Summary
Reprogrammation neuronale directe génère des neurones qui maintiennent l’âge de la cellule somatique départ. Nous décrivons ici une méthode basée sur un vecteur unique pour générer des neurones induites de fibroblastes dermiques provenant de donneurs humains adultes.
Abstract
Les neurones induits (iNs), le produit des cellules somatiques directement converti en neurones, sont un moyen d’obtenir des neurones patient dérivé de tissu qui est facilement accessible. Grâce à cette route, les neurones matures peuvent être obtenus en l’espace de quelques semaines. Nous décrivons ici un protocole simple et rapide en une seule étape pour obtenir l’iNs de fibroblastes dermiques obtenues par biopsies de donneurs humains adultes. Nous expliquer chaque étape du processus, y compris l’entretien des fibroblastes dermiques, la procédure de congélation pour construire un stock d’une lignée cellulaire, ensemencement des cellules pour la reprogrammation, ainsi que les conditions de culture au cours du processus de conversion. En outre, nous décrivons la préparation du couvre-objet en verre pour des enregistrements électrophysiologiques, les conditions de revêtement à long terme et cellule à fluorescence activé triant (FACS). Nous illustrons également des exemples des résultats à attendre. Le protocole décrit ici est facile à réaliser et peuvent être appliquée à l’humain fibroblastes dérivés de biopsies de la peau humaine de patients atteints de divers différents Diagnostics et âges. Ce protocole génère une quantité suffisante de l’iNs, qui peut être utilisé pour un large éventail d’applications biomédicales, y compris la modélisation de maladies, dépistage des drogues et la validation de la cible.
Introduction
Mise au point de traitements efficaces pour les troubles neurologiques ont été entravés par l’accès limité aux cellules du cerveau humain vivant pour effectuer des études mécanistes et essais fonctionnels. Il y a une dizaine d’années, cette situation a radicalement changé avec le développement de cellules souches (CISP) de pluripotentes induites technologie1,2. Ceci, combiné avec une meilleure compréhension des mécanismes de différenciation neurale qui se produisent au cours du développement humain normal, a permis pour la génération de défini et divers sous-types neuronales du patient et la maladie de matériel spécifique. Avec ce matériel, il est maintenant possible d’étudier les mécanismes intracellulaires qui sous-tendent les maladies neurologiques et le potentiel des différents composés pour soulager ces pathologies3.
Bien que CISP révolutionnaire dans le domaine des neurosciences, un inconvénient majeur de ces cellules est que leur signature de vieillissement est effacée au cours du processus de reprogrammation de telle manière que le neurone rajeuni ne conserve pas la vulnérabilité associée le vieillissement de4,5,6. Cette particularité des neurones qui sont produites peut-être finir par être critique pour reprenant de nombreux aspects de la cascade de pathogène intracellulaire, notamment dans le cas de maladies pour lesquelles la vieillesse est un facteur de risque important.
Direct reprogrammation neuronale est une technologie où une cellule somatique est directement transformée en un dans sans passer par un pluripotentes intermédiaire étape. Cela permet une génération rapide de neurones humains in vitro qui peut être patient et spécifique de la maladie. Une caractéristique remarquable de reprogrammation directe est que l’âge de début de la cellule du donneur soit maintenu, et avec cela, sa vulnérabilité au vieillissement processus comme une production accrue de stress oxydatif4,7. Ainsi, iNs de patients atteints de maladies neurologiques associées avec le vieillissement, telles que Alzheimer et de Parkinson, sont bien adaptés pour un large éventail d’applications biomédicales, y compris la maladie de modélisation, drogue, dépistage des essais et des études de toxicologie .
La principale mise en garde qui a empêché l’iNs provenant de patients souffrant de troubles neurodégénératifs étant couramment utilisées est qu’ils ne sont pas faciles à reprogrammer, et cela devient encore plus difficile avec l’expansion des fibroblastes. Ainsi, la génération de cellules dans les quantités requises pour ces types d’applications n’a pas été atteint jusqu'à récemment8. Nous avons développé une méthode simple pour reprogrammer les fibroblastes provenant de donneurs de n’importe quel âge de manière très efficace. Cette méthode combine l’expression forcée des facteurs de transcription neuronale Ascl1 et Brn2 avec une précipitation le répresseur protéine RE1-baffle du facteur de transcription (repos) en utilisant un vecteur unique. Nous décrivons ici les différentes étapes conduisant à la génération des iNs converti à partir de fibroblastes de peau biopsiés provenant de donneurs âgés.
Protocol
Fibroblastes dermiques adultes ont été tirées des recherche de la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington cliniques au Centre John van Geest pour réparation du cerveau (Cambridge, UK) et servent sous approbation éthique locale (REC 09/H0311/88). Pour plus d’informations sur la procédure d’échantillonnage biopsie de peau, voir référence8.
1. préparation des fibroblastes de la peau pour la reprogrammation
- À l’aide d’une cellule automatisée dégel système ou un bain-marie à 37 ° C, décongeler les fibroblastes dermiques humains adultes (aHDFs) et blanc sur plaque de 200 000 par T75 flacon (comte avec un compteur de cellules automatisées) dans 10 mL de milieu de fibroblastes (voir tableau 1) à 37 ° C à 5 % de CO2.
- Effectuer un changement de moyen complet avec support de fibroblastes sur le lendemain.
- Changer le support de fibroblastes tous les 3 – 4 jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence de 95 %.
Remarque : Une fiole confluente contiendra environ 1 000 000 cellules. L’aHDFs peut être figé pour construire un stock d’une lignée cellulaire (section 2) ou un prêt directement re-plaqué de reprogrammation (section 3).
2. gel des fibroblastes de la peau
- Placer un récipient de congélation contrôlée-taux dans une boîte avec de la glace ou au réfrigérateur à 4 ° C.
- Dissocier les cellules avec 0,05 % de trypsine (1,5 mL par flacon T75) à 37 ° C pendant 3 à 5 min.
- Ajouter milieu de fibroblastes (contenant du sérum fœtal (SVF)) pour neutraliser la trypsine (3 mL par chasse par flacon T75) et recueillir les cellules individuelles dans un tube de 15 mL de débusquer les cellules dans le ballon deux fois.
- Compter les cellules à l’aide du compteur de cellules automatisées ; gel (recommandée) environ 500 000 aHDFs par flacon.
- Tournez en bas les cellules à 400 x g pendant 5 min.
- Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu de congélation (voir tableau 1) et le transfert dans le tube cryogénique. Placer les tubes directement dans le récipient de congélation contrôlée-taux.
- Stocker la vitesse contrôlée gel appareil à-80 ° C durant la nuit. Le lendemain, les tubes de transfert à un congélateur à-140 ° C et stocker jusqu'à ce que nécessaire.
3. placage de reprogrammation (jour −1)
Remarque : Il est recommandé d’utiliser une couche de gélatine pour des expériences de courte durée (jusqu'à 30 jours) ; Alternativement, pour des expériences à long terme, il est recommandé de commencer sur les poly-L-ornithine, fibronectine et laminine (PFL) revêtement.
- 60 min avant le placage du aHDFs pour la reprogrammation, recouvrir une plaque 24 puits avec 0,1 % de gélatine (250 µL/puits) et incuber à 37 ° C.
- Aspirez le milieu des fibroblastes sur l’aHDFs. Laver une fois avec le SPD. Dissocier les cellules avec 0,05 % de trypsine (1,5 mL par flacon T75) à 37 ° C pendant 3 à 5 min.
- Ajouter moyen de fibroblastes pour neutraliser la trypsine (3 mL par chasse par flacon T75) et recueillir les cellules individuelles dans un tube de 15 mL de débusquer les cellules dans le ballon deux fois.
- Tournez en bas les cellules à 400 g pendant 5 min. jetez surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de milieu de fibroblastes.
- Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (pour assurer un contrôle de conversion de bonne qualité que la viabilité des cellules est supérieur à 90 % avec le bleu trypan Coloration).
- Pour une plaque complète de 24 puits, préparer une suspension de 1 320 000 cellules 13,2 mL de milieu de fibroblastes pour obtenir une suspension de 100 000 cellules/mL de milieu (ou 55 000 cellules/puits dans 550 µL de milieu de fibroblastes multiplié par le nombre de puits nécessaires).
- Aspirer la gélatine de la plaque et laver deux fois avec le SPD. Ajouter 500 µL de la suspension cellulaire dans chaque puits et incuber une nuit à 37 ° C à 5 % de CO2.
4. virale Transduction (jour 0)
Remarque : Le travail avec Particules Lentivirales nécessite le matériel de catégorie 2 et de l’utilisation d’un agent à neutraliser le virus. Port doubles paires de gants est fortement recommandé.
- Chaude jusqu'à 13,2 mL de milieu de fibroblastes à 37 ° C.
- Décongeler un vecteur lentiviral contenant les facteurs de transcription, Ascl1 et Brn2 avec deux courtes hairpin RNAs (shARN) ciblage reste à température ambiante.
Remarque : Se référer pour faire référence à8; la construction est disponible dans un dépôt de plasmide. Pour plus d’informations sur la procédure pour produire des lentivirus veuillez consulter référence9. - Ajouter la quantité nécessaire de lentivirus à infecter l’aHDFs à la multiplicité d’infection (MOI) du 20 au milieu sans exhausteurs de transduction.
- Remplacer le milieu de la plaque 24 puits avec support de fibroblastes contenant le vecteur lentiviral (500 µL/puits) et incuber une nuit à 37 ° C à 5 % de CO2.
- Le lendemain, remplacer le support dans les puits avec support de fibroblastes frais sans le vecteur lentiviral.
NOTE : Le support est considéré comme infectieux pendant 7 jours et à ce titre, une protection adéquate et des procédures de traitement doivent être utilisés pendant la première semaine suivant la transduction virale.
5. entretien des conversion des cellules
Remarque : Une fois la conversion commence les cellules sont susceptibles d’être levée ; Prenez soin d’inclinez la plaque vers le haut et utiliser une pipette µL 1 000 quand supprimant media pour éviter les cellules détacher.
- Le jour 3, retirez le support de fibroblastes et ajouter 500 µL de milieu de conversion neuronale précoce (voir tableau 1).
- Deux à trois fois par semaine, retirer 225 µL de vieux moyen du puits et composant logiciel enfichable 250 µL de milieu frais de conversion neuronale précoce.
- Jour 18, enlever tous le milieu de chaque puits et remplacer avec 500 µL de milieu fin de conversion neuronale (voir tableau 1).
- Continuer à la moitié du milieu comme ci-dessus avec retard moyen de conversion neuronale changer tous les 2 – 3 jours jusqu’au jour 25 ou de point de terminaison experiment (Figure 1 a).
Remarque : Si les cellules ne sont pas plaqués dans chaque puits pour l’expérience, remplir le puits vides avec PBS ou eau pour empêcher l’évaporation manifeste du milieu et de minimiser les variations entre les puits.
| Concentration de stock | Travail de Concentration | |
| Moyen de fibroblastes | ||
| Milieu de base | N/A | N/A |
| La pénicilline/streptomycine | 10 000 U/mL | 100 mg/mL |
| FBS | N/A | 10 % |
| Point de congélation moyen | ||
| Moyen de fibroblastes | N/A | 45 % |
| FBS | N/A | 45 % |
| DMSO | N/A | 10 % |
| Moyen de conversion neuronale précoce (ENM) | ||
| Moyen de différenciation neurale | N/A | N/A |
| La pénicilline/streptomycine | 10 000 U/mL | 100 mg/mL |
| CHIR99021 | 10 mM | 2 ΜM |
| SB-431542 | 20 mM | 10 ΜM |
| Caboche | 100 µg/mL | 0,5 µg/mL |
| LDN-1931189 | 10 mM | 0,5 ΜM |
| APV | 1 M | 1 mM |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg/mL | 10 ng/µL |
| DB-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| Retard moyen de conversion neuronale (LNM) | ||
| Moyen de différenciation neurale | N/A | N/A |
| La pénicilline/streptomycine | 10 000 U/mL | 100 mg/mL |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg/mL | 10 ng/µL |
| DB-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| Tampon de FACS | ||
| HBSS 1 x [- calcium, magnésium, - rouge de phénol] | N/A | N/A |
| BSA | N/A | 1 % |
| DNAase | N/A | 0.05 % |
Tableau 1 : Composition des différents médias utilisés. Description complète de la composition pour tous les supports nécessaires dans le présent protocole, y compris les moyennes des fibroblastes, congélation moyen, moyen de conversion neuronale précoce, tardive conversion neuronale moyen et tampon de FACS.
6. verre couvre-objet pour les enregistrements électrophysiologiques
Remarque : Il est recommandé de porter une blouse, lunettes, double gants et terminer tous les travaux dans une hotte de laboratoire. Ce protocole est adapté à partir de 10.
- Placez les lamelles de verre au fond d’un plat en verre sans chevauchement.
- Ajouter lab général nettoyage détergent pour submerger tous les lamelles sans risquer de trop plein au cours de l’agitation (environ 30 mL). Placer sur un agitateur orbital à vitesse lente pendant 2 h.
- Lavez six fois (30 min chacun) avec de l’eau désionisée autoclavé.
- Ajouter de l’éthanol à 95 % pendant 2 h.
- Enlever l’éthanol et attendre jusqu'à ce que les lamelles soient secs.
- Une fois sec, transférer les lamelles dans un bécher en verre et ajouter 70 % d’acide nitrique, jusqu'à ce que les lamelles soient submergés.
- Placer le bécher en verre dans un bain sonicateur pendant 60 min.
- Retirer l’acide nitrique et laver trois fois avec de l’eau désionisée autoclavé.
ATTENTION : Toujours ajouter l’acide à l’eau, jamais l’inverse car cela peut entraîner une réaction violente. - Supprimer autant d’eau du bécher possible et ajouter l’acide chlorhydrique concentré (HCI) jusqu'à ce que les lamelles soient submergés ; agiter le bécher et couvrir avec le film de paraffine.
- Laisser agir pendant 60 min (50 – 60 Hz, 30 W).
- Enlever autant HCI à lamelles que possible et de la place dans une poubelle appropriée. Rincez à l’eau désionisée autoclavé deux fois.
- Prenez les lamelles sur le capot et rincer 20 fois (ou plus) avec de l’eau désionisée autoclavable jusqu'à ce que toute la HCI est supprimée.
- Une fois sec, placer les lamelles dans stériles plaques 24 puits.
- Placer les plaques sous les rayons ultraviolets (UV) lumière du jour au lendemain. Le lendemain, les lamelles sont prêts à l’emploi.
Remarque : Si le couvre-objet en verre est utilisés, il est recommandé d’utiliser l’enduit de PFL. Il suffit de placer une lamelle couvre-objet dans chaque puits d’une plaque de 24 puits (à l’aide de la pince stérile) et suivre le protocole ci-dessous.
7. PFL revêtement pour la Culture à Long terme
- Recouvrir la plaque 24 puits avec poly-L-ornithine (500 µL/puits) et laisser une nuit à 37 ° C à 5 % de CO2.
- Aspirer la poly-L-ornithine et attendez qu’il soit assez sèche pour former des gouttes sur le dessus.
- Faire une goutte (environ 60 µL) de laminine dans le centre de chaque bien et réparties pour couvrir toute la surface de la lamelle. Laissez pendant 2 h 45 min à 37 ° C à 5 % de CO2.
- Laver trois fois avec le SPD.
- Ajouter la fibronectine (500 µL/puits) et laisser une nuit à 37 ° C à 5 % de CO2.
- Laver une fois avec le SPD, avant d’ajouter les cellules.
Remarque : Le revêtement de la PFL peut être utilisé pour le long terme cultures des iNs (plus de 100 jours), bien que la mort cellulaire progressive doit être prévu de 30 jours.
8. FACS
Remarque : Pour re-plaque les cellules après FACS tri préparer une plaque de revêtement PFL 48 h à l’avance. Les cellules peuvent être triés à l’aide d’un anticorps de molécule (NCAM) adhérence de cellules neurales de jour 20 partir suite de transduction.
- Retirez le support avec une pipette 1 000 µL (ne pas laver pour éviter le détachement des cellules).
- Ajouter cellule dissociant agent (250 µL/puits), laisser pendant 10 à 20 min jusqu'à la levée de cellules et le flotteur en cellules individuelles.
- Pendant ce temps préparer le tampon de FACS.
- Triturer doucement avec une pipette 1 000 µL. Si quelques massifs restent, Incuber un peu plus.
- Après avoir obtenu une suspension monocellulaire, retirez-le du puits et placer dans un tube de 1,5 mL.
- Débusquer le puits deux fois fin moyen de conversion neuronale et les placer dans le même tube de 1,5 mL.
- Tournez en bas à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 200 µL de tampon de FACS.
- Tournez en bas les cellules à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
- Répétez les étapes 8.8 et 8.9 deux fois.
- Resuspendre le culot dans 50 µL de tampon de FACS contenant des anticorps humain de CD56 (NCAM) à une concentration de 01:50 pendant 15 minutes sur la glace. Protéger de la lumière.
- Tournez en bas les cellules à 400 x g pendant 5 min.
- Resuspendre dans 200 µL de tampon de FACS pour laver et essorer les cellules à 400 g pendant 5 min.
- Répétez l’étape 8.13.
- Resuspendre dans 200 µL de tampon de FACS contenant de l’iodure de propidium (PI ; 10 µg/mL). Trier les NCAM positive (iNs) et les PI négatif () des cellules vivantes à l’aide de FACS de blocage basée sur le niveau d’intensité de fluorescence des échantillons témoins qui ne sont pas colorés avec les anticorps de la NCAM ou PI.
- Recueillir les cellules positives NCAM dans un tube contenant le support fin de conversion neuronale.
- Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisées et re-plaque les cellules à une densité élevée (50 000 cellules/cm2) dans un milieu neuronal conversion tardive dans un plat recouvert de PFL.
- Continuent de changer la moitié de la moyenne 2 à 3 fois par semaine avec moyen de conversion neuronale fin jusqu'à ce que le point de terminaison experiment (Figure 1 a).
Representative Results
Un net changement dans la morphologie cellulaire doit être visible de jour 5 partir (Figure 1 b). La mort de certaines cellules est à prévoir après la transduction virale, bien que pas ouvertement. Chaque puits dans une plaque 24 puits un rendement cellulaire totale de 20 000-40 000 cellules devrait avoir par jour 25, dont environ la moitié soient devenues des neurones. Il est important de noter que le rendement et la pureté peuvent varier à travers la lignée cellulaire, ainsi qu’avec des lots d’État et le virus de la maladie.
Les cellules vont exprimer la plupart des marqueurs neurones y compris MAP2 et TAU (Figure 1) à 25 jours en plus d’exposer une morphologie neuronale mature. Il est possible d’obtenir une pure dans la population en faisant FACS basée sur le marqueur de la NCAM (voir référence8,11). Cellules peuvent ensuite être soit re-plaqués sur les triple couche PFL (voir référence10) ou directement congelé pour analyse biomoléculaire.
Si les cellules ne sont pas triés, immunofluorescence labeling avec MAP2 ou TAU devrait être effectuée pour identifier les cellules avec succès convertis et co marqué à la protéine d’intérêt.
Figure 1 : Evolution de la conversion au fil du temps. (A) la chronologie de l’expérience et la carte de la construction, emballée dans un lentivirus permettant de reprogrammer les fibroblastes dermiques humains adultes. Chaque flèche noire représente un changement médiatique. (B) phase représentative contraste des images illustrant les changements dans la morphologie des cellules au cours du processus de conversion entre jour 0 au jour 22 (tel qu’indiqué dans le coin supérieur droit de chaque panneau). Des images ont été prises sur un microscope à contraste de phase en utilisant l’objectif 10 X. (C) image Immunofluorescence d’un TAU et MAP2 double coloration à transduction après jour 35. Les cellules ont été fixés à 4 % de paraformaldéhyde et perméabilisées avec 0,1 % Triton au SPD pour 10 min. de cellules ont été bloqués pendant 30 min dans une solution de 5 % de sérum dans le SPD. Les anticorps ont été dilués en bloquant la solution et appliquées pendant la nuit à 4 ° C. Anticorps secondaires conjugué à un fluorophore ont été dilués en bloquant la solution et appliquées pour 2 h. cellules étaient Eosine au DAPI pendant 15 min, suivie de 3 lavages avec SPD. Des images ont été prises sur un microscope à fluorescence inversé en utilisant l’objectif 20 X. Barreaux de l’échelle = 100 µm (B, C). Abréviations : ENM : début moyenne neuronale ; LNM : fin moyen neuronale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ce vecteur d’une step/un reprogrammation méthode fournit un moyen efficace d’obtenir des iNs de fibroblastes adultes humains. Les fibroblastes humains adultes sont normalement beaucoup plus difficiles sur cachée que les fibroblastes foetales, avec des études limitées auparavant rapports efficacité d’environ 5-10 %12,13. Cependant, avec ce nouveau protocole, il est possible d’atteindre un rendement neuronal (mesuré en cellules MAP2 +) d’environ 50 %8. En outre, notre protocole peut être utilisé sur des fibroblastes dermiques qui ont été repiquées plusieurs fois sans perdre l’efficacité de la conversion. Jusqu’ici nous avons utilisé les cellules subcultures jusqu'à 14 fois sans détecter toute baisse de rendement de conversion. En outre, il n’y a aucune différence dans la reprogrammation de l’efficacité dans nos mains avec fibroblastes provenant de donneurs âgés entre 52 et 87. Pour plus de détails sur l’âge et la maladie des autres lignées cellulaires testées avec cette construction voir référence8. D’autres études n’ont également signalé aucune différence dans l’efficacité de la conversion en utilisant un protocole de molécule améliorée axée sur les gènes et les petit avec les donateurs entre 0 et 89 ans4. En outre, applicabilité uniforme avec miRNA-basé de reprogrammation neuronale a été signalée dans les fibroblastes de tous âges, avec des donateurs entre 0 et 86 ans7. Grâce à cette route, on trouvera des neurones matures dans environ 12 à 15 semaines in vitro , soit environ 8 semaines après la transplantation in vivo8. Ceci est avantageux car il permet d’accéder à la maladie et le patient spécifique humaine iNs de tissu qui est facilement accessible. Bien que ce protocole soit efficace, il ne produira pas un rendement de 100 % neuronale, et comme tel il faut une étape de purification à l’aide de FACS par exemple.
L’étape la plus importante au sein de ce protocole est transduction virale (protocole section 4). Il est crucial que le titre du virus est précis, en plus d’avoir plaqué un nombre précis d’aHDFs pour la conversion. Le titre recommandé pour une utilisation avec ce protocole est compris entre 4 x 10,8 et 4 x 109. À l’aide d’un titre de rien en dessous de 1 x 108 pas recommande que l’ajout de grandes quantités de virus sera toxiques pour les cellules. En outre, comme les fibroblastes commencent à covert pour les iNs, ils deviendront plus fragiles et sensibles à la levée. Il est essentiel d’être doux, lors du changement des médias afin de ne pas perturber les cellules trop. Cela peut être fait en enlevant le liquide lentement avec une pipette µL 1 000. Enfin, lors de l’électrodéposition de reprogrammation (protocole, article 3), il est important de s’assurer d’une population de fibroblastes en bonne santé avant de commencer une expérience ; Ceci est indiqué par une viabilité cellulaire de plus de 90 % avec une coloration bleu trypan. L’aHDFs doit toujours être repiquées avant d’atteindre 95 % confluence.
S’il y a la mort cellulaire notable avant la transduction virale, ne commencez pas de conversion : Vérifiez que la viabilité des cellules est supérieur à 90 % et qu’il n’y a aucun problème avec le revêtement de la plaque. Il est prévu d’avoir une petite quantité de mort cellulaire, transduction virale de suite, cependant, cela ne devrait pas être important. Dans ce cas, confirmer l’ensemencement exact de 50 000 aHDFs/puits et vérifier le titre de virus. S’il y a incohérence notable entre les puits lors de la conversion, vérifiez d’abord que chaque puits contient une quantité égale de médias et évaporation manifeste ne se produit pas sur les bords (si médias supplémentaires nécessaires peuvent être ajoutés dans les puits de bord). Sinon, vérifier étape 4.4 et assurer un mélange approprié pour une suspension homogène lorsque transduction. Il est essentiel d’ajouter le lentivirus au milieu tout d’abord, avant d’ajouter ceci dans les puits. Ajouter directement des lentivirus dans les puits va augmenter la variabilité bien pour bien et est également susceptible d’être toxique pour les cellules. Enfin, vérifiez toujours que le milieu est chauffé à 37 ° C avant d’ajouter aux cellules.
Ce protocole comprend des sections facultatives pour les conditions de revêtement pour long terme culture des iNs et des FACS Trier pour augmenter la pureté neuronale. Pour des expériences souhaitant étudier la caractérisation fonctionnelle de l’iNs, un protocole pour la préparation de lamelles de verre pour l’électrophysiologie a également été inclus. Le protocole de conversion ici est mis en place pour une utilisation avec une plaque 24 puits ; Si vous le souhaitez il peut être modifié pour un 6, 12, 48-, plaque à 96 puits ou flacons. Dans ce cas, s’il vous plaît ajuster tous les volumes à la surface de la plaque ou le ballon utilisé.
Ce protocole utilise l’expression forcée de Ascl1 et Brn2 en combinaison avec un knockdown reste tous emballés dans un unique vecteur8 pour générer des iNs d’un phénotype pan-neuronale. La génération de n’importe quel sous-types gliales avec cette méthode, cependant, n’a pas été évalué. Cette méthode devrait donc être modifié pour une utilisation avec d’autres facteurs de reprogrammation pour obtenir des neurones spécifiques de sous-type. Reprogrammation directe a déjà démontré la possibilité de générer des neurones moteurs, les neurones sensoriels, photorécepteurs, neurones épineux moyen striatales et dopaminergiques neurones10,14. Cela sera bénéfique lors d’enquêtes sur les maladies neurologiques dans quel sous-type neuronal spécifique sont préférentiellement touchés, pour exemple la maladie de Parkinson et les neurones dopaminergiques.
Jusqu'à très récemment, technologie reprogrammation neuronale directe ne permettait pas à la production de l’iNs de manière normalisée et efficace — à un niveau qui est nécessaire pour la toxicologie et des essais à grande échelle de dépistage de drogue. Cette nouvelle méthode est très efficace et peut être utilisée sur les fibroblastes qui ont été repiquées plusieurs fois, telle que maintenant, il supprime ces restrictions et s’ouvre pour une vaste gamme d’études, non seulement dans un système nerveux humain, mais aussi dans un système qui peut être patient spécifique. La simplicité de cette approche rend la technologie en accessible pour tous les groupes souhaitant effectuer des études similaires internes et peut être facilement utilisée non seulement pour des applications biomédicales à grande échelle, tels que le dépistage des drogues et des essais de toxicologie, mais aussi de soutenir données issues de modèles animaux et humains post-mortem des échantillons de tissus.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Marie Persson Vejgården d’assistance technique. La recherche ayant abouti à ces résultats a reçu un financement de la Fondation de cellules souches de New York, le Conseil européen de la recherche au titre du septième Programme-cadre de l’Union européenne : réparation de cellules souches Neuro FP/2007-2013 (no 602278) et de la Convention de subvention ERC pas. 30971, Conseil de recherche suédois (accord 521-2012-5624, 2016-00873 et 70862601 de Don / Bagadilico), Fondation suédoise de Parkinson (Parkinsonfonden) et la zone de recherche stratégique au Lund University Multipark (recherche multidisciplinaire en Maladie de Parkinson). Janelle Drouin-Ouellet est soutenu par une bourse des instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (#358492), et Roger Barker est soutenu par une subvention du Centre de recherches biomédicales NIHR à l’hôpital de l’Université de Cambridge/Addenbrooke s de. Malin Parmar est chercheur New York Stem Cell Fondation Robertson. Shelby Shrigley est financé par le Programme Union européenne Horizon 2020 (H2020-ACEM-ITN-2015) sous le réseau de formation innovante de Marie Skłodowska-Curie et Grant entente no 676408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
| Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
| Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
| Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
| Milli-Q Water | Millipore | ||
| Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
| Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
| Neural differentiation medium - NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
| LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
| NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
| db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
| LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
| Reagents for Coatings | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
| Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
| Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
| DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
| Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
| Reagents for Glass Coverslips | |||
| Autoclaved deionized water | |||
| Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
| Ethanol 95% | |||
| Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
| Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
| Reagents for Immunocytochemistry | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
| Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
| Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
| Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| Equipment | |||
| T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
| 1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
| 15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
| Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
| Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
| Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL. | ||
| Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
| Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
| Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
| Parafilm M | VWR | ||
| ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
| CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
| Laminar flow hood | |||
| Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
| Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
| Orbital shaker | |||
| Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
| FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |
References
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