Her beskriver vi en enkel protokoll for å raskt produsere hundrevis av Rundormer vekst medier agar, 96-brønnen plater med konsekvent antall Caenorhhabditis elegans per brønn. Disse kulturene er nyttige for fenotypiske screening av hele organismer. Vi fokuserer her om bruk av disse kulturene skjermen kjemikalier for Pro levetid effekter.
Caenorhabditis elegans er en nyttig organisme for testing av kjemiske effekter på fysiologi. Hele organismen små molekyl skjermer tilby betydelige fordeler for å identifisere biologisk aktive kjemiske strukturer som kan endre komplekse fenotyper som levetid. Beskrevet her er en enkel protokoll for å produsere hundrevis av 96-brønnen plater med ganske konsekvent antall C. elegans i hver brønn. Neste, vi angitt hvordan du bruker disse kulturene skjermen tusenvis av kjemikalier for effekten på levetid Rundormer C. elegans. Denne protokollen bruker temperatur følsom sterilt stammer agar plate vilkår og enkel dyr håndtering for å lette rask og høy gjennomstrømning produksjon av synkronisert dyr kulturer for screening.
Her beskrives en protokoll som ble utviklet for høy gjennomstrømning screening av kjemiske forbindelser for effekter på Caenorhabditis elegans levetid. Protokollen er lett tilpasses andre fenotypiske skjermer, inkludert studier utnytte reporter C. elegans stammer. Denne protokollen ble vellykket benyttet for å identifisere en roman biologisk aktive sammensatt, NP1 (nitrophenyl-piperazin 1), som sterkt forlenger levetiden C. elegans gjennom en kosten restriksjon mekanisme. NP1 og karakteristikk av effekten på levetid, inkludert en beskrivelse av genetisk veier til spille var tidligere beskrevet andre steder1. Rapporten inneholder også en beskrivelse av resultatene fra en omfattende implementering av skjermen. Her beskriver vi i mye større detalj metoder og oppsett av skjermen, som passer for både små og store storskala programmer.
Målet som førte til etableringen av protokollen beskrevet her var å utvikle en C. elegans kultur plattform som tillatt for rask screening av store kjemiske biblioteker for romanen biologisk aktive forbindelser. Mens kjemiske skjermer er utført før utviklingen av denne protokollen, disse var hovedsakelig små og/eller kandidat type tilnærminger2,3. Faktisk utnyttet de fleste skjermene i laboratoriet på titalls forbindelser stress motstand analyser, med treff blir vist for levetid effekter4. Denne studien forsøkte i stedet å direkte skjermen for levetid effekter. Bemerkelsesverdig, var det noen beskrivelser i vitenskapelig litteratur ved utføring av storskala kjemiske skjermer med C. elegans. Faktisk, sammenlignet med andre typer skjermer5,6,7, store kjemiske screening med C. elegans syntes å være under-ansatt.
Det var to beskrivelser av storskala kjemiske skjermer i C. elegans som brukes som grunnlag for å utvikle denne tilnærmingen. Først av disse var en elegant studie fra Peter Roy’s laboratory bruker kjemiske skjermer for å identifisere forbindelser som kunne forurolige utviklingen av dyr. Studien deretter fulgt opp med en frem mutagenese skjermen å identifisere genetiske målene av disse kjemikaliene8. Protokollen beskrevet i folkloristikken brukes 24-vel pates, som var bare for denne studien behov (begrensede mengder av kjemiske i biblioteket og begrenset tilgjengelig inkubator plass). Den andre studien var Michael Petrascheck’s innovative og ambisiøs liten-molekylet skjermen for levetid utvide kjemikalier9,10. At studien brukte 384-vel plater og flytende kulturer. Andre Hovedtrekket av denne skjermen var bruk av FUDR (5-fluorodeoxyuridine) å hemme kjemisk avkom produksjon. Etter mye overveielse av protokollen beskrevet i folkloristikken ble både kjemiske sterilisering og flytende kulturer C. elegans unngått.
Selv om FUDR er mye brukt i C. elegans levetid eksperimenter, var det bekymring at FUDR kan forårsake uventede interaksjoner, eller at FUDR selv kan ha noen effekt på levetid. Nylig er denne siste bekymringen validert, minst i noen konsentrasjoner og spesielt i 25 ° C11. For å omgå problemet med avkom forurensning, C. elegans belastning TJ1060 ble brukt, som havner to uavhengige temperatur følsom mutasjoner (spe-9 (hc88) jeg; rrf-3(b26)II) avskaffe sperm produksjon og har vist seg for å være nyttig for masse kulturer synkron bestander12. Denne stammen var absolutt bakteriefri ved 25 ° C, men vil produsere avkom når kultivert på 15-20 ° C. Denne studien brukte konvensjonelle oppdrettsforholdene, med ormer kravlesøk på overflaten av agar, som resultatene med flytende kulturer ikke er alltid reproduserbare med konvensjonelle agar plater. Mens dette fenomenet ikke er fullstendig forstått, har det vært vist at ormer kultivert i flytende svare på DR (kosttilskudd restriksjon) på en annen måte enn ormer kultivert målestokk media13,14. Det er derfor sannsynlig at flytende media kan maskere noen DR mimetics som ellers ville være identifisert med skjermen.
Har avgjort på agar kultur forholdene, ble ulike alternativer for scoring resultatene av brønner i denne analysen vurdert. Mens ulike automatisert eller tenkelig basert analyser var tilgjengelig, nødvendiggjort de anskaffelse og distribusjon av teknisk utfordrende enheter, de fleste som var uoverkommelig dyrt. Mens vurderer disse alternativene, var det avgjørende å referere til tidligere levetid skjermer av alle typer. Til slutt, denne studien brukte en scoring metoden tilpasset fra Siu Sylvia Lee laboratoriets hele genomet RNAi skjermen for levetid fenotyper15. Spesielt alle levetid platene ble satt opp på samme måte, men bare negative kontrollene ble overvåket. Når negativ kontroll platene ble bekreftet for å ha nær fullstendig dødelighet, ble test plater scoret for hånd. I denne store skjermen, ble positive bekreftet av re-testing nylagde kjemikalier med tre eksemplarer gjentar av av primære positive.
Her har vi beskrev en enkel metode for dyrking C. elegans i 96-brønnen plater. Vi beskriver disse kulturene for bruk i kjemiske screening og levetid analyser, men de kan brukes for mange typer analyser. Mens flere godt kultur betingelser for kjemiske screening har tidligere vært rapportert8, forskjellig inkludert for levetid analyse10, analysen beskrevet her på flere måter. Levetid analysen beskrevet her benytter 96-brønns plater, avhengig av sterile mutanter (i stedet for kjemiske sterilisering), bruker agar kultur betingelser, bruker enkel væske håndtering for å flytte ormer og er manuelt scoret på sluttpunktet. De ulike tilnærmingene brukt i denne analysen kan være til hjelp for forskere leter etter screening metoder med disse betingelsene.
Avgjørende elementer til denne protokollen sentrerer hovedsakelig på kvaliteten på platene produsert for analysen. Først når platene er det viktig at agar er bobler og andre defekter. Variasjonene i agar overflaten fører nesten alltid til gravende og tap av brønnen. Denne protokollen bruker andre tørking av væsker avsatt under Oppsett og dopet etappene. Det er viktig at disse væsker er fullstendig fjernet, men agar ikke blitt tørket ut. Anecdotally, ser det ut til at ormer i brønner som ikke helt tørket (svømming i væske) lever lenger enn ordentlig tørkede brønner, mens over tørking av platene fører til uttørking og sprengning av agar, som fører til ormen gravende og tap. Et annet viktig element i denne protokollen er å opprettholde sterile forhold. Som med alle levetid analysen, det er mye arbeid involvert med plate oppsett, og mange muligheter og tid finnes for analysen ødelegger forurensning å bosette seg og vokse på platene.
Levetid analysen beskrevet her er nyttig for screening av forbindelser i C. elegans, er det begrenset til bestemte genetisk bakgrunn, som den er avhengig av en temperatur sensitive (ts) sterilt stamme; Vi brukte TJ1060, som har høy sterilitet penetrance. Dette begrenser tilgjengelig for screening toner med denne metoden. Alternative tilnærminger inkludert krysset ts sterilt mutasjoner i ønsket bakgrunnen eller bruke kjemiske sterilisering. Vi har ikke prøvd kjemiske sterilisering med denne analysen, men det bør være mulig. Potensielle hekk inkluderer plassere sterilisatoren på ormer på riktig scenen og det lated dosen. Protokollen beskrevet bruker her en flytende dispenser er rask, men synes ikke å dispensere voksne effektivt. Så disse ormene utvikle på platene, og derfor må behandles med sterilisering kjemiske på platene. Bestemme den optimale dosen og timing vil være viktig for å lykkes. En alternativ strategi inkluderer bruk av en dispensering metode som kan flytte voksne. Tidligere har vi funnet at maskiner kunne identifisere og sortere voksne er vanligvis mye tregere enn enkel flytende handlers, som kan dispensere homogen slam av suspendert larve.
Generelt, bruker vi denne metoden til raskt skjermen kjemikalier og behandlinger for store positive effekter på levetid. Metoden er spesielt effektive når de brukes med flere doser, høy gjenskape tall og lukke overvåking av negative kontroller som alltid opprettholdes og ispedd blant test platene. Positiv kontroller er også nyttige når designe og implementere skjermene beskrevet i dette manuskriptet. Men for å være en effektiv positiv, må kontrollen være ganske potent og/eller svært robust. Når skjermen var opprinnelig kunne en passende potent og robust sammensatt ikke identifiseres. Aktuelle, er det mange rapporter “aldrende” litteraturen i sannsynlige kandidater for positiv kontroller nyttig skjermene beskrevet her. Som beskrevet i delen kandidat skjermen i delen forventede resultater i denne oppgaven og i figur 2 og tabell 1, er den sammensatte NP1 effektiv positiv kontroll for denne skjermen. Vi bekrefte generelt positiv treff fra disse skjermene med standard levetid analyser på 3 mm kultur plater.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dipa Bhaumik, Aaron Miller og Bob Hughes for teknisk assistanse. Stammene ble gitt av CGC, som finansieres av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Vi er takknemlige for Georgia skogen og medlemmer av Lithgow, Kapahi og Melov Labs for nyttig diskusjoner. M.L. ble støttet av National Institutes of Health (NIH) opplæring Grant T32 AG000266 og en Ellison medisinsk Foundation/American Federation av aldring forskning Post-Doctoral fellesskap. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra BioAge Labs, gir Larry L. Hillblom Foundation stipend, samt National Institutes of Health UL1024917, støtter tverrfaglig forskning konsortiet på Geroscience og 1R01AG029631-01A1 til G.J.L.
LB Broth Miller Granules | VWR | ||
Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |