Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

doi: 10.3791/56892 Published: March 20, 2018

Summary

Her beskriver vi en enkel protokoll for å raskt produsere hundrevis av Rundormer vekst medier agar, 96-brønnen plater med konsekvent antall Caenorhhabditis elegans per brønn. Disse kulturene er nyttige for fenotypiske screening av hele organismer. Vi fokuserer her om bruk av disse kulturene skjermen kjemikalier for Pro levetid effekter.

Abstract

Caenorhabditis elegans er en nyttig organisme for testing av kjemiske effekter på fysiologi. Hele organismen små molekyl skjermer tilby betydelige fordeler for å identifisere biologisk aktive kjemiske strukturer som kan endre komplekse fenotyper som levetid. Beskrevet her er en enkel protokoll for å produsere hundrevis av 96-brønnen plater med ganske konsekvent antall C. elegans i hver brønn. Neste, vi angitt hvordan du bruker disse kulturene skjermen tusenvis av kjemikalier for effekten på levetid Rundormer C. elegans. Denne protokollen bruker temperatur følsom sterilt stammer agar plate vilkår og enkel dyr håndtering for å lette rask og høy gjennomstrømning produksjon av synkronisert dyr kulturer for screening.

Introduction

Her beskrives en protokoll som ble utviklet for høy gjennomstrømning screening av kjemiske forbindelser for effekter på Caenorhabditis elegans levetid. Protokollen er lett tilpasses andre fenotypiske skjermer, inkludert studier utnytte reporter C. elegans stammer. Denne protokollen ble vellykket benyttet for å identifisere en roman biologisk aktive sammensatt, NP1 (nitrophenyl-piperazin 1), som sterkt forlenger levetiden C. elegans gjennom en kosten restriksjon mekanisme. NP1 og karakteristikk av effekten på levetid, inkludert en beskrivelse av genetisk veier til spille var tidligere beskrevet andre steder1. Rapporten inneholder også en beskrivelse av resultatene fra en omfattende implementering av skjermen. Her beskriver vi i mye større detalj metoder og oppsett av skjermen, som passer for både små og store storskala programmer.

Målet som førte til etableringen av protokollen beskrevet her var å utvikle en C. elegans kultur plattform som tillatt for rask screening av store kjemiske biblioteker for romanen biologisk aktive forbindelser. Mens kjemiske skjermer er utført før utviklingen av denne protokollen, disse var hovedsakelig små og/eller kandidat type tilnærminger2,3. Faktisk utnyttet de fleste skjermene i laboratoriet på titalls forbindelser stress motstand analyser, med treff blir vist for levetid effekter4. Denne studien forsøkte i stedet å direkte skjermen for levetid effekter. Bemerkelsesverdig, var det noen beskrivelser i vitenskapelig litteratur ved utføring av storskala kjemiske skjermer med C. elegans. Faktisk, sammenlignet med andre typer skjermer5,6,7, store kjemiske screening med C. elegans syntes å være under-ansatt.

Det var to beskrivelser av storskala kjemiske skjermer i C. elegans som brukes som grunnlag for å utvikle denne tilnærmingen. Først av disse var en elegant studie fra Peter Roy's laboratory bruker kjemiske skjermer for å identifisere forbindelser som kunne forurolige utviklingen av dyr. Studien deretter fulgt opp med en frem mutagenese skjermen å identifisere genetiske målene av disse kjemikaliene8. Protokollen beskrevet i folkloristikken brukes 24-vel pates, som var bare for denne studien behov (begrensede mengder av kjemiske i biblioteket og begrenset tilgjengelig inkubator plass). Den andre studien var Michael Petrascheck's innovative og ambisiøs liten-molekylet skjermen for levetid utvide kjemikalier9,10. At studien brukte 384-vel plater og flytende kulturer. Andre Hovedtrekket av denne skjermen var bruk av FUDR (5-fluorodeoxyuridine) å hemme kjemisk avkom produksjon. Etter mye overveielse av protokollen beskrevet i folkloristikken ble både kjemiske sterilisering og flytende kulturer C. elegans unngått.

Selv om FUDR er mye brukt i C. elegans levetid eksperimenter, var det bekymring at FUDR kan forårsake uventede interaksjoner, eller at FUDR selv kan ha noen effekt på levetid. Nylig er denne siste bekymringen validert, minst i noen konsentrasjoner og spesielt i 25 ° C11. For å omgå problemet med avkom forurensning, C. elegans belastning TJ1060 ble brukt, som havner to uavhengige temperatur følsom mutasjoner (spe-9 (hc88) jeg; rrf-3(b26)II) avskaffe sperm produksjon og har vist seg for å være nyttig for masse kulturer synkron bestander12. Denne stammen var absolutt bakteriefri ved 25 ° C, men vil produsere avkom når kultivert på 15-20 ° C. Denne studien brukte konvensjonelle oppdrettsforholdene, med ormer kravlesøk på overflaten av agar, som resultatene med flytende kulturer ikke er alltid reproduserbare med konvensjonelle agar plater. Mens dette fenomenet ikke er fullstendig forstått, har det vært vist at ormer kultivert i flytende svare på DR (kosttilskudd restriksjon) på en annen måte enn ormer kultivert målestokk media13,14. Det er derfor sannsynlig at flytende media kan maskere noen DR mimetics som ellers ville være identifisert med skjermen.

Har avgjort på agar kultur forholdene, ble ulike alternativer for scoring resultatene av brønner i denne analysen vurdert. Mens ulike automatisert eller tenkelig basert analyser var tilgjengelig, nødvendiggjort de anskaffelse og distribusjon av teknisk utfordrende enheter, de fleste som var uoverkommelig dyrt. Mens vurderer disse alternativene, var det avgjørende å referere til tidligere levetid skjermer av alle typer. Til slutt, denne studien brukte en scoring metoden tilpasset fra Siu Sylvia Lee laboratoriets hele genomet RNAi skjermen for levetid fenotyper15. Spesielt alle levetid platene ble satt opp på samme måte, men bare negative kontrollene ble overvåket. Når negativ kontroll platene ble bekreftet for å ha nær fullstendig dødelighet, ble test plater scoret for hånd. I denne store skjermen, ble positive bekreftet av re-testing nylagde kjemikalier med tre eksemplarer gjentar av av primære positive.

Protocol

1. klargjør buffere

  1. LB kjøttkraft
    1. Bruk ferdigblandet granulater (se Materialer tabell) og følger produsentens protokollen for forberedelse.
  2. Rundormer vekst medier (NGM) Agar
    1. Bland 23 g agar, 3 g av NaCl, 2.5 g av bacto pepton, og deionisert vann 0.972 L. Autoclave og la avkjøle til 60 ° C, deretter legge 25 mL 1 M kalium fosfat (KPO4) bufferen (pH 6.0), 1 mL 1 M magnesium sulfat (MgSO4) , 1 mL 1 M veisalt (CaCl2) og 1 mL av 5 mg/mL kolesterol (i etanol).
  3. Hypokloritt løsning
    1. Bland 5 mL 5 m KOH, 4 mL natriumhypokloritt løsning (6%) og deionisert H2O til et totalt volum på 50 mL.
  4. S basale
    1. Bland 5 g av NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4og de-ionisert vann til 1 L, deretter autoclave.

2. forberedelse av konsentrert E. coli (OP50)

Merk: Dette trinnet konsentrerer 1 L en mettet E. coli løsning i 25 mL S basale bufferen.

  1. Vaksinere 5 mL av autoklaveres LB kjøttkraft (trinn 1.1) med en enkelt koloni av E. coli (belastning OP50), og ruge for 4-6 h på 37 ° C med skjelvende (250 rpm). Bruk 0,1 mL løsningen for å vaksinere 1 L LB i en 2 L Erlenmeyer kolbe. Inkuber de 1 L flasker overnatting (12-16 h) på 37 ° C med skjelvende (250 rpm).
  2. Sentrifuge 1 L overnatting kulturer i 500 mL sentrifuge flasker for 5 min på 10.000 x g og 4 ° C pellets bakterier og Dekanter bort gjenværende media. Resuspend pellets i 25 mL av basale S (trinn 1.4). Butikken på 4 ° C.

3. forberedelse av NGM kultur plater

  1. For massekulturen plater brukt til å produsere mange ormer, dispensere 30 mL av smeltet (60 ° C) NGM agar (trinn 1.2) i en laminær strømning skap på 10 cm kultur plater med et automatisert væske dispensering apparat eller en serologisk pipette. La tørre over natten.
  2. Pipetter 2 mL konsentrert OP50 på hver 10 cm plate, sprer seg dekker agar overflaten av skråstilt og rotert platen, så la platene tørke. Lagre plater på 4 ° C 2 uker.
  3. For høy gjennomstrømning analysen kultur plater brukes for screening, bruke en automatisert 8 kanal dispenser å dispensere 0,15 mL av smeltet NGM agar i hver brønn av en 96 godt plate i et laminær strømning skap. Forsiktighet å gjøre at brønner er blottet for bobler, da dette vil aktivere gravende ormer som vil invadere analysen i det godt. La tørre over natten. Lagre plater på 4 ° C 2 uker.

4. forberedelse av temperatur Sensitive (ts) sterilt C. Elegans masse kulturer

  1. For å starte kulturer, med en "ormen plukke" (en glass pipette med en vedlagt platina wire eller produsert ormer Velg) under dissecting mikroskop, overføre 20 egg (belastning TJ1060: spe-9 (hc88) jeg, rrf-3(b26)II) på masse kultur plate(s) i trinn 3.1. Deretter ruge platene på 20 ° C for 6 dager (tillater mer enn én generasjon av vekst, som du er målgruppe for samling av avkommet fra 20 eggene flyttet).
  2. Visuelt bekrefte tilstedeværelse av gravid voksne (egg i livmoren) med dissecting mikroskop. Samle gravid voksne ved dispensering 2-3 mL S basale på platen ved hjelp av en glass pipette. Swirl væske rundt tallerkenen for hånd, og deretter samle væske i en 15 mL tube ved hjelp av en glass pipette.
  3. Nedspinning røret (1000 x g for 1,5 min ved 20 ° C) pellets ormer, og Sug opp av nedbryting. Legge til 10 mL hypokloritt løsning (trinn 1.3) ormen pellets og raskt rist røret for hånd i en topp-til-bunn-retning for 5 s. Incubate i 5 minutter, risting hvert 2,5 minutt.
  4. Igjen, spinne ned røret (1000 x g i 1,5 minutter); pellet skal gulbrun. Sug opp av nedbryting. Legge til 10 mL hypokloritt løsning egg pellets og rist kraftig røret. Inkuber 1-3 min, med sporadiske risting, og mens overvåking utseende med dissecting mikroskopet. Visuelt Bekreft bare egg er igjen, og gå videre til neste trinn.
  5. Nedspinning røret (1000 x g for 1,5 min) og Sug opp av nedbryting. Pellet skal hvit med ingen brun farge.
    Merk: Etter fjerning av hypokloritt løsningen, er det viktig å bruke sterilt teknikker og buffere, siden forurensning (bakterier og sopp, spesielt) kan ødelegge eksperimentet, kaste bort verdifull tid og reagenser. Denne studien brukte en filtrert laminær strømning skap og flyttet væske med bare sterile Pipetter og tips.
  6. Åpne rør i et sterilt mellomrom. Vask pellet 3 ganger med S basale, spinning ned (1000 x g for 1,5 min) og aspirating unna nedbryting hver gang. Nytt avbryte egg pellet 2-3 mL S basal. Disse egg kan nå brukes for en overnatting luke i buffer samle L1 Larven (trinn 5).

5. klekking C. Elegans egg i Buffer for å få synkron kulturer (forbereder L1 larver C. Elegans )

  1. Dekanter egg pellets og buffer i et sterilt glass Petriskål med et lokk. Skyll de gjenværende egg fra røret i en parabol med en serologisk pipette med 2-3 mL S basal. Legge til 5 mL av S basale å lette trengsel, som dette kan oppmuntre klekking, som vil lyse risting (20 rpm med en magedanser orbital shaker). Ruge over natten ved 20 ° C, for å tillate egg tid å Luke (16-24 h). Alle skilpadder vil arrestere på 1st larvestadiet (L1) av mat.
    Merk: Anekdotiske bevis indikerer at fersk L1 forberedelsene (16-36 h etter høsting) generere mest synkron bestander av voksen ormer.
  2. Samle L1s i en 15 mL tube med en serologisk pipette. Nedspinning L1s i en sentrifuge (1000 x g for 1,5 min), Sug opp unna nedbryting og gjenta til alle L1s er samlet inn fra klekking plater, mens 10 mL av S basal for neste trinn.
  3. Fra tuben inneholder L1s, brønnene ut 0,01 mL (umiddelbart etter blanding) og kvitte deg det på en unseeded (ingen E. coli) NGM plate. Telle antall L1s på tallerkenen. Gjenta 10 ganger og få et gjennomsnitt for hvor mange L1s i hver aliquot. Vanligvis forvent mellom 1-3 L1s per µL (når starter med 1 masse kultur plate inneholder 20 egg).
  4. Bestemme med en serologisk pipette volumet av S basale holder L1s. Deretter ekstrapolere med bestemt gjennomsnittlig antall ormer per 0,01 mL, innhentet i forrige trinn, til å beregne antall L1s. Vanligvis forvent mellom 10000-30000 L1s (per masse kultur plate inneholder 20 egg).
  5. For å bruk denne kulturen i 96-brønnen analysen, fortynne L1 suspensjon 1 L1 per µL i et sterilt runde media flaske, og deretter videre til trinn 7. Hvis denne kulturen som skal brukes til å generere flere C. elegans masse kulturer, og fortsett med trinn 6.

6. storskala synkron kultur forberedelse

Merk: L1 løsninger kan brukes raskt øke ormen populasjoner.

  1. Vil generere store ormen tall med en L1-løsning, dispensere opp til 5000 L1s på hver av ønsket antall massekulturen plater. Samle gravid voksne 2,5 dager senere (20 ° C) som beskrevet i trinnene 4.1-2, og gå videre til trinn 4.3 å samle egg.
  2. Det har anecdotally vært observert at gjentatt hypokloritt samling kan understreke kuet befolkningen, delt bestander av egg plukking for overføringen før utsette den gjenværende befolkningen til hypokloritt behandlinger, så det mangfoldig generasjoner av befolkningen er ikke gjentatte ganger utsettes for hypokloritt løsning behandling.

7. oppsett av 96-brønns analysen plater

  1. Lar analysen plater (forberedt i trinn 3.3) til romtemperatur. Deretter, i en laminær strømning skap, Legg 5 µL av konsentrert OP50 (forberedt i trinn 2.2) i hver brønn. Som før, bruk en automatisert 8 kanal dispenser.
  2. Legge til 10 µL av L1 suspensjon i hver brønn ved å bruke en automatisert 8 kanal dispenser. Dette vil gi på gjennomsnittlig 10 ormer per Vel, siden de er tilstede i suspensjon 1 L1 per µL. For å fremme lik fordeling av L1s fra slurry, dispensere L1s fra en runde media flaske aktivt blandet med en moderat langsomt slå rør bar.
  3. Dekkramme med lokk, boksen grupper av platene og ruge ved 25 ° C i 2 dager.

8. behandle 1 st dag voksen C. elegans kjemikalier

  1. Fjerne kjemiske biblioteket plater fra fryseren, og la platene til romtemperatur før du fortsetter.
    Merk: Kjemiske biblioteket platene som beskrevet her er 96 bra plater som inneholder diskrete forbindelser i hver brønn, alle er på samme konsentrasjonen og oppløst i DMSO. Disse bibliotekene utnytter ikke ytre kolonnene, og så hver plate har maksimalt 80 distinkte kjemikaliene. I protokollen beskrevet her, er bibliotek konsentrasjonen 10 mM. Det er viktig å vurdere løsemiddel påvirker fenotyper. Mens denne studien skjermer på en DMSO konsentrasjon på 0,5%, ble aldri dette nivået overskredet disse levetid analyser og lav overføringshastighet analyser, hvor det er mer sannsynlig å plukke en sammensatt lagerløsning konsentrasjon. Denne protokollen overstiger ikke 0,25%, som er en grad som levetid endringer ikke forekommer16, minst i N2 belastningen.
  2. Forsiktig risting plate på 60 rpm på en microplate shaker for 1 min umiddelbart før å bruke.
  3. Bruker en automatisert 96-brønns flytende handler, overføring 0,75 µL av sammensatte (DMSO) fra biblioteket platen til analysen plate. Dybden av pipette under flytende levering til analysen plate styres nøye, slik at pipette tips av flytende behandleren leverer 0,75 µL volumet til ~ 15 µL av flytende på overflaten av agar (med ormer og konsentrert OP50 fra trinn 7.1 -2) og ikke pierce agar overflaten i brønnen. Ikke bruk manualen 8 eller 12 flerkanals Pipetter bortsett fra i veldig små skjermer (< 10 plater), som de kan øke feil og ofte resultere i punktering av agar overflaten, som truer analysen.
  4. Forberede kjemiske biblioteket negativ kontroll plater med DMSO (dimethyl sulfoxide), forutsatt at biblioteket testes bruker DMSO som løsemiddelet. Gjør 1 negativ kontroll plate for hver 5 test plater, opp til 10 negativ kontroll plater. Hvis mulig, også gjøre en positiv kontroll plate (NP11 til 20 mM for en siste analysen konsentrasjon av 0,1 mM, gjelder for dette formålet; se representant resultater delen). Ikke Legg kjemikalier (test eller kontroll) til 2 utvendige kolonnene av platene, som de er spesielt utsatt til uttørking.

9. tørking kulturer

  1. For å fjerne væske fra overflaten av agar, tørr plater i laminær strømning kabinett for 4-8 h. Det er viktig at disse platene er tørket helt, men ikke blitt desiccated. Noen plater vil ta lengre tid å tørke enn andre, nøye kontrollere alle platene og fjerne så snart de er tørre. Bekreft tørking av forsiktig visuell inspeksjon av enkelte av platen.
    Merk: Avhengig av faktorer som inkluderer eksos frekvensen av kabinettet, tiden dette tar må empirisk bestemmes. Dette tørking trinnet kan ta ca 4-8 h for en full skap.
  2. Forsegle plater med gjennomsiktige filmen, og deretter sette på plate lokkene.
  3. Spin 96-brønns analysen platene for 45 s 1000 x g.
  4. Lagre plater invertert på 25 ° C.

10. scoring C. Elegans kulturer for lang levetid

  1. Overvåke negativ kontroll plater til > 95% dødelighet er observert. Sjekk plater ukentlig for to første ukene og daglig etterpå. Caenorhabditis kohorter samme belastning og arter kan vise signifikant forskjellig lifespans ved prøve17.
    Merk: For levetid analysen beskrevet her, med TJ1060 dyr kultivert ved 25 ° C, 95% dødelighet i disse populasjonene har oppstått fra voksen dag 16-20.
  2. Når negativ kontroll brønner anses å ha nådd den > 95% merke, spinne ned alle 96-brønns analysen plater for 45 s på en bordplaten sentrifuge med en microplate tilpasset rotoren (250 x g for 45 s ved 20 ° C).
  3. Resultat alle brønner i kontroll platene. Dette gjøres ved å telle og registrere antall levende og døde dyr i hver brønn. Død ormer kan være differensiert fra levende ormer av deres fullstendig mangel på bevegelse. Provosere bevegelse i levende ormer ved å slippe 96 godt platen fra ca 7 cm på dissecting mikroskop overflaten mens du ser gjennom okular for noen evoked respons. Død ormer svarer ikke, og nærliggende lab mates kan ikke sette pris på repeterende støy.
  4. For test plater, telle og registrere bare brønner som inneholder live ormer. Når en levende orm er observert, telle alle levende og døde dyr i så godt, godt posisjon og plate.
    Merk: Det er ofte nyttig å re score platene etter > 99% av negativ kontroll ormer er døde. I stor skala skjermer, kan dette være det beste utgangspunktet gjøre første scoring. Uansett resultat/re-score som beskrevet ovenfor

11. re-testing forbindelser

  1. Når testing bare et lite antall kandidat forbindelser (< 320 forbindelser), som en ny test eller en kandidat skjerm (se representant resultater), begrense analysen 32 sentrale fordelt å minimere mulig plate effekter. Dette går 2 brønnene nærmest kanten av tallerkenen ubehandlet men likevel inneholder agar, mat og ormer.

Representative Results

Vi begynner ved å undersøke representant resultater fra ansette denne protokollen for 96-brønns levetid analyser. I første eksempel metoden ble brukt til skjermen gjennom 30 000 kjemikalier for å kunne identifisere kjemikalier som forlenge levetiden C. elegans, og inneholder også resultater fra oppfølging re-teste skjermen av de beste resultater kjemikalier med den samme protokoll. Disse resultatene ble beskrevet tidligere1. Det andre eksemplet bruker samme protokoll i en mindre skjerm av kandidaten forbindelser.

Store skjermen og re-teste: Store skjermen testing 30.000 forbindelser ble utført på en enkelt dose, i duplikat. Hver kjemisk ble derfor testet i to brønner med en forventet samlet dyr befolkning på 20. Dette ble tre separate sett av 10.000 forbindelser (i duplikat) vist over en periode på ~ 3 måneder til å dekke hele 30.000 forbindelser. Dette ble gjort delvis for å sikre et håndterlig antall manuell scoring på slutten av analysen kreves totalt 260 av 96-brønns analysen platene i hvert av settene. I biblioteket lager plater, bare 80 brønner inneholdt sammensatte; en replikere av 10.000 forbindelser gjør 125 analysen plater. Denne studien brukte 2 gjentak med 10 negativ kontroll plater i hvert sett. For å øke gjennomstrømming, ble plater scoret når negativ kontroll bestander ble vurdert å ha opplevd ~ 99% dødelighet. Alle test brønner ble deretter undersøkt for live ormer.

Kjemikalier i brønner med en levende orm ble kalt treff. Kjemikalier i brønner som inneholder mer enn 1 ormen levende var også kalt treff, og i tillegg alle ormer i de brønnene (levende og døde) ble regnet for å generere en enkel score (prosent i live score, antall levende ormer delt på antall døde ormer). Hver kjemisk i biblioteket kan derfor bli kalt en hit to ganger og de treffene kunne, men kan ikke har score tilknyttet. 512 distinkte kjemikaliene ble kalt treff (minst én gang) fra skjermen på 30.000 forbindelser. Skjermen ble utført å identifisere potent og/eller robust (reproduserbar) Pro levetid effekter. Disse to forskjellige egenskaper kan ha forskjellige effekter. Potent kjemikalier kan dramatisk øke levetid, da vi forventer en høy prosent av å være i live i den kjemiske godt. For robust kjemikalier, ville begge gjentak antas å ha live ormer. Hit-listen ble rangert basert på disse kriteriene. 179 av kjemikaliene gitt høy prosent i live score, eller ble truffet i begge gjentak og ble derfor valgt for re-testing. De fleste av de gjenværende kjemikaliene som ble kalt treff, men ikke valgt for re-testing, inneholdt bare en enkelt orm i live i en av Repliker.

Nytt testing av treff var utført, ligner på primære skjermen bortsett fra med 3 replikat (forventede totale dyr befolkning 30) og forsiktig kvantifisering av lifespans dyrene i ubehandlet kontroll platene. Disse endringene ble lagt til hjelp i sammenlignende test og kontroll brønnene. 179 av kjemiske treff var re bestilt, utvannet til 10 mM, og flyttet til 96 bra plater. Bare indre 24 brønnene ble brukt til å teste analysen (gjeldende versjoner av denne protokollen ville ha brukt indre 32 brønnene som beskrevet i delen protokollen for re-teste skjermer) og forbindelsene ble re-testet i tre eksemplarer med seks negativ kontroll analysen plater behandlet med DMSO løsemiddel. En negativ kontroll plate ble scoret regelmessig for total overlevelse (figur 1A). Når omtrent 95% av kontroll dyrene var døde, alle platene ble helt scoret (alle behandlet leve og død ormer ble regnet).

For å kalle treff fra re-teste resultatene, ble et cut-off gjort på gjennomsnittlig prosent levende score på standardavvikene negativ kontroll 2 (SD). Test brønner, gjennomsnitt prosent levende (på tiden av scoring) score ble beregnet ved gjennomsnittlig prosent i live score fra tre gjentak for hver brønn. For denne spesielle analysen, ble negativ kontroll wells' gjennomsnittlige prosent i live score beregnet som gjennomsnittet av tre replikat 48 brønner (2 sett med plater for tre eksemplarer negativ kontroll). SD pleide å kalle treff fra re-teste kjemiske settet var SD over 48 negative kontrollen gjennomsnitt prosent i live score. Bruker denne strategien, denne studien fant 57 treff fra re-teste biblioteket av 179 forbindelser, viser at totalt 32% av re-teste kjemikalier testet positivt (figur 1B). Binning av gjennomsnitt prosent levende poengsummer for negativ kontroll og test brønnene indikerte at testen brønnene oppnådd kontroll brønnene (figur 1C).

Kandidat skjermen: Småskala skjermer kan utføres på samme måte som å retest beskrevet ovenfor. Her beskriver vi resultatene fra en kandidat skjerm med 139 forbindelser. Disse kandidater ble samlet som strukturer trolig fremme levetid. For dette skjermbildet utført vi 5 gjentak av testen platene på to forskjellige doser (50 µM og 100 µM). I tillegg vant vi 8 negativ kontroll plater, med en enkelt positiv kontroll (NP1) plate inneholder to forskjellige doser; 50 µM og 100 µM.

Negativ kontroll platene ble overvåket til ~ 90% av dyrene var døde. På den tiden, ble brønner scoret av telle levende og døde ormer i alle kontroll brønner og test brønner som inneholdt live ormer. Prosent i live på tiden av scoring ble brukt til å beregne gjennomsnitt prosent i live score for hver brønn. For de negative kontrollene hadde 32 brønner prosent i live score fra 8 gjentak. For positive kontrollene var det 4 godt poeng gjennomsnitt over 4 gjentak for hver dose. Treff ble kalt brønner med et gjennomsnitt prosent i live score som var større enn den gjennomsnittlige negativ kontroll prosent i live score 2 SD. Denne cutoff igjen 14 treff fra skjermbildet kandidat og utelukket alle negativ kontroll brønnene. Som cutoff også inkludert all den positive kontrollen brønner behandlet på 100 µM og 50% av positiv kontrollene behandlet på 50 µM. Disse resultatene er presentert her som binned gjennomsnitt prosent i live score for både den 50 µM (figur 2A) og 100 µM (figur 2B) test skjermene.

Til slutt, alle platene var re scoret på et sent tidspunkt, noe som tilsvarte i en tid da større enn 99% av kontrollen negative behandlet dyrene var døde. Resultatene indikerte at positiv kontroll brønnene langt ut utført negativ kontroll og test brønnene (figur 2C). Mens test brønnene var litt bedre enn negative kontrollene. Dette siste resultatet er partisk av indikasjon at mange av testen syntes å toksisitet i forhold til kontrollen behandling (tabell 1), og dermed confounding denne enkle tolkningen. Dette skulle være ventet, ettersom biblioteket kandidaten var en sant skjermen kjemikalier med ukjent biologiske aktivitet i C. elegans, mens re-teste skjermen var egentlig pre-screenet for forbindelser som ikke giftig. Siden denne primære skjermen var for forbindelser som Forlenget levetid, skal betydelig giftige kjemikalier ikke er i det re-test angitt.

Figure 1
Figur 1 : Representant resultater fra høy gjennomstrømming skjermen og re-testing
(A) Survivorship kurve fra en representant negativ kontroll platen brukes i re-teste analysen. Denne kurven ble konstruert scoring alle levende og døde ormer i 24 brønnene i denne analysen 4 ganger over 18 dager til analysen. I dag 18 voksen, kontroller ble vurdert for å ha ~ 5% overlevelse og alle kontroll test og plater ble deretter scoret. (B) tabell oppsummerer resultatene av skjermen og re-teste. (C) Binning brønner gjennomsnitt prosent i live score for både kontrollen og test forhold til re-teste skjermen. For kontroller består score fra 48 brønner hver av gjennomsnittet av 3 gjentak. Testresultater består fra 179 brønner hver av gjennomsnitt score fra tre gjentak. Figur 1 er gjengitt fra en tidligere publikasjon1Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant resultater fra kandidat skjerm
(A) Binning av resultatene fra 50 µM kandidat skjermen. 139 test-og resultatene representerer gjennomsnitt prosent i live score fra 5 gjentak. 32 negativ kontroll resultatene består av gjennomsnitt prosent i live score fra 8 gjentak. 4 positiv kontroll resultatene består av gjennomsnitt prosent i live score fra 4 replikat (16 totalt brønner som inneholder NP1 på 50 µM). (B) Binning av resultatene fra 100 µM kandidat skjermen. Alt er det samme som (A), bortsett fra at testen brønner og positiv kontroller ble behandlet i 100 µM konsentrasjoner. Samme negativ kontroll platene vises i både (A og B). (C) representant resultater fra re scoring platene på en relativt ekstrem sent tidspunkt. Positiv kontroller dramatisk bedre resultater enn alle andre, hvis bare står for prosenten av brønner med live ormer på dette tidspunkt, som er forutinntatt mot test brønner som beskrevet i hovedteksten og tabell 1Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Binning gjennomsnitt prosent i live score
Grupperte score Alle døde (0) 1-10 11-20 21-30 31-40 > 41
Re-teste
Antall (-) kontroll 16 31 1 0 0 0
# Test brønner (50µM) 46 69 50 8 3 3
Kandidaten skjermen
Antall (-) kontroll 0 11 21 0 0 0
Antall (+) kontroll (50µM) 0 0 2 2 0 0
Antall (+) kontroll (100µM) 0 0 0 0 2 2
# Test brønner (50µM) 94 22 21 2 0 0
# Test brønner (100µM) 86 25 21 6 1 0

Tabell 1: Representant resultat binning ulike skjermer
Her presenterer vi binning av de gjennomsnittlige prosent i live scorene fra to skjermene (re-teste og kandidat). I skjermbildet re-teste toppen er lik for kontrollen negative med de re-tester overgått kontrollen negative dramatisk på høyre (varige) side av bordet. Dette indikerer tilstedeværelse av flere Pro levetid forbindelsene til stede i re-teste settet. I skjermbildet kandidat ser vi at toppen er alle døde kategorien mens det er også et klart signal fra høyre side av tabellen. Dette angir at Pro levetid forbindelser i hvilke kandidat, men også angir at betydelige toksisitet i kandidaten et sett av forbindelser.

Discussion

Her har vi beskrev en enkel metode for dyrking C. elegans i 96-brønnen plater. Vi beskriver disse kulturene for bruk i kjemiske screening og levetid analyser, men de kan brukes for mange typer analyser. Mens flere godt kultur betingelser for kjemiske screening har tidligere vært rapportert8, forskjellig inkludert for levetid analyse10, analysen beskrevet her på flere måter. Levetid analysen beskrevet her benytter 96-brønns plater, avhengig av sterile mutanter (i stedet for kjemiske sterilisering), bruker agar kultur betingelser, bruker enkel væske håndtering for å flytte ormer og er manuelt scoret på sluttpunktet. De ulike tilnærmingene brukt i denne analysen kan være til hjelp for forskere leter etter screening metoder med disse betingelsene.

Avgjørende elementer til denne protokollen sentrerer hovedsakelig på kvaliteten på platene produsert for analysen. Først når platene er det viktig at agar er bobler og andre defekter. Variasjonene i agar overflaten fører nesten alltid til gravende og tap av brønnen. Denne protokollen bruker andre tørking av væsker avsatt under Oppsett og dopet etappene. Det er viktig at disse væsker er fullstendig fjernet, men agar ikke blitt tørket ut. Anecdotally, ser det ut til at ormer i brønner som ikke helt tørket (svømming i væske) lever lenger enn ordentlig tørkede brønner, mens over tørking av platene fører til uttørking og sprengning av agar, som fører til ormen gravende og tap. Et annet viktig element i denne protokollen er å opprettholde sterile forhold. Som med alle levetid analysen, det er mye arbeid involvert med plate oppsett, og mange muligheter og tid finnes for analysen ødelegger forurensning å bosette seg og vokse på platene.

Levetid analysen beskrevet her er nyttig for screening av forbindelser i C. elegans, er det begrenset til bestemte genetisk bakgrunn, som den er avhengig av en temperatur sensitive (ts) sterilt stamme; Vi brukte TJ1060, som har høy sterilitet penetrance. Dette begrenser tilgjengelig for screening toner med denne metoden. Alternative tilnærminger inkludert krysset ts sterilt mutasjoner i ønsket bakgrunnen eller bruke kjemiske sterilisering. Vi har ikke prøvd kjemiske sterilisering med denne analysen, men det bør være mulig. Potensielle hekk inkluderer plassere sterilisatoren på ormer på riktig scenen og det lated dosen. Protokollen beskrevet bruker her en flytende dispenser er rask, men synes ikke å dispensere voksne effektivt. Så disse ormene utvikle på platene, og derfor må behandles med sterilisering kjemiske på platene. Bestemme den optimale dosen og timing vil være viktig for å lykkes. En alternativ strategi inkluderer bruk av en dispensering metode som kan flytte voksne. Tidligere har vi funnet at maskiner kunne identifisere og sortere voksne er vanligvis mye tregere enn enkel flytende handlers, som kan dispensere homogen slam av suspendert larve.

Generelt, bruker vi denne metoden til raskt skjermen kjemikalier og behandlinger for store positive effekter på levetid. Metoden er spesielt effektive når de brukes med flere doser, høy gjenskape tall og lukke overvåking av negative kontroller som alltid opprettholdes og ispedd blant test platene. Positiv kontroller er også nyttige når designe og implementere skjermene beskrevet i dette manuskriptet. Men for å være en effektiv positiv, må kontrollen være ganske potent og/eller svært robust. Når skjermen var opprinnelig kunne en passende potent og robust sammensatt ikke identifiseres. Aktuelle, er det mange rapporter "aldrende" litteraturen i sannsynlige kandidater for positiv kontroller nyttig skjermene beskrevet her. Som beskrevet i delen kandidat skjermen i delen forventede resultater i denne oppgaven og i figur 2 og tabell 1, er den sammensatte NP1 effektiv positiv kontroll for denne skjermen. Vi bekrefte generelt positiv treff fra disse skjermene med standard levetid analyser på 3 mm kultur plater.

Disclosures

Forfatterne erklærer at ingen finansiering enhet støtter dette arbeidet hadde noen innspill på samling av data, analyse av resultater eller beslutningen om å publisere.

Acknowledgments

Vi takker Dipa Bhaumik, Aaron Miller og Bob Hughes for teknisk assistanse. Stammene ble gitt av CGC, som finansieres av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Vi er takknemlige for Georgia skogen og medlemmer av Lithgow, Kapahi og Melov Labs for nyttig diskusjoner. M.L. ble støttet av National Institutes of Health (NIH) opplæring Grant T32 AG000266 og en Ellison medisinsk Foundation/American Federation av aldring forskning Post-Doctoral fellesskap. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra BioAge Labs, gir Larry L. Hillblom Foundation stipend, samt National Institutes of Health UL1024917, støtter tverrfaglig forskning konsortiet på Geroscience og 1R01AG029631-01A1 til G.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Miller Granules VWR
Unispense  Wheaton Science Products automated fluid dispensing apparatus
96 well assay plate; COSTAR 3370 Corning
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser Thermo Fisher Scientific
manufactored worm pick Genesee Scientific
Belly Dancer Orbital Shaker Stovall Life Science inc.
microplate shaker; MTS 2/4 Digital IKA Works, inc. 
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler  Beckman Coulter
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor  Sorenson Bioscience, inc.
manual 8 or 12 multi-channel pipettes we use rainin…
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film  USA Scientific
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lucanic, M., et al. Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan. Aging Cell. (2016).
  2. Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307, (5707), 258-262 (2005).
  3. Melov, S., et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289, (5484), 1567-1569 (2000).
  4. Benedetti, M. G., et al. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp Gerontol. 43, (10), 882-891 (2008).
  5. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen. PLoS Genet. 1, (1), 17 (2005).
  6. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33, (1), 40-48 (2003).
  7. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21, (22), 2976-2994 (2007).
  8. Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, (7089), 91-95 (2006).
  9. Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans. Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).
  10. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
  11. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, (10), 759-769 (2013).
  12. Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. J Gerontol. 49, (4), 145-156 (1994).
  13. Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8, (2), 113-127 (2009).
  14. Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS One. 4, (2), 4535 (2009).
  15. Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, (13), 1544-1555 (2005).
  16. Frankowski, H., et al. Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid. Mech Ageing Dev. 134, (3-4), 69-78 (2013).
  17. Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nat Commun. 8, 14256 (2017).
En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i <em>Caenorhabditis Elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lucanic, M., Garrett, T., Gill, M. S., Lithgow, G. J. A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (133), e56892, doi:10.3791/56892 (2018).More

Lucanic, M., Garrett, T., Gill, M. S., Lithgow, G. J. A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (133), e56892, doi:10.3791/56892 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter