Trombocytantal lager baserat på screening microparticle innehåll i trombocytantal koncentrat är ett nytt kvalitet förbättring initiativ i sjukhusblodbanker. Målet är att göra åtskillnad mellan aktiverade från icke-aktiverade trombocyter att optimera användningen av trombocyter. Att tillhandahålla icke-aktiverade trombocyter till hematologi-onkologiska patienter kan minska sin hög risk att bli eldfasta.
Trombocytantal lager baserat på screening microparticle innehåll i trombocytantal koncentrat är ett nytt kvalitet förbättring initiativ för sjukhusblodbanker. Celler fragment av mikropartiklar (MP) när de är stressade. Blod och blodkomponenter kan innehålla cellulära fragment från en mängd celler, främst från aktiverade trombocyter. När du utför sina roller som innate immuna celler och stora aktörer i koagulation och hemostas, trombocyter ändra form och generera mikropartiklar. Med dynamisk ljusspridning (DLS)-baserat microparticle upptäckt, är det möjligt att skilja aktiverat (hög microparticle) från icke-aktiverade (låg microparticle) trombocyter i transfusioner och optimera användningen av denna knappa blodprodukt. Tidigare forskning tyder på att tillhandahålla icke-aktiverade trombocyter för profylaktisk användning i hematologi-onkologiska patienter kan minska sin risk att bli eldfasta och förbättra patientvården. Målet med denna metod är att rutinmässigt skilja aktiveras från icke-aktiverade trombocyter. Den metod som beskrivs här beskriver stegen utföras för rutinmässig trombocytantal lagerhantering i en sjukhusblodbank: att få ett prov från en trombocyttransfusion, fylla på provet i kapillären för DLS mätning, utför DLS test till identifiera mikropartiklar och använda rapporterade microparticle innehåll för att identifiera aktiverade trombocyter.
Intresset för mikropartiklar har kretsade främst runt deras deltagande i cellen till-cell kommunikation och biologiska processer. 1 , 2 , 3 mer nyligen, mikropartiklar har också rönt intresse som potentiella tidiga diagnostiska markörer för autoimmuna och kardiovaskulära sjukdomar. 4 , 5 mikropartiklar, även känd som extracellulära blåsor eller exosomes, har undersökts allmänt av flödescytometri. Tyvärr trots ansträngningar att standardisera konventionella flöde flödescytometri protokoll finns det ingen konsensus om optimal protokollet till använda. 6 , 7 , 8 , 9 , 10
Även om konventionell flödescytometri kan karakterisera särskilda MP subpopulations, rapporterade11 det har flera begränsningar. 11 , 12 , 13 , 14 några av dessa begränsningar har åtgärdats genom att använda högre effekt lasrar och detektorer i en så kallad ”små partiklar alternativet”,15,16 , samt upptäcka på 15 – 25 ° framåt scatter vinkel och modifierade slida trycket . 17 , 18 trots detta en snabb och lätt-till-använda screeningmetod som kan kombineras med dessa sofistikerade metoder krävs fortfarande att utnyttja mikropartiklar som tidig diagnostiska markörer. Förhöjda nivåer av mikropartiklar kan påvisas i ungefär en tredjedel av normal blodgivare19 och tyda subklinisk villkor. Följaktligen, hög microparticle nivåer i donerade blodprodukter kan vara inkompatibla med sårbara mottagarna. 20
När de tillhandahåller trombocyttransfusioner, finns det en risk för icke-immun refraktäritet – ett tillstånd vari en patients kropp avvisar i följd transfusioner och tillåter inte en betydande del av trombocyter att cirkulera. 21 , 22 icke-immun behandlingsresistens kan resultera i bortkastad transfusioner, hälsa komplikationer för patienter och utökade sjukhus vistelser. 23 som innehåller kick numrerar av mikropartiklar av trombocyter kan vara en bidragande faktor för utveckling av icke-immun refraktäritet i utsatta hematologi-onkologiska patienter. 20 det är möjligt att hantera trombocytantal lagret enligt sammansättningen av trombocyttransfusioner genom screening för mikropartiklar vilket minskar risken för utsatta patienter. Men de flesta microparticle tester kräver isolering av mikropartiklar från trombocyter5,12 eller är annars mycket labor intensiv24,25 och kan därför inte genomföras rutinmässigt på sjukhus blodbanker.
Den teknik som beskrivs använder här dynamisk ljusspridning (DLS) – även känd som fotonen korrelation spektroskopi eller kvasi elastisk ljusspridning. Decennier, har dynamisk ljusspridning flitigt använts inom läkemedelsindustrin för att karakterisera liposomalt drog formuleringar eller emulsioner där partikelstorlek är i intervallet sub micron. 26 , 27 men verktyg som utvecklats för dessa program inte är optimerade att skärmen blodprodukter. Ett nytt DLS system utvecklades för att övervinna tekniska begränsningar och gör dynamiskt ljus spridning användbar för screening av trombocyttransfusioner. 28
Dynamiska ljusspridning mätningar utförs av lysande de suspenderade partiklarna med laserljus och analysera tid variationen av spridda ljusintensiteten som är en följd av partiklar i suspension. Ytterligare, denna metod använder det omvända förhållandet mellan partikel hastighet och storlek – små partiklar rör sig snabbt och stora partiklar rör sig långsamt – att ge information om storlek distributioner och relativa koncentrationer av provet komponenter. Använda DLS, den genomsnittliga microparticle kan innehåll och genomsnittlig radie av komponenten microparticle kvantifieras. Innehållet i mikropartiklar i blod produkten ges som % MP baserat på området i uppmätta histogrammet för partikel radier från 50-550 nm. Medan partiklar med radier under 50 nm upptäcks av DLS och rapporteras av DLS systemet, de inte ingår i % MP. Snarare än isolera mikropartiklar från trombocyter, bestäms heterogenitet trombocyttransfusioner utifrån relativa innehållet av mikropartiklar och trombocyter i ett prov. I själva verket kan förhållandet av trombocyter och microparticle topparna användas för att beräkna absoluta MP koncentrationen när antalet trombocyter är känd. 19
DLS systemet ger hälso-och sjukvårdspersonal med kvalitativ och kvantitativ information om mikropartiklar som finns i prover från mänskligt blod eller blodprodukter. Den största fördelen med den beskrivna DLS-tekniken över alternativa tekniker såsom flödescytometri, elektronmikroskopi,29 nanopartiklar spårning analys30 eller avstämbara resistiv puls avkänning31 är provpreparering: alikvoter av trombocyter koncentrat kan mätas direkt utan att behöva isolera MP från trombocyter, provspädning eller andra ändringar. 9 , 17 dessutom DLS är en absolut dimensionering metod och lider inte brist på kalibrering pärlor med lämpliga brytningsindex. 14 , 32
En korrelation mellan trombocytaktivering och MP innehåll har tidigare visats genom mikroskopi33,20 och kan härledas från ökningen av MP innehåll i sjukdomstillstånd15,34, 35 , 36 och på in vitro- villkor känd för att aktivera trombocyter. 19 , 37 , 38 men ytterligare studier behövs för att fullt förstå förhållandet mellan DLS-mätt microparticle innehåll och trombocytantal aktivering. Baserat på våra nuvarande kunskaper att aktiverade trombocyter innehåller kick numrerar av mikropartiklar, de är bäst används för terapeutisk behandling av aktivt blödning patienter39, medan hematologi-onkologi patienter nytta av icke-aktiverade blodplättar med inga eller låga nivåer av mikropartiklar20. Det har nyligen rapporterats att in vitro- lyhördhet av givare blodplättar betydligt inte påverkade återhämtning och överlevnad av dessa blodplättar i enda blodtransfusioner till stabil, mestadels icke-blödande hematologi-onkologiska patienter40 . Av detta konstaterande, kan slutsatsen dras att trombocytaktivering som identifierats av hög MP innehåll också spelar ingen betydande roll i profylaktisk behandling av patienter. Dock på grund av det smala urvalet av patienter, denna studie inte upp effekterna av givare faktorer för komplexa patienter som är febril (undantagna från studien), inte stabil och får många mer än bara en trombocyttransfusion. Frågan hur komplexiteten i dessa patientfall kan minskas – som håller löftet att minska refraktäritet – förblir obesvarad.
Mikropartiklar är tidiga markörer av inflammation41,42,43,44 och trombocytantal aktiveringen45 och upptäcks därför hos många friska donatorer. 19 därför aktiverade trombocyter och mikropartiklar finns i trombocyter donationer. Det är rimligt att hypotes att patienter med feber, dvs en fullt aktiverat medfödda immunsystemet, inte tål den extra utmaningen av en transfusion av aktiverade trombocyter. Studier behövs dock för att bevisa denna hypotes. Microparticle screening kan lindra den nuvarande osäkerheten om innehållet i trombocyttransfusioner och minska komplexiteten i patientens behandling.
Förhållandet mellan aktiverade till icke-aktiverade trombocyter i en sjukhusblodbank beror primärt på givaren befolkningen och i mycket mindre grad på transport, bestrålning, patogen agens och andra processer som skulle kunna öka trombocytaktivering i koncentrat. 19 data från stora sjukhusblodbanker i USA visade att den genomsnittliga sammansättningen av trombocyter lagret är 49% aktiveras och 51% icke-aktiverade (intervallet för aktiverade trombocyter: 38-62%, personlig kommunikation). Om blod produktleverantörer eller sjukhusblodbanker vill veta hur många aktiveras och icke-aktiverade trombocyter koncentrat de producerar eller ta emot, och vill hantera sin inventering baserat på trombocytaktivering som anges av microparticle innehåll, detta protokollet kan vara lämplig för dem.
Baserat på trombocytantal sammansättning en sjukhusblodbank kommer att kunna direkt icke-aktiverade, homogen trombocyter för profylaktiskt använda och aktiverad, heterogena trombocyter för terapeutiskt bruk. Trombocytantal screening gör det möjligt för sjukhusen att maximera användningen av tillgängligt lager som förbättrar patientvården och minskar kostnaderna. Detta protokoll är avsedd för laboratoriepersonal som är bekant med grundläggande hantering och manipulering av blodprodukter.
Presenteras här är en screeningmetod för mikropartiklar i trombocyttransfusioner som rutinmässigt kan användas för att hantera sjukhus Blodbanken lager där det är önskvärt att välja produkt baserad på microparticle innehåll. Syftet med detta protokoll är att beskriva genomförandet och utvärderingen av DLS för screening av donerat trombocyter. Protokollet beskrivs behandlar de gemensamma frågorna av icke-invasiva tillgång till prover, integration av testning i Blodbanken arbetsflöde och prestandaegenskaper.
Det här protokollet beskriver en dynamisk ljusspridande metod för microparticle screening optimerad för de höga partikel koncentrationer finns i biologiska prover såsom trombocyter koncentrerar. Metoden för DLS är till sin natur standardiserade för att noggrant mäta storlek. Den relativa koncentrationen av mikropartiklar kan omvandlas till en absolut koncentration om trombocytantalet koncentrationen är känt och trombocytantal toppens används som referens peak19. Som trombocyter koncentrationer erhålls vanligen med hematologi analysatorer eller flöde cytometers dessa metoder kan anses följeslagare teknik till DLS.
Funktionaliteten i DLS systemet är försäkrad genom att köra kontroll pärlor regelbundet. Destillerat vatten kan mätas för att kontrollera att bakgrundsljud är minimal. Kommersiellt tillgängliga trombocytantal standarder kan analyseras som MP-negativa kontroller och, efter tillägg av 125 nm radie pärlor, som MP-positiva kontroller. Inom de biologiska utbud av MP koncentrationerna av intresse är förfarandena praktiskt och snabbt att utföra som en del av rutinen Blodbanken.
I motsats till flödescytometri, är denna metod inte baserad på att jämföra stödnivåerna som spridning av partiklar men snarare hastigheten på deras Brownsk rörelse. Således exosomes kan också upptäckas trots sin litenhet och rapporteras separat från MP.
Utformad som en screeningmetod, är begränsningarna med denna metod relaterade till dess oförmåga att skilja mellan olika typer av mikropartiklar. Det finns potentiella utrymme för förbättring om ytterligare isolering steg används; prov kan testas innan och efter specifika avlägsnande av mikropartiklar genom antikropp tillsammans magnetiska pärla capture. Dessutom kan antas det inte att alla upptäckta mikropartiklar är cellen eftersom kylomikroner bildas i hyperlipidemi47,48 och små bakterier eller virus6 kommer också att redovisas i intervallet microparticle. Andra skyddsåtgärder finns dock inom blodtillförseln till undvika mycket lipemiska eller förorenade trombocyter att ange sjukhus Blodbanken lagret.
Val av antikoagulans i provet påverkar omfattningen av trombocytaktivering och därför de MP innehåll49. Denna faktor måste beaktas för jämförelser av olika produkter. Dessutom utbyte av plasma med MP gratis suspension media såsom PAS kommer att påverka halten MP och tröskeln för fastställande av heterogenitet-om bara ungefär en tredjedel av den ursprungliga MP-innehållet är kvar inom den kvarvarande plasman i koncentratet en med detta anger lägre MP innehåll tröskelvärde samma nivå av trombocytaktivering som i 100% plasma. Procent MP är det MP innehållet i förhållande till trombocyter. Tidigare rapporterades det att den genomsnittliga trombocyttal på PAS produkt var lägre så att den genomsnittliga % MP fortfarande var 9,5%19. Tröskelvärdet % MP för PAS trombocyter licens i USA är inställd till 10%.
Medan den primära källan för MP i trombocytantal koncentrat är givaren, processer som orsakar stress till trombocyter kommer att öka MP beroende på känslighet av trombocyter att betona-om trombocyter aktiveras redan mycket, mindre stressfaktorer som utökad hållbarhetstid, patogen agens, tvättmaskin, kan bestrålning eller långväga transporter leda till betydande ökning av MP innehåll. Ingen av dessa stressorer har visat sig påverka homogen, icke-aktiverade trombocyter19. Dessutom skall uppmärksamhet ägnas risken för förändringar i provets sammansättning inom kapillären om inte testas omedelbart efter beredning (slutförandet av steg 3 i detta protokoll).
Fokus i detta protokoll är att fastställa sammansättningen av partiklar i trombocyttransfusioner och att använda mikropartiklar som biomarkörer för trombocytaktivering. Trombocyttransfusioner är taggade som antingen icke-aktiverade (orange) eller aktiveras (rosa) baserat på en microparticle procentuella tröskelvärdet på 15%. Tröskelvärdet på 15% MP för trombocyter i 100% plasma fastställdes empiriskt genomsnitt 66: e percentilen från flera platser.
Syftet med trombocytantal lager baserat på rutinmässiga microparticle screening med DLS är att förbättra patientens vård och bilresa kostnadseffektivitet genom att förhindra icke-immun trombocytantal refraktäritet. Genomförandet av DLS systemet för screening av trombocyter väskor kommer aktivera användaren direkt icke-aktiverade trombocyter att patientpopulationer mest risk att utveckla trombocytantal refraktäritet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar blodgivarna och Personalen på kanadensiska blodcentral tjänster nätverk för tillämpad utveckling för insamling och produktion av trombocyter enheter används i denna studie. Vi erkänner Kanada Stiftelsen för Innovation och stiftelsen Michael Smith för hälsoforskning för finansiering av infrastruktur i UBC centrum för blod forskning. Finansiering för publikationen lämnades av LightIntegra Technology Inc., tillverkare av ThromboLUX.
ThromboLUX-M | LightIntegra Technology Inc. | LPN120 | DLS System |
ThromboSight Software | LightIntegra Technology Inc. | LPN124 | DLS analysis software |
Capillaries | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE) | LPN065 | Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated |
MiniPet | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific) | LPN082 | 100 µL fixed volume pipette for sampling |
MicroFlex 1-200 µL Pipette tips | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific) | LPN080 | Pipette tips for sampling |
Critoseal | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific) | LPN075 | Capillary Tube Sealant |
Dukal Alcohol Pad or equivalent | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.) | LPN085 | Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol) |
Control beads, 50 nm radius | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.) | LPN128 | Control beads |
Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm | PolySciences Inc. | 64060 | Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water |
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm | PolySciences Inc. | 64014-15 | Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 – 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water |
Genesis BPS RapidSeal II or equivalent | Genesis BPS | 428-SE640 | Tube sealer |
Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent | Fresenius Kabi | 6R4452 | Manual tube stripper |
Biohazard Shield – Cell Counter or equivalent | CardinalHealth | S1389-75 | Splash Shield |
Corning LSE Vortex Mixer or equivalent | Corning Incorporated | 6775 | Vortex mixer |
FACSCanto II Flow cytometer with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent | BD Biosciences | 338960 | Flow cytometer |