Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att snabbt producera hundratals nematoder tillväxt medier agar, 96 brunnar kultur plattor med konsekvent antal Caenorhhabditis elegans per brunn. Dessa kulturer är användbara för fenotypisk screening av hela organismer. Här fokuserar vi på att använda dessa kulturer till skärmen kemikalier för Pro livslängd effekter.
Caenorhabditis elegans är en användbar organism för att testa kemiska effekter på fysiologi. Hela organismen småmolekylära skärmar erbjuder betydande fördelar för att identifiera biologiskt aktiva kemiska strukturer som kan ändra komplexa fenotyper som livslängd. Beskrivs här är ett enkelt protokoll för att producera hundratals 96 brunnar kultur plattor med ganska konsekvent antal C. elegans i varje brunn. Nästa, vi specificerat hur man använder dessa kulturer till skärmen tusentals kemikalier för effekter på livslängd av Nematoden C. elegans. Detta protokoll använder sig av temperatur känslig sterila stammar, agar plattan villkor och enkel djurhantering för att underlätta snabb och hög genomströmning produktion av synkroniserade djur kulturer för screening.
Här beskrivs ett protokoll som utvecklats för hög genomströmning screening av kemiska föreningar för effekter på Caenorhabditis elegans livslängd. Själva protokollet kan lätt anpassas till andra fenotypiska skärmar, inklusive studier utnyttjar reporter C. elegans stammar. Detta protokoll var framgångsrikt utnyttjas för att identifiera en roman biologiskt aktiva förening, NP1 (nitrofenyl-piperazin 1), som starkt förlänger livslängden på C. elegans genom en mekanism som dietrestriktioner. NP1 och en karakterisering av dess effekt på livslängden, inklusive en beskrivning av de genetiska vägarna på lek, var tidigare beskrivs på annan plats1. Rapporten innehåller också en beskrivning av resultaten från en storskalig implementering av skärmen. Här beskriver vi i mycket större detalj metod och installationen av själva skärmen, som är skalbar för såväl små – och storskaliga tillämpningar.
Målet som ledde till skapandet av det protokoll som beskrivs här var att utveckla en plattform för kultur av C. elegans som tillåts för snabb screening av stora kemiska bibliotek för nya biologiskt aktiva föreningar. Medan kemiska skärmar har utförts före utvecklingen av detta protokoll, dessa var främst småskaliga eller kandidat typ närmar sig2,3. Faktiskt, de flesta av de skärmar som utförs i labbet på tiotals föreningar utnyttjas stress motstånd analyser, med hits som screenas för livslängd effekter4. Denna studie försökte istället direkt skärmen för livslängd effekter. Anmärkningsvärt, fanns det några beskrivningar i den vetenskapliga litteraturen vid tidpunkten för utför storskaliga kemiska skärmar med C. elegans. Ja, jämfört med andra typer av skärmar5,6,7, storskalig kemisk undersökning med C. elegans tycktes vara undersysselsatta.
Det fanns två beskrivningar av storskaliga kemiska skärmar i C. elegans som användes som underlag för att utveckla detta tillvägagångssätt. Först av dessa var en elegant studie från Peter Roys laboratoriet använder kemiska skärmar för att identifiera ämnen som kan störa utvecklingen av djur. Studien följde sedan upp med en framåt mutagenes skärm att identifiera de genetiska målen för dessa kemikalier8. Protokollet beskrivs i denna studie används 24-väl pastejer, vilket var helt enkelt omöjligt för denna studiens specifika behov (begränsade mängder av kemikalien i biblioteket och begränsade tillgängliga inkubator utrymme). Den andra studien var Michael Petraschecks innovativa och ambitiösa småmolekylär skärm för livslängd som sträcker sig kemikalier9,10. Denna studie använde 384 brunnar och flytande kulturer. Den andra viktigaste funktionen på den här skärmen var användningen av FUDR (5-fluorodeoxyuridine) kemiskt hämma avkomma produktion. Efter stort övervägande av protokollet beskrivs i studien, undveks både kemisk sterilisering och flytande kulturer av C. elegans .
Även om FUDR används ofta i C. elegans livslängd experiment, fanns det farhågor att FUDR kan orsaka oförutsedda läkemedelsinteraktioner eller att FUDR själv kan ha viss effekt på livslängden. Nyligen har denna sistnämnda oro validerats, åtminstone på vissa koncentrationer och i synnerhet vid 25 ° C11. För att kringgå problemet med avkomma föroreningen, C. elegans stam TJ1060 användes, som hamnar två oberoende temperatur känslig mutationer (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) att avskaffa spermieproduktionen och har visat sig vara användbart för massa kulturer av synkron populationer12. Denna stam var helt steril vid 25 ° C, men kommer att producera avkomma när odlade på 15-20 ° C. Denna studie använde konventionell odlingsbetingelser, med maskar kryper på ytan av agar, som resultat av flytande kulturer inte är alltid reproducerbar med konventionella agarplattor. Medan detta fenomen inte är helt klarlagda, har det visats att maskar odlade i flytande svara på DR (dietrestriktioner) på ett annat sätt än maskar odlade på standardmedia13,14. Det är därför rimligt att flytande media kunde dölja vissa DR mimetika som annars skulle identifieras med skärmen.
Efter att ha avgjort på agar odlingsbetingelser, ansågs olika alternativ för poängsättning prestanda för brunnar i denna analys. Medan olika automatiserade eller imaging baserade analyser var tillgängliga, krävde de förvärv och distribution av tekniskt utmanande enheter, varav de flesta var oöverkomligt dyra. Samtidigt överväger dessa alternativ, var det nödvändigt att hänvisa till tidigare livslängd skärmar av alla typer. Slutligen, denna studie användes en poängsättningsmetod anpassad från Siu Sylvia Lee Labbets hela genomet RNAi skärmen för livslängd fenotyper15. Specifikt, alla livslängd plattor sattes upp på samma sätt, men endast de negativa kontrollerna övervakades. När de negativa kontrollplattor bekräftades för att ha nära komplett dödlighet, var testplattorna gjorde för hand. I denna storskaliga skärm bekräftades positiva åter testa med nylagade kemikalier, använder tre exemplar repetitioner av de primära positiva.
Här har vi beskrivit en enkel metod för odling av C. elegans i 96 brunnar. Vi beskriver dessa kulturer för användning i kemisk screening och livslängd analyser, men de kan användas för många typer av analyser. Medan flera odlingsbetingelser för kemisk screening har tidigare varit rapporterade8, inklusive för livslängd analys10, analysen beskrivs här skiljer sig på flera sätt. Livslängd analysen beskrivs här använder tredjeparts 96 brunnar, förlitar sig på sterila mutanter (i stället för kemisk sterilisering), använder agar odlingsbetingelser, använder enkel vätskehantering flytta maskar och görs manuellt på slutpunkten. De olika metoder som använts i denna analys kan vara till hjälp för forskare som söker screeningmetoder som omfattar dessa förutsättningar.
Är av avgörande betydelse att detta protokoll centrera huvudsakligen på kvaliteten på plattorna produceras för analysen. Först, när du gör plattor är det absolut nödvändigt att agar ytan är fri från bubblor och andra ojämnheter. Dessa variationer i agar ytan leder nästan alltid till grävande och förlust av brunnen. Det andra bygger protokollet på torkning av vätskor som deponeras under installationen och neddrogning stadier. Det är viktigt att dessa vätskor är helt bort, men ägarn inte blir uttorkad. Anekdotiskt, det verkar att maskar i brunnar som inte är helt torkat (simning i vätska) lever längre än ordentligt torkade brunnar, medan uttorkning av plattorna leder till uttorkning och sprickbildning av agar, vilket leder till mask grävande och förlust. En annan avgörande faktor i detta protokoll är att upprätthålla sterila förhållanden. Som med någon livslängd test, finns det en hel del arbete involverade med plattan setup, och många möjligheter och tid finns för analys förstör föroreningar för att bosätta sig och växa på plattorna.
Medan den livslängd-analysen som beskrivs här är användbar för screening av föreningar i C. elegans, är det begränsat till särskilda genetiska bakgrunder, eftersom det bygger på en temperatur känslig (ts) steril stam; Vi använde TJ1060, som har hög sterilitet penetrans. Detta begränsar stammarna som är tillgängliga för screening med denna metod. Alternativa metoder inklusive korsa ts sterila mutationer in i önskad bakgrunden eller använda kemisk sterilisering. Vi har inte försökt kemisk sterilisering med denna analys, men det bör vara möjligt. Potentiella hinder inkluderar att placera autoklaven på maskar i rätt skede och i rätt dos. Protokollet beskrivs använder här en flytande dispenser som är snabb, men verkar inte avstå från vuxna effektivt. Så dessa maskar utvecklas på plattorna och därför måste behandlas med sterilisering kemiska på plattorna. Att bestämma den optimala dosen och timing är viktigt för framgång. Alternativa strategier inkluderar en tubens metoden som kan flytta vuxna. Tidigare, har vi funnit att maskinerna kan identifiera och sortera vuxna är generellt mycket långsammare än de enkla flytande hanterare, som kan undvara homogen uppslamningar av suspenderade larv.
I allmänhet, använder vi denna metod för att snabbt skärmen kemikalier och behandlingar för stora positiva effekter på livslängd. Metoden är särskilt effektiva när de används med multipla doser, hög replikera nummer, och noggrann övervakning av negativa kontroller som alltid upprätthålls och insprängda bland testplattorna. Positiva kontroller är också användbara vid utformningen och genomförandet av de skärmar som beskrivs i detta manuskript. Men för att vara en effektiv positivt, skulle kontrollen behöver vara ganska potent och mycket robust. När skärmen distribuerades ursprungligen, kunde en passande potent och robust förening inte identifieras. För närvarande finns det många rapporter i ‘åldrande’ litteraturen av troligaste kandidaterna för positiva kontroller användbar på skärmarna som beskrivs här. Som beskrivs i avsnittet kandidat skärmen i avsnittet förväntade resultat av detta manuskript och i figur 2 och tabell 1, är de sammansatta NP1 en effektiv positiv kontroll för denna skärm. Vi bekräftar generellt positiva träffar från dessa skärmar med standard livslängd analyser på 3 mm kultur plattor.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dipa Bhaumik, Aaron Miller och Bob Hughes för tekniskt bistånd. Stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Vi är tacksamma till Georgien skogen och medlemmar av Lithgow, Kallisti och Melov Labs för användbar diskussioner. M.L. stöddes av National Institutes of Health (NIH) utbildning Grant T32 AG000266 och en Ellison medicinska stiftelsen/amerikanska federationen av åldrande forskning Post-Doctoral Fellowship. Detta arbete stöddes av ett bidrag från BioAge Labs, beviljar Larry L. Hillblom Foundation bidrag, liksom National Institutes of Health UL1024917, stödja tvärvetenskaplig forskningskonsortiet på Geroscience och 1R01AG029631-01A1 till G.J.L.
LB Broth Miller Granules | VWR | ||
Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |