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Neuroscience

मानव वयस्क त्वचा Fibroblasts से प्रेरित ंयूरॉंस की एक उच्च उपज संस्कृति के सरल पीढ़ी

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/56904
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Experimental Medical Science, Wallenberg Neuroscience Center, Division of Neurobiology and Lund Stem Cell Center, Lund University, 2John van Geest Centre for Brain Repair & Department of Neurology, Department of Clinical Neurosciences and Cambridge Stem Cell Institute, University of Cambridge

Summary

प्रत्यक्ष ंयूरॉन reprogramming ंयूरॉंस कि शुरू दैहिक कोशिका की उंर बनाए रखने के उत्पंन करता है । यहां, हम एक सदिश का वर्णन आधारित पद्धति को वयस्क मानव दाताओं से प्राप्त चमड़े का fibroblasts से प्रेरित ंयूरॉंस उत्पंन करते हैं ।

Abstract

प्रेरित न्यूरॉन्स (iNs), दैहिक कोशिकाओं के उत्पाद सीधे न्यूरॉन्स के लिए परिवर्तित, एक तरह से प्राप्त करने के लिए रोगी-न्यूरॉन्स ऊतक है कि आसानी से सुलभ है. इस मार्ग के माध्यम से, परिपक्व ंयूरॉंस कुछ हफ्तों के एक मामले में प्राप्त किया जा सकता है । यहां, हम एक सीधा और तेजी से एक कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए वयस्क मानव दाताओं से बायोप्सी नमूनों के माध्यम से प्राप्त चमड़े का fibroblasts से iNs प्राप्त करने के लिए । हम इस प्रक्रिया के प्रत्येक कदम, चमड़े का fibroblasts के रखरखाव सहित, ठंड प्रक्रिया को सेल लाइन का एक स्टॉक बनाने के लिए, reprogramming के लिए कोशिकाओं के सीडिंग, साथ ही साथ संस्कृति शर्तों रूपांतरण की प्रक्रिया के दौरान समझाओ । इसके अलावा, हम electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए ग्लास coverslips की तैयारी का वर्णन, दीर्घकालिक कोटिंग शर्तों, और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS). हम भी परिणामों के उदाहरणों की उंमीद करने के लिए वर्णन । प्रोटोकॉल यहां वर्णित प्रदर्शन करने के लिए आसान है और मानव त्वचा बायोप्सी से विभिंन विभिंन निदान और उंर के साथ रोगियों से व्युत्पंन fibroblasts के लिए लागू किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल iNs जो रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, और लक्ष्य सत्यापन सहित जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विस्तृत सरणी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक पर्याप्त राशि उत्पंन करता है ।

Introduction

मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए प्रभावोत्पादक उपचार के विकास यंत्रवत अध्ययन और कार्यात्मक परख प्रदर्शन करने के लिए मानव मस्तिष्क कोशिकाओं के रहने के लिए सीमित पहुँच द्वारा बाधा गया है. के बारे में एक दशक पहले, इस स्थिति मौलिक प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) प्रौद्योगिकी1,2के विकास के साथ बदल दिया है । यह, सामांय मानव विकास के दौरान होने वाली तंत्रिका भेदभाव तंत्र की एक बेहतर समझ के साथ संयुक्त, रोगी और रोग विशेष सामग्री से परिभाषित और विविध ंयूरॉन उपप्रकार की पीढ़ी के लिए अनुमति दी है । ऐसी सामग्री के साथ, यह अब संभव है मस्तिष्क संबंधी बीमारियों अंतर्निहित intracellular तंत्र का अध्ययन और विभिन्न यौगिकों की क्षमता उन रोग सुविधाओं को कम करने के लिए3.

जबकि iPSCs तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र के लिए क्रांतिकारी गया है, इन कोशिकाओं की एक बड़ी खामी यह है कि उनके बुढ़ापे हस्ताक्षर इस तरह से reprogramming प्रक्रिया के दौरान मिट जाता है कि कायाकल्प ंयूरॉन के साथ जुड़े भेद्यता को बनाए रखने नहीं है एजिंग4,5,6. ंयूरॉंस का उत्पादन कर रहे है कि इस विशेष सुविधा का अंत हो सकता है intracellular रोगजनक झरना के कई पहलुओं recapitulating के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से रोगों के मामले में जो बुढ़ापे के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है ।

प्रत्यक्ष तंत्रिका reprogramming एक तकनीक है जहां एक दैहिक कोशिका सीधे में एक pluripotent मध्यवर्ती चरण के माध्यम से जाने के बिना में बदल जाता है । इस विट्रो में मानव ंयूरॉंस की तेजी से पीढ़ी के लिए अनुमति देता है कि दोनों रोगी और विशिष्ट रोग हो सकता है । प्रत्यक्ष reprogramming के एक उल्लेखनीय विशेषता यह है कि दाता कोशिका के प्रारंभिक उंर बनाए रखा है, और उसके साथ, इस तरह oxidative तनाव4के उत्पादन में वृद्धि के रूप में वृद्धावस्था प्रक्रियाओं को भेद्यता,7। नतीजतन, ऐसे अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग के रूप में वृद्धावस्था के साथ जुड़े मस्तिष्क संबंधी रोगों के साथ रोगियों से iNs, अच्छी तरह से रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग परख सहित जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूल हैं, और विषविज्ञान अध्ययन .

मुख्य चेतावनी है कि neurodegenerative विकारों के साथ रोगियों से इन रोका गया है व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है कि वे reprogram आसान नहीं हैं, और इस fibroblasts के विस्तार के साथ और भी मुश्किल हो जाता है । नतीजतन, अनुप्रयोगों के इन प्रकार के लिए आवश्यक मात्रा में कोशिकाओं में की पीढ़ी केवल हाल ही में8तक प्राप्त नहीं किया गया है । अब हम एक सरल तरीका है एक बहुत ही कुशल तरीके से किसी भी उंर के दानदाताओं से fibroblasts reprogram विकसित किया है । इस विधि के एक पछाड़ना के साथ Ascl1 और Brn2 का दमनकर्ता प्रोटीन RE1-मुंह प्रतिलेखन कारक (शेष) एक सदिश का उपयोग कर के साथ ंयूरॉन प्रतिलेखन कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति को जोड़ती है । यहां, हम विभिंन बुजुर्ग दाताओं से त्वचा fibroblasts biopsied से परिवर्तित भारतीय नौसेना पोत की पीढ़ी के लिए अग्रणी कदम का वर्णन ।

Protocol

वयस्क चमड़े का fibroblasts पार्किंसंस रोग अनुसंधान और हटिंगटन के रोग क्लीनिक जॉन वान Geest केंद्र में मस्तिष्क की मरंमत (कैंब्रिज, यूके) और स्थानीय नैतिक अनुमोदन (आरईसी 09/H0311/88) के तहत इस्तेमाल से प्राप्त किया गया । त्वचा बायोप्सी नमूना प्रक्रिया पर विवरण के लिए, संदर्भ8देखें ।

1. reprogramming के लिए त्वचा Fibroblasts की तैयारी

  1. एक स्वचालित सेल गल प्रणाली या एक ३७ ° c पानी स्नान का उपयोग करना, गल वयस्क मानव अधययन fibroblasts (aHDFs) और प्लेट २००,००० प्रति T75 कुप्पी (एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ गिनती) में fibroblast मध्यम के 10 मिलीलीटर ( तालिका 1देखें) में ३७ ° c 5% CO2.
  2. fibroblast माध्यम के साथ एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन अगले दिन पर प्रदर्शन ।
  3. fibroblast मध्यम हर 3-4 दिन में बदलें जब तक कोशिकाओं ९५% प्रवाह तक पहुंचने ।
    नोट: एक धाराप्रवाह कुप्पी लगभग १,०००,००० कोशिकाओं को शामिल करेंगे । aHDFs के लिए सेल लाइन (खंड 2) या सीधे reprogramming (धारा 3) के लिए तैयार फिर से मढ़वाया एक शेयर का निर्माण जम सकता है ।

2. त्वचा की जमने Fibroblasts

  1. बर्फ के साथ एक बॉक्स में एक नियंत्रित दर ठंड कंटेनर या 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें ।
  2. अलग ०.०५% trypsin (१.५ मिलीलीटर प्रति T75 कुप्पी) के साथ कोशिकाओं को ३७ ° c 3 – 5 मिनट के लिए ।
  3. fibroblast मध्यम जोड़ें (भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त) trypsin बेअसर करने के लिए (प्रति फ्लश 3 मिलीलीटर T75 कुप्पी) और दो बार कुप्पी में कोशिकाओं को फ्लश करके एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में अलग कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  4. स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों को गिनना; (अनुशंसित) लगभग ५००,००० aHDFs प्रति शीशी फ्रीज ।
  5. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन ।
  6. मध्यम ठंड के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड ( तालिका 1देखें) और क्रायोजेनिक ट्यूब में स्थानांतरण. ट्यूबों को सीधे नियंत्रित-दर-फ्रीज कंटेनर में रखें ।
  7. -८० ° c रातोंरात पर नियंत्रित दर ठंड उपकरण स्टोर । अगले दिन, एक-१४० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और जब तक की दुकान की जरूरत ट्यूबों के हस्तांतरण ।

3. reprogramming के लिए चढ़ाना (दिन − 1)

नोट: यह अल्पावधि प्रयोगों (30 दिनों तक) के लिए एक जिलेटिन कोटिंग का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है; वैकल्पिक रूप से, दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए यह एक पाली-एल-ornithine, fibronectin और laminin (PFL) कोटिंग पर शुरू करने के लिए सिफारिश की है ।

  1. ६० मिनट reprogramming के लिए aHDFs चढ़ाना से पहले, कोट ०.१% जिलेटिन (२५० µ एल के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली/) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  2. महाप्राण पर fibroblast यम से aHDFs । DPBS के साथ एक बार धो लें । अलग ०.०५% trypsin (१.५ मिलीलीटर प्रति T75 कुप्पी) के साथ कोशिकाओं को ३७ ° c 3 – 5 मिनट के लिए ।
  3. trypsin को बेअसर करने के लिए fibroblast मीडियम जोड़ें (प्रति फ्लश 3 मिलीलीटर T75 कुप्पी) और कुप्पी में दो बार कोशिकाओं को फ्लश करके 15 मिलीलीटर ट्यूब में अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करें ।
  4. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन, supernatant त्यागें, और fibroblast मध्यम के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड ।
  5. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती (एक अच्छी गुणवत्ता रूपांतरण की जांच सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिका व्यवहार्यता trypan नीले दाग के साथ ९०% से ऊपर है) ।
  6. एक पूर्ण 24-well प्लेट के लिए, १,३२०,००० कक्षों का निलंबन fibroblast माध्यम के १००,००० कोशिकाओं के निलंबन को प्राप्त करने के लिए तैयार करें/एमएल ऑफ मीडियम (या ५५,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से ५५० µ एल में fibroblast मध्यम की जरूरत कुओं की संख्या से गुणा) ।
  7. प्लेट से जिलेटिन को महाप्राण और DPBS के साथ दो बार धोएं । एक अच्छी तरह से सेल निलंबन के ५०० µ एल जोड़ें और 5% CO2में ३७ ° c पर रात भर गर्मी ।

4. वायरल Transduction (Day 0)

नोट: lentiviral कणों के साथ काम करना श्रेणी 2 उपकरण और एक एजेंट के उपयोग के लिए वायरस बेअसर की आवश्यकता है । दस्ताने के दोहरे जोड़े पहने भी दृढ़ता से सिफारिश की है ।

  1. ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए fibroblast मध्यम के १३.२ मिलीलीटर गर्म ।
  2. गल एक lentiviral सदिश युक्त प्रतिलेखन कारकों Ascl1 और Brn2 के साथ दो लघु कांटा RNAs (shRNA) कमरे के तापमान पर आराम लक्ष्यीकरण ।
    नोट: संदर्भ8देखें; निर्माण एक प्लाज्मिड भंडार में उपलब्ध है । प्रक्रिया पर विवरण के लिए lentiviruses का उत्पादन करने के लिए कृपया संदर्भ9देखें ।
  3. aHDFs संक्रमण (मुि) की बहुलता पर 20 से मध्यम तक किसी भी transduction बढ़ाने के लिए संक्रमित करने के लिए lentivirus की आवश्यक मात्रा जोड़ें ।
    Equation
  4. lentiviral वेक्टर युक्त fibroblast माध्यम के साथ 24 अच्छी तरह से थाली में मध्यम बदलें (५०० µ एल/अच्छी तरह से) और 5% सह में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन2।
  5. अगले दिन, lentiviral वेक्टर के बिना ताजा fibroblast माध्यम से कुओं में मध्यम की जगह ।
    नोट: मध्यम 7 दिनों के लिए संक्रामक माना जाता है और इस तरह के रूप में, पर्याप्त सुरक्षा और हैंडलिंग प्रक्रियाओं वायरल transduction के बाद पहले सप्ताह के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

5. परिवर्तित कोशिकाओं का रखरखाव

नोट: एक बार रूपांतरण शुरू कोशिकाओं उठाने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं; देखभाल करने के लिए थाली टिप ऊपर और एक १,००० µ एल पिपेट का उपयोग करें जब मीडिया को हटाने के लिए अलग कोशिकाओं से बचने के ।

  1. 3 दिन पर, fibroblast मध्यम निकालें और जल्दी ंयूरॉन रूपांतरण माध्यम के ५०० µ एल जोड़ें ( तालिका 1देखें).
  2. सप्ताह में दो से तीन बार, अच्छी तरह से पुराने माध्यम के २२५ µ एल बाहर ले और ताजा जल्दी ंयूरॉन रूपांतरण माध्यम के २५० µ एल में जोड़ें ।
  3. 18 दिन पर, प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम के सभी निकालें और देर से ंयूरॉन रूपांतरण माध्यम के ५०० µ l के साथ बदलें ( तालिका 1देखें) ।
  4. देर से न्यूरॉन रूपांतरण माध्यम के साथ ऊपर के रूप में आधे से ऊपर के रूप में बदलने के लिए जारी रखें हर 2-3 दिन तक दिन 25 या प्रयोग समापन बिंदु (चित्र 1a) ।
    नोट: यदि प्रयोग के लिए हर कुआं में कोशिकाओं को नहीं चढ़ाया जाता है, तो पंजाब या पानी के साथ खाली कुओं को भरने के लिए मध्यम के प्रकट वाष्पीकरण को रोकने और कुओं के बीच भिन्नता को कम करने के लिए ।
शेयर एकाग्रता कार्य एकाग्रता
Fibroblast माध्यम
बेसल मध्यम N/A N/A
पेनिसिलिन Streptomycin/ १०,००० यू/एमएल १०० मिलीग्राम/एमएल
FBS N/A 10%
ठंड मध्यम
Fibroblast माध्यम N/A ४५%
FBS N/A ४५%
dmso N/A 10%
अर्ली न्यूरॉनल रूपांतरण माध्यम (ेंम)
तंत्रिका विभेद मध्यम N/A N/A
पेनिसिलिन Streptomycin/ १०,००० यू/एमएल १०० मिलीग्राम/एमएल
CHIR99021 10 एमएम २ µ मी
SB-४३१५४२ 20 एमएम १० µ मी
नोगिन १०० µ g/mL ०.५ µ g/mL
LDN-१९३११८९ 10 एमएम ०.५ µ m
vpa 1 मीटर 1 मिमी
एलएम-22A4 20 एमएम २ µ मी
GDNF 20 µ g/mL 2 एनजी/
NT3 10 µ g/mL 10 एनजी/µ एल
डीबी-कैंप ५० एमएम ०.५ एमएम
देर से न्यूरॉनिक रूपांतरण माध्यम (LNM)
तंत्रिका विभेद मध्यम N/A N/A
पेनिसिलिन Streptomycin/ १०,००० यू/एमएल १०० मिलीग्राम/एमएल
एलएम-22A4 20 एमएम २ µ मी
GDNF 20 µ g/mL 2 एनजी/
NT3 10 µ g/mL 10 एनजी/µ एल
डीबी-कैंप ५० एमएम ०.५ एमएम
FACS बफर
HBSS 1x [-कैल्शियम,-मैग्नीशियम,-phenol लाल] N/A N/A
bsa N/A 1%
DNAase N/A ०.०५%

तालिका 1: उपयोग किए गए अलग मीडिया की संरचना. सभी मीडिया fibroblast मध्यम, ठंड मध्यम, जल्दी ंयूरॉन रूपांतरण माध्यम, देर से ंयूरॉन रूपांतरण माध्यम, और FACS बफर सहित इस प्रोटोकॉल में जरूरत के लिए संरचना का पूरा विवरण ।

6. Electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए ग् Coverslips

नोट: यह एक प्रयोगशाला कोट, चश्मे, डबल दस्ताने पहनने की सिफारिश की है, और एक धुएं डाकू में काम के सभी पूरा करें । यह प्रोटोकॉल 10से अनुकूलित है ।

  1. ओवरलैप के बिना एक गिलास पकवान के तल पर जगह ग्लास coverslips ।
  2. सामान्य प्रयोगशाला जोड़ें डिटर्जेंट coverslips के सभी जलमग्न करने के लिए झटकों के दौरान ओवरफ़्लो जोखिम के बिना (लगभग 30 मिलीलीटर). 2 एच के लिए धीमी गति से एक कक्षीय शेखर पर प्लेस ।
  3. autoclaved जल के साथ छह बार (30 मिनट प्रत्येक) धो लो ।
  4. 2 एच के लिए ९५% इथेनॉल जोड़ें
  5. इथेनॉल निकालें और इंतजार जब तक coverslips सूख रहे हैं ।
  6. एक बार सूखा, एक गिलास चोंच में coverslips हस्तांतरण और ७०% नाइट्रिक एसिड जोड़ने जब तक coverslips जलमग्न हैं ।
  7. ६० मिनट के लिए एक sonicator स्नान में कांच चोंच प्लेस ।
  8. नाइट्रिक एसिड निकालें और autoclaved जल के साथ तीन बार धो लें ।
    चेतावनी: हमेशा पानी के लिए एसिड जोड़ने के लिए, दूसरे के आसपास कभी नहीं के रूप में यह एक हिंसक प्रतिक्रिया के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  9. संभव के रूप में चोंच से जितना पानी निकालें और केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCI) जोड़ने जब तक coverslips जलमग्न हो रहे हैं; चोंच और आयल फिल्म के साथ कवर घूमता है ।
  10. ६० मिनट (50-60 हर्ट्ज, 30 डब्ल्यू) के लिए Sonicate ।
  11. संभव के रूप में coverslips से ज्यादा HCI के रूप में निकालें और एक उचित अपशिष्ट बिन में जगह है । autoclaved जल से दो बार कुल्ला ।
  12. coverslips के बाहर डाकू और कुल्ला 20 बार (या अधिक autoclaved जल के साथ) जब तक HCI के सभी हटा दिया जाता है ।
  13. एक बार सूखे, बाँझ 24 अच्छी तरह से प्लेटों में जगह coverslips ।
  14. पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत प्लेटें रात भर रखें । अगले दिन coverslips का उपयोग करने के लिए तैयार हैं ।
    नोट: यदि ग्लास coverslips इस्तेमाल किया जा रहा है, यह PFL कोटिंग का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । बस एक 24 के एक अच्छी तरह से थाली में एक coverslip जगह (बाँझ संदंश का उपयोग) और नीचे के रूप में प्रोटोकॉल का पालन करें ।

7. दीर्घकालिक संस्कृति के लिए PFL कोटिंग

  1. कोट पाली के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेट-L-ornithine (५०० µ एल/अच्छी तरह से) और 5% CO2में ३७ ° c पर रात भर छोड़ दें ।
  2. महाप्राण पाली-L-ornithine और जब तक यह काफी शुष्क शीर्ष पर फार्म का गिरता है रुको ।
  3. एक बूंद (लगभग ६० µ एल) laminin के केंद्र में एक अच्छी तरह से बनाने के लिए और coverslip की पूरी सतह को कवर फैल गया । 5% CO2में ३७ ° c पर 2 h ४५ मिनट के लिए छोड़ें ।
  4. DPBS के साथ तीन बार धोएं ।
  5. fibronectin जोड़ें (५०० µ एल/अच्छी तरह से) और 5% CO2में ३७ ° c पर रात भर छोड़ दें ।
  6. कोशिकाओं को जोड़ने से पहले DPBS के साथ एक बार धो लें ।
    नोट: PFL कोटिंग भारतीय नौसेना पोत (१०० दिन से अधिक) के दीर्घकालिक संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि प्रगतिशील सेल मौत 30 दिन से होने की उंमीद है ।

8. FACS

नोट: FACS छंटाई के बाद कोशिकाओं को फिर से प्लेट करने के लिए एक PFL-लेपित प्लेट अग्रिम में ४८ एच तैयार करते हैं । कोशिकाओं एक तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु का उपयोग कर हल किया जा सकता है (NCAM) एंटीबॉडी दिन से 20 बाद transduction निंनलिखित ।

  1. एक १,००० µ l पिपेट के साथ मीडिया निकालें (अलग कोशिकाओं से बचने के लिए धो नहीं है).
  2. सेल dissociating एजेंट जोड़ें (२५० µ एल/ठीक है), 10 के लिए छोड़ दो-20 मिनट तक कोशिकाओं को उठा, और एक कोशिकाओं के रूप में नाव ।
  3. इस समय के दौरान FACS बफ़र तैयार करें ।
  4. Triturate लिएर साथ एक १,००० µ l पिपेट । कुछ झुरमुट रहते हैं, तो थोड़ा सा अब गर्मी ।
  5. एक बार एक सेल निलंबन प्राप्त है, यह अच्छी तरह से निकालें और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में जगह है ।
  6. एक ही १.५ मिलीलीटर ट्यूब में देर से ंयूरॉन रूपांतरण माध्यम और जगह के साथ अच्छी तरह से दो बार फ्लश ।
  7. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर नीचे स्पिन और supernatant त्यागें ।
  8. FACS बफर के २०० µ एल में सेल गोली reसस्पेंड ।
  9. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन और supernatant त्यागें ।
  10. दोहराएं चरण ८.८ और ८.९ दो बार ।
  11. FACS बफर के ५० µ एल में सेल गोली reसस्पेंड मानव CD56 युक्त (NCAM) एंटीबॉडी बर्फ पर 15 मिनट के लिए 1:50 की एकाग्रता में । प्रकाश से रक्षा करना ।
  12. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन ।
  13. reसस्पैंड में २०० µ एल FACS बफर और 5 मिनट के लिए ४०० एक्स जी में नीचे स्पिन कोशिकाओं को ।
  14. चरण ८.१३ दोहराएँ ।
  15. propidium आयोडाइड (PI; 10 µ g/mL) युक्त FACS बफ़र के २०० µ l में पुनर्निलंबित । NCAM धनात्मक (iNs) और pi ऋणात्मक (live) कक्षों को NCAM एंटीबॉडी या pi के साथ दाग नहीं थे जो नियंत्रण नमूनों की प्रतिदीप्ति तीव्रता स्तर पर आधारित गेटिंग द्वारा FACS का उपयोग कर सॉर्ट करें ।
  16. देर से ंयूरॉन रूपांतरण माध्यम युक्त एक ट्यूब में NCAM सकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  17. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं को गिनती और एक PFL लेपित पकवान में देर से ंयूरॉन रूपांतरण माध्यम में एक उच्च घनत्व (५०,००० कोशिकाओं/2) में कोशिकाओं को फिर से प्लेट ।
  18. प्रयोग समापन बिंदु (चित्र 1a) तक देर से न्यूरॉन के रूपांतरण माध्यम के साथ एक सप्ताह के मध्यम 2 – 3 बार बदलने के लिए जारी रखें.

Representative Results

कक्ष आकृति विज्ञान में स्पष्ट परिवर्तन दिन के 5 बाद (चित्र 1b) से दृश्यमान होना चाहिए । वायरल transduction के बाद कुछ सेल की मौत की उम्मीद की जा रही है, हालांकि खुलकर नहीं । एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में एक अच्छी तरह से 20000-40000 कोशिकाओं के कुल सेल उपज 25 दिन, जिनमें से आधे के बारे में ंयूरॉंस बन जाना चाहिए की उंमीद की जानी चाहिए । यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि उपज और पवित्रता सेल लाइन के पार, साथ ही साथ रोग राज्य और वायरस बैचों में भिंन हो सकते हैं ।

कक्ष MAP2 और ताऊ (चित्रा 1C) सहित सबसे मानक ंयूरॉन मार्करों व्यक्त करेंगे 25 दिन में एक परिपक्व ंयूरॉन आकृति विज्ञान प्रदर्शन के अलावा । यह मार्कर NCAM पर आधारित FACS द्वारा जनसंख्या में एक शुद्ध प्राप्त करने के लिए संभव है (संदर्भ8,11देखें). कोशिकाओं के बाद या तो PFL ट्रिपल कोटिंग पर फिर से चढ़ाया जा सकता है (संदर्भ10देखें) या सीधे रूप से आणविक विश्लेषण के लिए जमे हुए ।

यदि कक्ष सॉर्ट नहीं किए जाते हैं, तो इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग या तो MAP2 या ताऊ के साथ सफलतापूर्वक कनवर्ट की गई कोशिकाओं और सह-लेबल की पहचान करने के लिए किया जाना चाहिए ब्याज की प्रोटीन के साथ ।

Figure 1
चित्र 1: समय के साथ रूपांतरण में का विकास. (क) प्रयोग और एक lentivirus में पैक के निर्माण के नक्शे की समयरेखा वयस्क मानव चमड़े का fibroblasts reprogram करने के लिए इस्तेमाल किया । प्रत्येक काला तीर एक मध्यम परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है । (B) प्रतिनिधि चरण कंट्रास्ट छवियां 0 दिन 22 से दिन के बीच कनवर्ज़न प्रक्रिया के दौरान कक्षों की आकृति विज्ञान में परिवर्तन दर्शाती है (जैसा कि प्रत्येक पैनल के ऊपरी दाएं कोने पर दर्शाया गया है) । छवियां एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप पर लिया 10x उद्देश्य का उपयोग कर रहे थे । (ग) एक ताऊ की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेज और MAP2 डबल धुंधला दिन में ३५ पोस्ट-transduction । कोशिकाओं को 4% paraformaldehyde और permeabilized में ०.१% ट्राइटन के साथ DPBS में 10 मिनट के लिए निर्धारित किया गया था. कोशिकाओं को DPBS में एक 5% सीरम समाधान में 30 मिनट के लिए ब्लॉक किए गए थे । एंटीबॉडी समाधान अवरुद्ध में पतला और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात लागू किया गया । Fluorophore-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान अवरुद्ध में पतला थे और 2 एच कोशिकाओं के लिए आवेदन किया DAPI के साथ 15 मिनट के लिए DPBS के साथ 3 बहाकर पीछा किया counterstained थे । छवियों 20X उद्देश्य का उपयोग कर एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर ले जाया गया । स्केल पट्टियां = १०० µm (B, C) । संक्षिप्त नाम: ेंम: जल्दी ंयूरॉन मध्यम; LNM: देर से ंयूरॉन मध्यम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यह एक कदम/एक वेक्टर reprogramming विधि मानव वयस्क fibroblasts से iNs प्राप्त करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है । मानव वयस्क fibroblasts आम तौर पर कर रहे है और अधिक भ्रूण fibroblasts से गुप्त के लिए मुश्किल है, सीमित अध्ययन के साथ पहले लगभग 5-10%12,13की क्षमता रिपोर्टिंग । हालांकि, इस नए प्रोटोकॉल के साथ यह एक ंयूरॉन उपज प्राप्त करने के लिए संभव है (MAP2 के रूप में मापा + कोशिकाओं) के लगभग ५०%8। इसके अतिरिक्त, हमारे प्रोटोकॉल चमड़े का fibroblasts है कि रूपांतरण की दक्षता खोने के बिना कई बार पारित किया गया है पर इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रकार अब तक हम कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है रूपांतरण दक्षता में किसी भी कमी का पता लगाने के बिना 14 बार तक गुजरा । इसके अलावा, वहां ५२ और ८७ के बीच की उंर के दाताओं से fibroblasts के साथ हमारे हाथ में दक्षता reprogramming में कोई फर्क नहीं है । इस निर्माण के साथ परीक्षण की गई अन्य सेल लाइनों की उम्र और रोग के बारे में अधिक जानकारी के लिए संदर्भ देखें8. अंय अध्ययनों से भी एक lentiviral आधारित और छोटे अणु का उपयोग कर रूपांतरण दक्षता में कोई अंतर नहीं बताया है-0 और ८९ साल के बीच दाताओं के साथ प्रोटोकॉल बढ़ाया4। इसके अलावा, miRNA के साथ सुसंगत प्रयोज्यता आधारित ंयूरॉन reprogramming सभी उंर के fibroblasts में सूचित किया गया है, 0 और ८६ साल के बीच दाताओं के साथ7। इस मार्ग के माध्यम से, परिपक्व न्यूरॉन्स लगभग में प्राप्त किया जा सकता है 12 – 15 सप्ताह में इन विट्रो या लगभग 8 सप्ताह vivo मेंप्रत्यारोपण के बाद8. यह लाभप्रद है क्योंकि यह दोनों रोग और ऊतक है कि आसानी से सुलभ है से रोगी विशिष्ट मानव आईएनएस के लिए उपयोग देता है । हालांकि इस प्रोटोकॉल कुशल है, यह एक १००% ंयूरॉन उपज का उत्पादन नहीं होगा, और इस तरह के रूप में एक शुद्ध उदाहरण के लिए FACS का उपयोग कर कदम की आवश्यकता है ।

इस प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम वायरल transduction (प्रोटोकॉल खंड 4) है । यह महत्वपूर्ण है कि वायरस titer सटीक है, रूपांतरण के लिए aHDFs की एक सटीक संख्या चढ़ाया होने के अलावा । इस प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग के लिए अनुशंसित titer 4 x 108 और 4 x 109के बीच है । 1 x 108 के नीचे कुछ के एक titer का उपयोग कर के रूप में वायरस की बड़ी मात्रा में कोशिकाओं को विषाक्त हो जाएगा जोड़ने की सिफारिश नहीं की जाएगी । इसके अलावा, के रूप में fibroblasts iNs वे और अधिक नाजुक हो जाएगा और उठाने के लिए अतिसंवेदनशील को गुप्त शुरू करते हैं । यह कोमल होना आवश्यक है जब मीडिया को बदलने के रूप में बहुत ज्यादा कोशिकाओं को परेशान नहीं है । इस द्रव को धीरे से निकालकर एक १,००० µ l पिपेट के साथ किया जा सकता है. अंत में, जब reprogramming के लिए चढ़ाना (प्रोटोकॉल अनुभाग 3) यह एक प्रयोग शुरू करने से पहले एक स्वस्थ fibroblast जनसंख्या सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है; यह trypan नीले दाग के साथ ९०% से ऊपर की एक कोशिका व्यवहार्यता द्वारा संकेत दिया है । aHDFs हमेशा ९५% प्रवाह तक पहुंचने से पहले पारित किया जाना चाहिए ।

अगर वायरल transduction से पहले ध्यान देने योग्य कोशिका मृत्यु है, रूपांतरण शुरू नहीं: डबल की जांच करें कि सेल व्यवहार्यता ९०% से ऊपर है और कि वहां थाली की कोटिंग के साथ कोई समस्या नहीं थे । यह सेल मौत की एक छोटी राशि वायरल transduction निंनलिखित है की उंमीद है, तथापि, यह महत्वपूर्ण नहीं होना चाहिए । इस मामले में, ५०,००० aHDFs की सही सीडिंग की पुष्टि करें/ यदि रूपांतरण के दौरान कुओं के बीच ध्यान देने योग्य विसंगति है, पहले की जांच करें कि हर अच्छी तरह से मीडिया और प्रकट वाष्पीकरण की एक बराबर राशि शामिल किनारों पर उत्पंन नहीं है (यदि आवश्यक अतिरिक्त मीडिया के किनारे कुओं में जोड़ा जा सकता है) । वैकल्पिक रूप से, ४.४ कदम की जांच करें, और सुनिश्चित करें कि एक समरूप निलंबन के लिए उपयुक्त मिश्रण जब transducing । यह lentivirus को जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है पहले, कुओं में जोड़ने से पहले । सीधे कुओं में lentivirus जोड़ने अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता में वृद्धि होगी और भी कोशिकाओं को विषाक्त होने की संभावना है । अंत में, हमेशा जांचें कि मध्यम ३७ डिग्री सेल्सियस से पहले कोशिकाओं को जोड़ने से गर्म है ।

यह प्रोटोकॉल भारतीय नौसेना पोत की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए कोटिंग शर्तों के लिए वैकल्पिक वर्गों और FACS छंटाई के लिए ंयूरॉन शुद्धता बढ़ाने शामिल हैं । भारतीय नौसेना पोत के कार्यात्मक लक्षण वर्णन की जांच करने के लिए इच्छुक प्रयोगों के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए ग्लास coverslips की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल भी शामिल किया गया है । यहां कनवर्ज़न प्रोटोकॉल 24-well प्लेट के साथ उपयोग के लिए सेट किया गया है; यदि यह एक 6 के लिए संशोधित किया जा सकता है, 12-, ४८-, ९६-अच्छी तरह से प्लेट या कुप्पी । इस मामले में, प्लेट या कुप्पी उपयोग की सतह क्षेत्र के लिए सभी संस्करणों को समायोजित करें ।

इस प्रोटोकॉल के संयोजन में Ascl1 और Brn2 के लिए मजबूर अभिव्यक्ति का उपयोग करता है एक शेष सभी एक एकल सदिश8 में पैक पछाड़ना के साथ एक पैन-न्यूरॉन phenotype के iNs उत्पंन । हालांकि, इस पद्धति के साथ किसी भी glial उपप्रकार के उत्पादन का आकलन नहीं किया गया है । इस विधि इस प्रकार अंय reprogramming कारकों के साथ प्रयोग के लिए उपप्रकार विशिष्ट ंयूरॉंस प्राप्त करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता होगी । प्रत्यक्ष reprogramming पहले मोटर न्यूरॉन्स, संवेदी न्यूरॉन्स, photoreceptors, striatal मध्यम कंटीला ंयूरॉंस, और dopaminergic ंयूरॉंस10,14उत्पंन करने की संभावना को दिखाया गया है । यह लाभकारी होगा जब मस्तिष्क संबंधी रोगों की जांच में जो विशिष्ट ंयूरॉन उपप्रकार को तरजीही रूप से प्रभावित कर रहे हैं, उदाहरण के लिए पार्किंसंस रोग और dopaminergic न्यूरॉन्स ।

बहुत हाल ही में जब तक, प्रत्यक्ष तंत्रिका reprogramming प्रौद्योगिकी एक मानकीकृत और कुशल तरीके से भारतीय नौसेना पोत के उत्पादन के लिए अनुमति नहीं है-एक स्तर है कि एक बड़े पैमाने पर विषविज्ञान और दवा जांच परख के लिए आवश्यक है । इस नई विधि बहुत कुशल है और fibroblasts है कि कई बार पारित किया गया है पर इस्तेमाल किया जा सकता है, ऐसी है कि यह अब इन प्रतिबंधों को हटा और अध्ययन का एक विशाल सरणी के लिए खुलता है, न केवल एक मानव तंत्रिका तंत्र में, लेकिन यह भी एक प्रणाली है कि रोगी विशिष्ट हो सकता है । इस दृष्टिकोण की सादगी किसी भी ऐसे में घर में इसी तरह के अध्ययन प्रदर्शन और आसानी से न केवल बड़े पैमाने पर ऐसे दवा स्क्रीनिंग और विषविज्ञान परख के रूप में चिकित्सा अनुप्रयोगों, के लिए, लेकिन यह भी समर्थन करने के लिए इच्छुक समूहों के लिए सुलभ प्रौद्योगिकी में renders पशु मॉडल और मानव पोस्ट मार्टम ऊतक नमूनों से व्युत्पंन डेटा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

तकनीकी सहायता के लिए हम मैरी Persson Vejgården को धन्यवाद देते हैं । इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान ंयूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन से धन प्राप्त हुआ है, यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम के तहत यूरोपियन रिसर्च काउंसिल: FP/2007-2013 न्यूरो स्टेम सेल मरंमत (no. ६०२२७८) और ईआरसी अनुदान समझौते सं । ३०९७१, स्वीडिश अनुसंधान परिषद (अनुदान करार 521-2012-5624, 2016-00873 और 70862601/Bagadilico), स्वीडिश पार्किंसंस फाउंडेशन (Parkinsonfonden), और Lund विश्वविद्यालय Multipark में रणनीतिक अनुसंधान क्षेत्र (multidisciplinary अनुसंधान में पार्किंसंस रोग) । Janelle Drouin-Ouellet स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) फैलोशिप (#358492) के एक कनाडाई संस्थानों द्वारा समर्थित है, और रोजर बार्कर कैंब्रिज विश्वविद्यालय/NIHR के अस्पताल के लिए एक Addenbrooke बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर अनुदान द्वारा समर्थित है । मलीन परमार न्यूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन Robertson अन्वेषक आहे. Shelby Shrigley यूरोपीय संघ क्षितिज २०२० कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित है (H2020-MSCA-ITN-२०१५) मैरी Skłodowska-क्यूरी अभिनव प्रशिक्षण नेटवर्क और अनुदान समझौते No. ६७६४०८ के तहत ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Lines
Adult human dermal fibroblasts  [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK).
Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] Gibco 14190094
Trypsin-EDTA [0.5%] Gibco 15400-054 Dilute to 0.05% in DPBS.
Virkon (agent used to neutralize virus) Viroderm 7511  Dilute to 1% solution with warm water.
Milli-Q Water Millipore
Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax Gibco 61965059
Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106
CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 Miltenyi 170-076-303
Neural differentiation medium - NDiff 227 Takara-Clontech Y40002
LM-22A4  Tocris 4607 Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM.
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] R&D systems 212-GD-010 Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. 
NT3 [recombinant human] R&D systems 267-N3-025 Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. 
db-cAMP  Sigma Aldrich D0627 Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. 
CHIR99021 Axon 1386 Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. 
SB-431542 Axon 1661 Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. 
Noggin [recombinant human] Miltenyi 130-103-456 Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL.
LDN-193189 Axon 1509 Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM.
Valproic acid sodium salt (VPA) Merck Millipore 676380 Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation.
Reagents for Coatings
Gelatin  Sigma Aldrich G2500 Dilute to 0.1% in Milli-Q water.
Poly-L-ornithine Sigma Aldrich P3655 Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. 
Fibronectin ThermoFisher Scientific 33010-018 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. 
Laminin ThermoFisher Scientific 23017-015 Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. 
Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting
Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) ThermoFisher Scientific A1110501
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] ThermoFisher Scientific 14175-046
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153 Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM).
DNAase Sigma Aldrich DN-25 Use at 0.05% concentration.
Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] BD Pharmingen 555518 Use at 1 : 50.
Propidium iodide Sigma Aldrich P4170 Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL.
Reagents for Glass Coverslips
Autoclaved deionized water
Alconox detergent Sigma Aldrich Z273228
Ethanol 95%
Nitric Acid Sigma Aldrich 438073-M CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful.
Concentrated hydrochloric acid (HCI) CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful.
Reagents for Immunocytochemistry
Paraformaldehyde (PFA) Merck Millipore 1040051000 Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin
Triton X-100 Fisher Scientific 10254640 Use at a concentration of 0.1%.
Serum [Donkey] Merck Millipore S30-100ML
Anti-MAP2 Antibody [Chicken] Abcam ab5392 Use at a concentration of 1 : 5,000.
Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] ThermoFisher Scientific MN1000 Use at a concentration of 1 : 500.
Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] Jackson ImmunoResearch 703-165-155 Use at a concentration of 1 : 400.
Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] Jackson ImmunoResearch 715-545-150 Use at a concentration of 1 : 400.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma Aldrich D9542 Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.
Equipment
T75 flask [Nunclon Delta Surface] ThermoFisher Scientific 156499
24-well plate [Nunc] ThermoFisher Scientific 142485
1.5 mL polypropylene tube Sigma Aldrich Z336769
15 mL falcon tube  Sarstedt 62.554.502
50 mL falcon tube  Sarstedt 62.547.254
CryoPure tube 1.6 mL Sarstedt 72.380
Pippette controller For pipetting volumes 1-25 mL.
Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL  Sarstedt 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL 
Sterile pipette tips For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL.
Glass coverslips NeuVitro GG-12-1.5-oz #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates.
Glass dish Approximately 150mm diameter.
Glass beaker Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker.
Parafilm M VWR
ThawSTAR Automated Cell Thawing System BioCision BCS-601
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000
Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] ThermoFisher Scientific C10228 For use with Countess II Automated Cell Counter.
CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container Biocision BCS-405
Laminar flow hood
Humidified 5% CO2 37 °C incubator
Centrifuge Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes.
Orbital shaker
Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner Sigma Aldrich Z305359 Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts
FACS Aria III cell sorter BD Pharmingen
Phase contrast microscope Olympus CKX31
Inverted fluorescence microscope Leica DMI6000 B

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३२ प्रेरित न्यूरॉन्स वयस्क मानव चमड़े का fibroblasts प्रत्यक्ष तंत्रिका reprogramming मानव न्यूरॉन्स FACS शुद्धि lentiviral वेक्टर
मानव वयस्क त्वचा Fibroblasts से प्रेरित ंयूरॉंस की एक उच्च उपज संस्कृति के सरल पीढ़ी
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Shrigley, S., Pircs, K., Barker, R. A., Parmar, M., Drouin-Ouellet, J. Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (132), e56904, doi:10.3791/56904 (2018).

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