Summary
Direkte neuronal omprogrammering genererer nevroner som ivaretar alderen på somatiske startcellen. Her beskriver vi en enkelt vektor-basert metode for å generere indusert neurons fra dermal fibroblaster fra voksen menneskelige givere.
Abstract
Indusert neurons (iNs), produktet av somatiske celler direkte konvertert til neurons, er en måte å få pasient-avledede neurons fra vev som er lett tilgjengelig. Gjennom denne ruten, kan modne nerveceller fås i løpet av noen uker. Her beskriver vi en enkel og rask ettrinns protokoll for å få tillegg fra dermal fibroblaster fra biopsi prøver fra voksen menneskelige givere. Vi forklare hvert trinn i prosessen, inkludert vedlikehold av dermal fibroblaster, frysing prosedyren for å bygge et lager av cellen linjen, såing av cellene omprogrammere, samt kultur betingelsene under konverteringen. I tillegg beskriver vi utarbeidelse av glass coverslips for elektrofysiologiske opptak langsiktige belegg vilkår og fluorescens aktivert celle sortering (FACS). Vi har også viser eksempler på resultatene forventes. Protokollen beskrevet her er enkel å utføre, og kan bli brukt til menneskelig fibroblaster avledet fra menneskelig hud biopsies fra pasienter med ulike ulike diagnoser og aldre. Denne protokollen genererer en tilstrekkelig mengde moduler som kan brukes til en rekke biomedisinsk programmer, inkludert sykdom modellering og narkotikarelaterte screening målet validering.
Introduction
Utviklingen av effektive behandlinger for nevrologiske lidelser blitt hemmet av begrenset tilgang til levende humane hjerneceller til å utføre mekanistisk studier og funksjonelle analyser. Om et tiår siden, denne situasjonen radikalt forandret med utviklingen av indusert pluripotent stamceller (iPSCs) teknologien1,2. Dette, kombinert med en bedre forståelse av nevrale differensiering mekanismer oppstått under normal menneskelig utvikling, har tillatt for generering av definerte og mangfoldig neuronal subtyper fra pasienten og sykdommen bestemte materiale. Med slikt materiale er det nå mulig å studere intracellulær mekanismene bak nevrologiske sykdommer og potensialet i ulike forbindelser å lindre disse patologisk funksjoner3.
Mens iPSCs har vært revolusjonerende feltet på nevrovitenskap, er en stor ulempe av disse cellene at deres aldrende signatur slettes under reprogramming prosessen slik at forynget Nevron ikke beholder sikkerhetsproblemet knyttet aldring4,5,6. Denne funksjonen av neurons som produseres kan ende opp som kritisk for recapitulating mange aspekter av intracellulær patogene kaskade, spesielt når det gjelder sykdommer som er en viktig risikofaktor.
Direkte neural omprogrammering er en teknologi hvor en somatisk cell omdannes direkte til en i uten å gå gjennom en pluripotent middels scenen. Dette gir rask generasjon av menneskelig nerveceller i vitro som kan være både pasienten og sykdommen bestemte. En bemerkelsesverdig karakteristisk for direkte omprogrammering er at start år giveren cellen opprettholdes, og med det, sin sårbarhet for aldring prosesser som økt produksjon av oksidativt stress4,7. Resultatet iNs fra pasienter med nevrologiske sykdommer knyttet til aldring, slik som Alzheimers og Parkinsons sykdom, er godt egnet for et bredt spekter av biomedisinsk programmer inkludert sykdom modellering, narkotikarelaterte screening analyser og toksikologi studier .
Den største innvendingen som har forhindret moduler fra pasienter med nevrodegenerative lidelser blir mye brukt er at de er ikke lett å omprogrammere, og dette blir enda vanskeligere med utvidelse av fibroblaster. Resultatet har generasjon i celler i mengder som kreves for disse typer programmer ikke blitt oppnådd inntil nylig8. Vi har nå utviklet en enkel metode for å omprogrammere fibroblaster fra givere i alle aldre på en svært effektiv måte. Denne metoden kombinerer tvunget uttrykk for neuronal transkripsjon faktorene Ascl1 og Brn2 med en knockdown av repressor protein RE1-stanse transkripsjon faktor (REST) bruker en enkelt vektor. Her beskriver vi de ulike trinnene fører til generering av moduler konverteres fra huden fibroblaster biopsied fra eldre givere.
Protocol
Voksen dermal fibroblaster var oppnådd fra Parkinsons sykdom forskning og Huntingtons sykdom klinikkene ved John van Geest Centre for hjernen reparasjon (Cambridge, UK) og brukes under lokal etisk godkjenning (REC 09/H0311/88). Om huden biopsi prøvetaking prosedyren, se referanse8.
1. forberedelse av huden fibroblaster omprogrammere
- Bruke en automatisert celle tining system eller en 37 ° C vannbad, tine de voksne menneskelig dermal fibroblaster (aHDFs) og plate 200.000 per MT75 kolbe (antall med en automatisert celle teller) i 10 mL av fibroblast medium (se tabell 1) på 37 ° C i 5% CO2.
- Utføre en fullstendig medium endring med fibroblast medium på neste dag.
- Endre fibroblast mediet hver 3-4 dager til cellene kommer 95% confluency.
Merk: En confluent kolbe inneholder ca 1 000 000 celler. AHDFs kan fryses for å bygge en aksje av cellen linje (inndeling 2) eller direkte re belagt klar omprogrammere (del 3).
2. frysing av huden fibroblaster
- Plassere en kontrollert hastighet frysing beholder i en boks med isen eller i kjøleskapet i 4 ° C.
- Distansere cellene med 0,05% trypsin (1,5 mL per MT75 kolbe) ved 37 ° C i 3-5 minutter.
- Legg fibroblast medium (inneholder fosterets bovin serum (FBS)) for å nøytralisere trypsin (3 mL per flush per MT75 kolbe) og samle frittliggende cellene i en 15 mL tube av skylle ut cellene i kolbe to ganger.
- Telle celler ved hjelp av automatiserte celle telleren; (anbefales) fryse aHDFs ca 500.000 per medisinglass.
- Nedspinning cellene på 400 x g i 5 min.
- Resuspend celle pellet i 1 mL av frysing medium (se tabell 1) og overføring til kryogene røret. Plassere rør direkte i beholderen kontrollert hastighet frysing.
- Lagre den kontrollert hastigheten frysing apparatet ved-80 ° C over natten. Dagen overføre rør til-140 ° C fryser og lagre inntil nødvendig.
3. plating omprogrammere (dag −1)
Merk: Det anbefales å bruke en gelatin belegg for kortsiktige eksperimenter (opptil 30 dager). Alternativt, for langsiktig eksperimenter anbefales det å begynne på en poly-L-ornithine, fibronectin og laminin (PFL) belegg.
- 60 minutter før plating aHDFs omprogrammere, coat en 24-vel plate med 0,1% gelatin (250 µL/vel) og ruge på 37 ° C.
- Sug opp fibroblast mediet på aHDFs. Vask en gang med DPBS. Distansere cellene med 0,05% trypsin (1,5 mL per MT75 kolbe) ved 37 ° C i 3-5 minutter.
- Legg fibroblast medium for å nøytralisere trypsin (3 mL per flush per MT75 kolbe) og samle frittliggende cellene i en 15 mL tube av skylle ut cellene i kolbe to ganger.
- Nedspinning cellene på 400 x g for 5 min. Forkast nedbryting og resuspend celle pellet i 1 mL av fibroblast medium.
- Telle celler med en automatisert celle teller (for å sikre en god kvalitet konvertering Kontroller at celle levedyktighet er over 90% med trypan blå flekker).
- For en komplett 24-vel-plate, kan du forberede en suspensjon av 1,320,000 celler i 13,2 mL fibroblast medium for å oppnå en suspensjon av 100.000 celler/mL av medium (eller 55.000 celler/godt i 550 µL av fibroblast medium multiplisert med antall brønner nødvendig).
- Sug opp gelatin fra platen og vask to ganger med DPBS. Legg til 500 µL av cellen suspensjon i hver brønn og ruge over natten på 37 ° C i 5% CO2.
4. viral signaltransduksjon (dag 0)
Merk: Arbeide med lentiviral partikler krever Kategori 2 utstyr og bruk av en agent å nøytralisere viruset. Bruk doble par hansker anbefales også sterkt.
- Varm opp 13,2 mL fibroblast middels til 37 ° C.
- Tine en lentiviral vektor inneholder transkripsjonsfaktorer Ascl1 og Brn2 med to kort hårnål RNAs (shRNA) målretting resten ved romtemperatur.
Merk: Se referanse til8; Konstruer er tilgjengelig i et plasmider oppbevaringssted. For informasjon om prosedyren for å produsere lentiviruses se referanse9. - Legge til den nødvendige mengden lentivirus å infisere aHDFs på mangfoldet av infeksjon (MOI) 20 medium uten noen signaltransduksjon enhancers.
- Erstatt medium i 24-vel plate med fibroblast medium som inneholder lentiviral vektor (500 µL/vel) og ruge over natten på 37 ° C i 5% CO2.
- Neste dag, erstatte mediet i brønnene med fersk fibroblast medium uten lentiviral vektoren.
Merk: Medium anses smittsomme i 7 dager og slik tilstrekkelig beskyttelse og håndteringsprosedyrer bør brukes i løpet av første uken etter viral signaltransduksjon.
5. vedlikehold konvertere cellene
Merk: Når konvertering begynner celler er utsatt for løfte; ta vare å tips platen og bruke en 1000 µL pipette når fjerne media å unngå celler frakobling.
- Dag 3, fjerne fibroblast mediet og legge til 500 µL av tidlig neuronal konvertering medium (se tabell 1).
- To til tre ganger i uken, ta ut 225 µL av gamle medium fra brønnen og tillegget 250 µL av fersk tidlig neuronal konvertering medium.
- På dag 18, fjerne alle av mediet fra hver brønn og erstatte med 500 µL av sen neuronal konvertering medium (se tabell 1).
- Fortsette å endre halvparten av mediet som ovenfor med sen neuronal konvertering mellom hver 2-3 dager til dag 25 eller eksperiment sluttpunkt (figur 1A).
Merk: Hvis celler ikke er belagt i hver brønn for eksperimentet, fylle tomme brønner med PBS eller vann for å hindre utilslørt fordampning av mediet og minimere variasjon mellom brønner.
| Lager konsentrasjon | Arbeider konsentrasjon | |
| Fibroblast medium | ||
| Basal medium | I/T | I/T |
| Penicillin/Streptomycin | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| FBS | I/T | 10% |
| Frysing medium | ||
| Fibroblast medium | I/T | 45% |
| FBS | I/T | 45% |
| DMSO | I/T | 10% |
| Tidlig neuronal konvertering medium (ENM) | ||
| Nevrale differensiering medium | I/T | I/T |
| Penicillin/Streptomycin | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| CHIR99021 | 10 mM | 2 ΜM |
| SB-431542 | 20 mM | 10 ΜM |
| Noggin | 100 µg/mL | 0,5 µg/mL |
| LDN-1931189 | 10 mM | 0,5 ΜM |
| VPA | 1 M | 1 mM |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg/mL | 10 ng/µL |
| DB-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| Sen neuronal konvertering medium (LNM) | ||
| Nevrale differensiering medium | I/T | I/T |
| Penicillin/Streptomycin | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg/mL | 10 ng/µL |
| DB-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| FACS Buffer | ||
| HBSS 1 x [- kalsium, magnesium, - fenol red] | I/T | I/T |
| BSA | I/T | 1% |
| DNAase | I/T | 0,05% |
Tabell 1: sammensetningen av ulike media brukes. Full beskrivelse av sammensetningen for alle medier trengs i denne protokollen inkludert fibroblast medium, frysing medium, tidlig neuronal konvertering medium, sent neuronal konvertering medium og FACS buffer.
6. Glass Coverslips elektrofysiologiske opptak
Merk: Det anbefales å ha en labfrakk, briller, doble hansker og fullføre alle arbeidet i avtrekksvifte. Denne protokollen er tilpasset fra 10.
- Plass glass coverslips på bunnen av et glass rett uten overlapping.
- Legge til generelle lab rengjøring vaskemiddel for å senke alle coverslips uten å risikere overflyt under risting (ca 30 mL). Plasser på en orbital shaker ved lav hastighet 2 h.
- Vask seks ganger (30 min hver) med autoklaveres deionisert vann.
- Legge til 95% etanol 2 h.
- Fjern etanol og vente til coverslips er tørr.
- Når tørre, overføre coverslips til et glass beaker og legge 70% salpetersyre til coverslips senkes.
- Plass glass begeret i et sonicator bad for 60 min.
- Fjerne salpetersyre og vask tre ganger med autoklaveres deionisert vann.
Forsiktig: Legge til syre til vann, aldri den andre veien rundt da dette kan føre til en voldsom reaksjon. - Fjerne så mye vann fra begeret som mulig og legge konsentrert saltsyre (HCI) til coverslips senkes; Swirl kanne og dekk med parafin film.
- Sonicate for 60 min (50-60 Hz, 30 W).
- Fjerne så mye HCI fra coverslips som mulig og sted i en passende søppelbøtten. Skyll med autoklaveres deionisert vann to ganger.
- Ta coverslips av panseret og skyll 20 ganger (eller mer) med autoklaveres deionisert vann til alle i HCI er fjernet.
- Når tørre, plassere coverslips i sterilt 24-og plater.
- Plass platene under ultrafiolett (UV) lys over natten. Neste dag i coverslips er klar til bruk.
Merk: Hvis glasset coverslips brukes, det anbefales å bruke PFL belegget. Bare plasser én dekkglassvæske i hver brønn av en 24-vel plate (med sterilt tang) og følger protokollen som nedenfor.
7. PFL belegg for langsiktig kultur
- Coat 24-vel platen med poly-L-ornithine (500 µL/vel) og la over natten på 37 ° C i 5% CO2.
- Sug opp poly-L-ornithine og vent til den er tørr nok til skjemaet dråper på toppen.
- Gjøre en dråpe (ca. 60 µL) laminin i midten av hver godt og spre for å dekke hele overflaten av dekkglassvæske. La for 2 h 45 min ved 37 ° C i 5% CO2.
- Vask tre ganger med DPBS.
- Legg til fibronectin (500 µL/vel) og la over natten på 37 ° C i 5% CO2.
- Vask en gang med DPBS før du legger til celler.
Merk: PFL belegget kan brukes for lang sikt kulturer ins (over 100 dager), selv om progressive celledød er å forvente fra dag 30.
8. FACS
Merk: Til nytt plate cellene etter FACS sortering forberede en PFL-belagt plate 48 timer på forhånd. Cellene kan sorteres bruker en neural celle vedheft molekyl (NCAM) antistoff fra dag 20 videre etter signaltransduksjon.
- Fjerne media med en 1000 µL pipette (ikke vask for å unngå cellene slås).
- Legge til celle dissociating agent (250 µL/vel), la i 10-20 min til celler Heis, og flyte som enkeltceller.
- Samtidig forberede FACS bufferen.
- Triturate forsiktig med en 1000 µL pipette. Hvis noen klumper forblir, ruge litt lenger.
- Når en enkeltcelle suspensjon er oppnådd, fjerne den fra brønnen og plasser i en 1,5 mL tube.
- Spyle ut brønnen to ganger med sen neuronal konvertering medium og sted i samme 1,5 mL rør.
- Nedspinning 400 x g i 5 min og kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 200 µL FACS bufferen.
- Nedspinning cellene på 400 x g i 5 min og kast nedbryting.
- Gjenta trinn 8,8 og 8,9 to ganger.
- Resuspend celle pellet i 50 µL FACS bufferen som inneholder menneskelige CD56 (NCAM) antistoffer i en konsentrasjon av 1:50 i 15 min på is. Beskytte mot lyset.
- Nedspinning cellene på 400 x g i 5 min.
- Resuspend 200 µL FACS buffer å vaske og Nedspinning cellene på 400 x g i 5 min.
- Gjenta trinn 8.13.
- Resuspend i 200 µL FACS bufferen som inneholder propidium iodide (PI, 10 µg/mL). Sortere NCAM positive (iNs) og PI negative (live) celler ved hjelp av FACS av gating basert på fluorescens intensitetsnivået for kontroll prøver som ikke er flekket med NCAM antistoffer eller PI.
- Samle NCAM positive cellene i et rør som inneholder sent neuronal konvertering medium.
- Telle celler med et automatisert celle counter og re plate cellene på en høy tetthet (50 000 celler/cm2) i sen neuronal konvertering medium i PFL belagt parabol.
- Fortsette å endre halvparten av mediet 2-3 ganger i uken med sen neuronal konvertering medium til eksperiment sluttpunktet (figur 1A).
Representative Results
En klar endring i celle morfologi skal være synlig fra dag 5 og utover (figur 1B). Noen celledød er å forvente etter viral transduction, men ikke åpenlyst. Fra hver brønn i en 24-vel plate bør en total-celle ytelse på 20.000-40.000 celler forventes dag 25, hvorav omtrent halvparten bør ha blitt neurons. Det er viktig å merke seg at avkastning og renhet kan variere over cellen linje og med sykdom stat og virus bunker.
Cellene vil uttrykke de fleste standard neuronal indikatorer inkludert MAP2 og TAU (figur 1 c) på dag 25 i tillegg viser en moden neuronal morfologi. Det er mulig å få en ren i befolkningen ved å gjøre FACS basert på markøren NCAM (se referanser8,11). Cellene kan deretter være enten re belagt på PFL trippel belegg (se referanse10) eller direkte fryses for biomolecular analyser.
Hvis cellene ikke er sortert, bør immunofluorescence merking med MAP2 eller TAU bli utført for å identifisere de konverterte cellene og co merket med protein av interesse.
Figur 1: utviklingen av i konvertering over tid. (A) tidslinje av eksperimentet og kart over Konstruer pakket i en lentivirus som brukes til å programmere de voksne menneskelig dermal fibroblaster. Hver svarte pilen representerer en middels endring. (B) representant fase kontrast bildene viser endringene i morfologi av celler under konverteringen mellom dag 0 til dag 22 (som angitt i øvre høyre hjørne av hvert panel). Bildene ble tatt på en fase kontrast mikroskop med 10 X målet. (C) Immunofluorescence bildet av et TAU og MAP2 dobbel flekker på dag 35 etter signaltransduksjon. Cellene ble løst i 4% paraformaldehyde og permeabilized med 0,1% Triton i DPBS for 10 min. celler ble blokkert i 30 min i en 5% serum løsning i DPBS. Antistoffer ble utvannet i blokkering løsning og brukt over natten på 4 ° C. Fluorophore-konjugerte sekundære antistoffer fortynnet i blokkering løsning og søkt om 2 h. celler var counterstained med DAPI i 15 min etterfulgt av 3 vasker med DPBS. Bildene ble tatt på en invertert fluorescens mikroskop med 20 X målet. Skalere barer = 100 µm (B, C). Forkortelser: ENM: tidlig neuronal medium; LNM: sent neuronal medium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne en-trinn/ett vektoren omprogrammering metoden gir en effektiv måte å få tillegg fra menneskelige voksne fibroblaster. Menneskelig voksen fibroblaster er vanligvis mye vanskeligere skjult enn fosterets fibroblaster, med begrenset studier tidligere rapportering effektiviteten av ca 5-10%12,13. Men med denne nye protokollen er det mulig å oppnå en neuronal avkastning (målt som MAP2 + celler) av ca 50%8. I tillegg kan våre protokollen brukes på dermal fibroblaster som har blitt passaged flere ganger uten å miste effektivitet for konvertering. Så langt har vi brukt celler passaged opp til 14 ganger uten oppdage noen nedgang i konvertering effektivitet. Også er det ingen forskjell i omprogrammering effektivitet i våre hender med fibroblaster fra givere alder mellom 52 og 87. Se referanse8mer om alder og sykdom i andre cellelinjer testet med denne konstruksjonen. Andre studier også rapportert ingen forskjell i konvertering effektivitet med en lentiviral-basert og små molekyl forbedret protokoll givere mellom 0 og 89 år4. Videre har konsekvent anvendbarhet med miRNA-baserte neuronal omprogrammering rapportert fibroblaster i alle aldre, med givere mellom 0 og 86 år7. Gjennom denne ruten, kan modne nerveceller skaffes på ca 12-15 uker i vitro eller ca 8 uker etter transplantasjon i vivo8. Dette er en fordel fordi det gir tilgang til begge to sykdommen og pasienten bestemte menneskelige moduler fra vev som er lett tilgjengelig. Selv om denne protokollen er effektivt, det vil ikke produsere en 100% neuronal avkastning, og som sådan en rensing trinnet bruker FACS for eksempel er nødvendig.
Det viktigste trinnet i denne protokollen er viral signaltransduksjon (protocol seksjon 4). Det er avgjørende at virus titer er presis, i tillegg til å ha belagt et nøyaktig antall aHDFs for konvertering. Den anbefalte titer for bruk med denne protokollen er mellom 4 x 10-8 og 4 x 109. Bruke en titer noe under 1 x 108 ville ikke anbefales som legger til store mengder virus vil være giftig for cellene. Videre, som fibroblaster begynner skjult til moduler de vil bli mer sårbar og utsatt for løfte. Det er viktig å være forsiktig når du endrer media for ikke å forstyrre cellene for mye. Dette kan gjøres ved å fjerne væske sakte med en 1000 µL pipette. Til slutt, når plating omprogrammere (protocol avsnitt 3) er det viktig å sikre en sunn fibroblast befolkning før du starter en eksperimentet. Dette angis med en celle levedyktigheten til over 90% med trypan blå flekker. AHDFs bør alltid være passaged før han nådde 95% confluency.
Hvis det er merkbar celledød før viral signaltransduksjon, ikke begynne konvertering: dobbeltsjekke at cellen levedyktighet er over 90%, og at det var ingen problemer med belegg av platen. Det er forventet å ha en liten mengde celledød etter viral signaltransduksjon, men dette bør ikke være betydelig. I dette tilfellet bekrefte nøyaktig såing av 50.000 aHDFs/godt og sjekk virus titer. Hvis det er merkbar inkonsekvens mellom brønner under konverteringen, sjekk først at hver brønn inneholder en lik mengde media og utilslørt fordampning skjer ikke på kantene (hvis nødvendig ekstra medier kan legges til kanten brønnene). Alternativt, sjekk trinn 4.4, og sikre riktig blanding for en homogen suspensjon når transducing. Det er viktig å legge til lentivirus til medium først, før du legger dette i brønnene. Direkte legge lentivirus til i brønnene vil øke godt til godt variasjon og er også sannsynlig å bli giftig til cellene. Til slutt, alltid sjekke at mediet er varmet 37 ° c før du legger til celler.
Denne protokollen inneholder valgfrie inndelinger for belegg forhold for lang sikt kultur iNs og FACS sortering for å øke neuronal renhet. For eksperimenter som ønsker å undersøke funksjonell karakteristikk av moduler, har en protokoll for utarbeidelse av glass coverslips for elektrofysiologi også blitt inkludert. Konvertering protokollen her er konfigurert for bruk med en 24-vel plate; Hvis dette kan endres til en 6 - 12-, 48-, 96-brønns tallerken eller flasker. I dette tilfellet Juster alle volumer til arealet av plate eller kolbe utnyttet.
Denne protokollen bruker tvunget uttrykk for Ascl1 og Brn2 i kombinasjon med en resten knockdown alle pakket i én enkelt vektor8 for å generere in på en pan-nevrale fenotypen. Generering av noen glial subtyper med denne metoden, men har ikke blitt vurdert. Denne metoden må dermed bli endret for bruk med andre reprogramming faktorer å få undertype bestemt neurons. Direkte omprogrammering har tidligere vist muligheten til å generere motor neurons, sensoriske neurons, fotoreseptorer, striatal middels spiny nevroner og dopaminergic neurons10,14. Dette vil være gunstig når undersøke nevrologiske sykdommer som bestemte neuronal undertype påvirkes fortrinnsvis, for eksempel Parkinsons sykdom og dopaminergic neurons.
Inntil ganske nylig, direkte neural omprogrammering teknologi tillot ikke for produksjon av moduler på en standardisert og effektiv måte, til et nivå som kreves for toksikologi og narkotikarelaterte screening analyser i stor skala. Denne nye metoden er svært effektiv og kan brukes på fibroblaster som har blitt passaged mange ganger, slik at det nå fjerner disse restriksjonene og åpner opp for en rekke studier, ikke bare i et menneskelig nevrale system, men også i et system som kan være tålmodig bestemt. Enkelheten i denne tilnærmingen gjør i teknologien tilgjengelig for alle grupper som ønsker å utføre lignende studier in-house og kan enkelt brukes ikke bare til storskala biomedisinsk programmer, for eksempel narkotikarelaterte screening og toksikologiske analyser, men også å støtte dataene stammer fra dyr modeller og menneskelige post mortem vevsprøver.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Marie Persson Vejgården for teknisk assistanse. Forskningen førte til disse resultatene har mottatt finansiering fra New York stamcelleforskningen Foundation, europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram: FP/2007-2013 Nevro stamcelleforskningen reparasjon (nr. 602278) og ERC Grant avtalen ingen. 30971, den svenske Research Council (gi avtale 521-2012-5624, 2016-00873 og 70862601 / Bagadilico), svensk Parkinson Foundation (Parkinsonfonden) og strategisk forskningsområdet Lund universitet Multipark (tverrfaglig forskning i Parkinsons sykdom). Janelle Drouin-Ouellet støttes av en kanadisk institutter for helse forskning (CIHR) fellowship (#358492), og Roger Barker støttes av en NIHR biomedisinsk forskningssenter tilskudd til den universitet av Cambridge/Addenbrooke's Hospital. Malin Parmar er en New York stamcelleforskningen Foundation Robertson etterforsker. Shelby Shrigley er finansiert av EU horisonten 2020 programmet (H2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Sklodowska-Curie nyskapende treningsnettverk og Grant avtalen nr. 676408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
| Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
| Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
| Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
| Milli-Q Water | Millipore | ||
| Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
| Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
| Neural differentiation medium - NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
| LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
| NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
| db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
| LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
| Reagents for Coatings | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
| Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
| Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
| DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
| Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
| Reagents for Glass Coverslips | |||
| Autoclaved deionized water | |||
| Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
| Ethanol 95% | |||
| Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
| Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
| Reagents for Immunocytochemistry | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
| Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
| Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
| Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| Equipment | |||
| T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
| 1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
| 15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
| Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
| Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
| Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL. | ||
| Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
| Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
| Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
| Parafilm M | VWR | ||
| ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
| CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
| Laminar flow hood | |||
| Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
| Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
| Orbital shaker | |||
| Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
| FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, 170-182 (2016).
- Mertens, J., et al. Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects. Cell Stem Cell. 17, 705-718 (2015).
- Hashizume, O., et al. Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects. Sci Rep. 5, 10434 (2015).
- Lapasset, L., et al. Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state. Genes Dev. 25, 2248-2253 (2011).
- Huh, C. J., et al. Maintenance of age in human neurons generated by microRNA-based neuronal conversion of fibroblasts. Elife. 5, (2016).
- Drouin-Ouellet, J., et al. REST suppression mediates neural conversion of adult human fibroblasts via microRNA-dependent and -independent pathways. EMBO Mol Med. , (2017).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Richner, M., Victor, M. B., Liu, Y., Abernathy, D., Yoo, A. S. MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons. Nat Protoc. 10, 1543-1555 (2015).
- Lau, S., Rylander Ottosson, D., Jakobsson, J., Parmar, M. Direct neural conversion from human fibroblasts using self-regulating and nonintegrating viral vectors. Cell Rep. 9, 1673-1680 (2014).
- Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts. Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).
- Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Masserdotti, G., Gascón, S., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: learning from and for development. Development. 143, 2494-2510 (2016).
- Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain. Sci Rep. 4, 6330 (2014).
