Burada biz hızla nematodunun büyüme medya agar, yüzlerce Caenorhhabditis elegans tutarlı numaraları iyi başına 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokol tanımlamak. Bu kültürler tüm canlıların fenotipik tarama için yararlıdır. Yanlısı uzun ömürlü efektleri için ekran kimyasallara bu kültürler kullanarak üzerinde odaklanabilir.
Caenorhabditis elegans fizyolojisi üzerinde kimyasal etkileri test etmek için yararlı bir organizmadır. Bütün organizma küçük molekül ekranlar ömrü gibi karmaşık fenotipleri değiştirebilirsiniz biyolojik olarak aktif kimyasal yapıları tanımlamak için önemli avantajlar sunuyor. Burada açıklanan yüzlerce C. elegans her iyi oldukça tutarlı numaraları ile birlikte 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokoldür. Daha sonra Yuvarlak solucanlar C. elegansömrü üzerinde etkileri için bu kültürler ekrana kimyasalların binlerce kullanmayı belirtilen. Bu iletişim kuralının yeteneklerinden sıcaklık duyarlı steril suşları, agar plaka koşullar ve basit hayvan eşitlenmiş hayvan kültürler tarama için hızlı ve yüksek üretilen iş üretimini kolaylaştırmak için işleme.
Burada bir iletişim kuralı Caenorhabditis elegans ömrü üzerinde etkileri için kimyasal bileşikler yüksek aktarım tarama için geliştirilen açıklanmıştır. Protokolün kendisi gazeteci C. elegans suşları kullanan çalışmaları da dahil olmak üzere diğer fenotipik ekranlara kolayca uyarlanabilir. Bu iletişim kuralı başarıyla bir roman biyolojik olarak aktif bileşim, NP1 tanımlamak için kullanılmıştır (nitrophenyl-piperazin 1), C. elegans ömrü bir diyet kısıtlama mekanizması aracılığıyla güçlü genişleten. NP1 ve ömrü oynayan, genetik yolları için bir açıklama da dahil olmak üzere, üzerindeki etkisini bir karakterizasyonu oldu daha önce başka bir bölümünde1. Rapor Ayrıca ekranın büyük ölçekli bir uygulama sonuçlarından bir açıklaması vardır. Burada biz çok daha ayrıntılı olarak Metodolojisi ve Kur ekranın kendisi, hem küçük ve büyük ölçekli uygulamalar için ölçeklenebilir olduğu açıklanmaktadır.
Büyük kimyasal kitaplıkları roman biyolojik olarak aktif bileşikler için hızlı tarama için izin verilen bir C. elegans Kültür Platformu geliştirmek için burada açıklanan protokol yol açtı hedefi oldu. Kimyasal ekranlarında bu protokolü geliştirme önce gerçekleştirilmiş olsa da, bunlar özellikle küçük ölçekli / veya2,3aday türü yaklaşımlar. Nitekim, onlarca bileşikler üzerinde laboratuarında gerçekleştirilen ekranlarının en uzun ömürlü etkileri4için tarandı sayısı ile stres direnç deneyleri, kullanılmıştır. Bu çalışmada bunun yerine doğrudan ömrü etkileri için ekran istedi. Dikkat çekici, büyük ölçekli Kimyasal ekranlarında C. elegansile gerçekleştirme esnasında bilimsel literatürde birkaç açıklamaları vardı. Nitekim, ekranlar5,6,7, diğer türleri için karşılaştırıldığında, C. elegans kullanarak büyük ölçekli Kimyasal tarama altında istihdam olmak gibiydi.
Bu yaklaşım geliştirmek için bir temel olarak kullanılan büyük ölçekli Kimyasal ekranlarında C. elegans iki açıklamaları vardı. Bunlardan ilki Peter Roy’un laboratuvar hayvanları gelişimi huzursuz bileşikler tanımlamak için kimyasal ekranlarında kullanarak zarif bir çalışma yapıldı. Çalışma daha sonra bu kimyasallar8genetik hedeflerini tanımlamak için ileri mutagenesis ekran ile takip. Bu çalışmada açıklanan protokol 24-şey pates, hangi sadece kullanışsız bu çalışmanın belirli gereksinimler (sınırlı miktarda kimyasal Kütüphane ve sınırlı kullanılabilir kuluçka alanı) için kullanılır. Diğer çalışma Michael Petrascheck’ın yenilikçi ve hırslı küçük molekül ekran kimyasallar9,10uzanan ömrü için başvurdu. Bu çalışma 384-şey plakaları ve sıvı kültürleri kullanılır. Diğer önemli özelliği bu ekran, kimyasal olarak döl üretim etkisizleştirmek için FUDR (5-fluorodeoxyuridine) kullanmaktı. Bu çalışmada açıklanan protokol önemli dikkate sonra kimyasal sterilizasyon ve C. elegans sıvı kültürleri atlanma.
FUDR C. elegans ömrü deneylerde yaygın olarak kullanılmasına rağmen FUDR önceden tahmin edilemeyen ilaç etkileşimleri neden olabilir veya o FUDR ömrü üzerinde bir etkisi olabilir endişeler vardı. Son zamanlarda bu ikinci endişe, en azından bazı konsantrasyonlarda ve özellikle 25 ° C11doğrulandı. Döl kirlilik sorunu aşmak için C. elegans zorlanma TJ1060, hangi iki bağımsız sıcaklık duyarlı mutasyonlar limanlar kullanıldı (spe-9 (hc88) ben; sperm üretimini ortadan kaldırmaya ve yararlı olması için göstermiştir rrf-3(b26)II) zaman uyumlu nüfus12kitle kültürleri için. Bu zorlanma 25 ° C’de tamamen steril, ama ne zaman 15-20 ° C’de kültürlü döl üretecek Bu çalışmada agar, yüzeyinde sıvı kültürleri ile elde edilen sonuçlar her zaman geleneksel Ağar kaplamalar ile tekrarlanabilir değildir olarak tarama solucanlarla geleneksel kültür koşulları, kullanılan. Bu olay tamamen anlaşılmaktadır değil iken, solucanlar solucan standart medya13,14tarihinde kültürlü daha farklı bir şekilde Dr (diyet kısıtlaması) sıvı cevap kültürlü kanıtlanmıştır. Bu nedenle sıvı medya ile ekranın tanımlanması bazı DR mimetics maske makul ‘s.
Agar kültürü koşulları üzerinde yerleşmiş, bu tahlil wells performansını puanlama için farklı seçenekler kabul edildi. Çeşitli otomatik ya da görüntü tabanlı deneyleri mevcut iken, satın alma ve teknik cihazlar, en çok hangi prohibitively pahalıydı zorlu dağıtım gerektirdiği. Bu seçenekleri göz önünde iken, tüm türleri önceki ömrü ekranlara başvurmak için gerekliydi. Sonuçta, bu çalışma–dan Siu Sylvia Lee laboratuar tüm genom RNAi perde ömrü fenotipleri15için uyarlanmış bir skor yöntem kullanılır. Özellikle, tüm ömrü plakaları aynı şekilde ayarlanmış olan ama sadece negatif denetimleri takip. Bir kez negatif kontrol levha tam ölüm için teyit edildi, el ile test plakaları skorlanmıştır. Bu büyük ölçekli ekranda, pozitif yeniden kullanarak taze hazırlanmış kimyasallar ile test ederek nüsha birincil pozitif tekrarlar teyit edildi.
Burada C. elegans 96-şey levha kültür için basit bir yöntem anlatmıştık. Ama biz bu kültürler kimyasal tarama ve ömrü deneyleri için tarif deneyleri birçok türü için kullanılabilir. Ise kimyasal tarama için çok iyi kültür koşulları daha önce bildirilen8olabilirdi, ömrü analiz10için dahil burada açıklanan tahlil çeşitli şekillerde farklıdır. Burada açıklanan ömrü tahlil 96-şey plakaları kullanır, steril mutantlar (yerine kimyasal sterilizasyon) dayanan, agar kültürü koşulları kullanır, basit sıvı solucanlar taşımak için işleme kullanır ve uç noktada el ile attı. Bu tahlil kullanılan farklı yaklaşımlar araştırmacılar bu koşullar yer yöntemleri eleme için seyir için yardımcı olabilir.
Esas olarak tahlil için üretilen plakaların kalitesine Merkezi bu iletişim kuralı için çok önemli öğeleri. İlk olarak, tabak yaparken bu agar yüzeyinin kabarcıklar ve diğer kusurları ücretsiz zorunludur. Bu değişimler agar yüzeyinin hemen hemen her zaman tavşan çukuru ve kaybı iyi neden. İkinci olarak, bu iletişim kuralını kurulum ve hap veriyorsun aşamasında biriken sıvı kapalı kurutma dayanır. Bu sıvılar tamamen kaldırılır, ancak agar kurudu olmak değil önemlidir. Anecdotally, görünüşe göre tamamen değildir Wells solucanlar (sıvı içinde yüzme) kurutulmuş canlı düzgün kurutulmuş wells, daha fazla tabak kurutma kuruma ve tavşan çukuru ve kaybı solucan yol agar çatlama yol açar iken uzun. Başka bir önemli unsur bu protokol steril koşullar sürdürmektedir. Olarak herhangi bir ömrü tahlil ile bir sürü iş plaka kurulumu ile ilgili ve yerleşmek ve Tabaklarda büyümeye kirlenme bozma tahlil için birçok fırsat ve zaman adlı biri yok.
Burada açıklanan ömrü tahlil C. elegansbileşikler ile taranması için yararlıdır, sıcaklık duyarlı (ts) steril yaratıyordur dayanıyor gibi belirli genetik arka planlar için sınırlı iken; Biz yüksek kısırlık alellerle vardır TJ1060 kullanılır. Bu tarama için kullanılabilir suşları bu yöntem ile sınırlar. Ts steril mutasyonlar istenen arka plana geçiş veya kimyasal sterilizasyon kullanarak da dahil olmak üzere alternatif yaklaşımlar. Biz bu tahlil ile kimyasal sterilizasyon denemedim ama mümkün olmalıdır. Potansiyel Engelli Sterilizatör solucanlar üzerinde doğru aşamada ve uygun dozda yerleştirerek içerir. Açıklanan protokol burada hızlıdır, ancak yetişkin etkili bir şekilde dağıtmak için görünmüyor bir Sıvı Sabunluk kullanır. Bu yüzden, bu solucanları Tabaklarda geliştirmek ve bu nedenle Tabaklarda kimyasal sterilizasyon ile tedavi edilmelidir. En uygun doz belirleme ve zamanlama başarısı için önemli olacaktır. Alternatif Stratejileri yetişkin taşıyabilirsiniz bir dağıtım yöntemini kullanarak içerir. Geçmişte, biz makineleri belirlemek ve yetişkin sıralamak mümkün genellikle çok daha yavaş askıya alınmış larva homojen çamurlar dağıtabilirsiniz basit sıvı işleyicileri, bulduk.
Genel olarak, yaşam süresi üzerinde büyük olumlu etkileri için hızla ekran kimyasallar ve tedavileri için bu yöntemi kullanın. Yöntemi ile birden fazla dozlarda kullanıldığında özellikle etkilidir, yüksek sayılar çoğaltmak ve her zaman muhafaza ve test plakaları arasında serpiştirilmiş negatif denetimleri izlenmesi kapatın. Pozitif denetimleri tasarlama ve bu el yazması açıklanan ekranlar uygularken yararlıdır. Ancak, etkili bir pozitif olmak, denetimin oldukça güçlü ve/veya son derece sağlam olması gerekir. Ekranın ilk olarak dağıtıldığında, uygun güçlü ve sağlam bir bileşik tanımlanamıyor. Şu anda vardır birçok raporlar olumlu denetimler için muhtemel adayların ‘yaşlanma’ Edebiyat burada açıklanan ekranlar yararlı. Bu el yazması beklenen sonuçları bölümünün aday ekran bölümünde ve Şekil 2 ve Tablo 1‘ de açıklandığı gibi bileşik NP1 bu ekran etkili bir pozitif kontrol içindir. Biz genellikle bu ekranlar ile standart ömrü deneyleri 3 mm kültür Tabaklarda gelen pozitif sayısı onaylayın.
The authors have nothing to disclose.
Dipa Bhaumik, Aaron Miller ve Bob Hughes teknik yardım için teşekkür ederiz. Suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından temin edilmiştir. Georgia Woods ve Lithgow, Kapahi ve Melov Labs üyelerine yararlı tartışmalar için minnettarız. M.L. ulusal kurumları Sağlık (NIH) eğitim Grant T32 AG000266 ve bir Ellison tıbbi Vakfı/Amerikan Federasyonu, yaşlanma araştırma bulunan bursu tarafından desteklenmiştir. Bu eser bir hibe BioAge Labs tarafından desteklenen, Larry L. Hillblom Vakfı Hibe yanı sıra ulusal sağlık Enstitüleri verir UL1024917, Geroscience ve 1R01AG029631-01A1 G.J.L. için disiplinler arası araştırma Konsorsiyumu destekleyen
LB Broth Miller Granules | VWR | ||
Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |