipettes we use rainin…
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film  USA Scientific
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R Eppendorf

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References

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Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in <em>Caenorhabditis Elegans</em>
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Lucanic, M., Garrett, T., Gill, M. S., Lithgow, G. J. A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (133), e56892, doi:10.3791/56892 (2018).More

Lucanic, M., Garrett, T., Gill, M. S., Lithgow, G. J. A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (133), e56892, doi:10.3791/56892 (2018).

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