Summary
直接神経細胞リプログラミングと、開始の体細胞の年齢を維持するニューロンが生成されます。ここでは、大人の人間のドナーから得られる皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞を生成する単一ベクトル ベースの方法をについて説明します。
Abstract
誘導ニューロン (iNs)、ニューロンに直接変換体細胞の製品は、簡単にアクセスできる組織から患者由来の神経細胞を取得する方法です。このルートを通じて成熟したニューロンは、数週間の問題で取得できます。ここでは、大人の人間のドナーから生検によって得られた真皮線維芽細胞からプラグインを取得するための簡単かつ迅速なワンステップ プロトコルについて述べる。我々 は皮膚の線維芽細胞株の株式を構築する凍結の手順の維持を含むプロセスの各ステップを説明する変換処理中に、プログラムし直すための細胞と培養条件の播種します。さらに、電気生理学的記録、長期コーティング条件、および蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えのためガラス coverslips の準備について述べる。また予想される結果の例を示します。ここで説明したプロトコルが容易に行えるし、できる人間に適用される線維芽細胞に由来する様々 な別の診断と年齢患者の皮膚生検。このプロトコルは、バイオメディカル、疾患モデル作製、薬物スクリーニング、ターゲットの検証などの広い配列を使用ことができる iNs の十分な量を生成します。
Introduction
神経疾患の効果的な治療法の開発は、解明および機能アッセイを実行する人間の脳細胞へのアクセスの制限によって妨げられています。一昔前は、このような状況は、根本的に誘導多能性幹細胞 (Ips) 技術1,2の開発に変更。普通の人間開発中に発生した神経分化メカニズムの理解を深めると共に、これは患者と疾患の特定材料から定義され、多様な神経細胞の生成を可能にします。そのような材料だ今神経疾患とそれらの病理学的特徴3を軽減するためにさまざまな化合物の潜在的な細胞内メカニズムを研究することが可能。
Ips は、神経科学の分野に革命的なされている、これらの細胞の 1 つの主要な欠点は若返ったニューロンが脆弱性に関連付けられているを保持しないことそのような方法でプログラムし直すプロセス中に、高齢化の署名を消去、4,5,6高齢化。生成されるニューロンのこの特定の機能は、老後が重要なリスク要因と、病気の場合は特に、細胞内病原性カスケードの多くの側面の概説のために重大であることを終わる可能性があります。
直接に体細胞を変換して直接技術は、神経のリプログラミングで、多能性を経由せず中間段階。これにより、急速な世代の人間ニューロンの in vitro患者と特定疾患の両方にすることができます。直接リプログラミングの顕著な特性の 1 つは、ドナー細胞の開始年齢を維持、老化の過程などへの脆弱性は酸化ストレス4,7の生産を増加します。その結果、神経疾患患者からアドインに関連付けられている高齢化など、アルツハイマー病やパーキンソン病、疾患モデリング、薬剤のスクリーニングの試金、及び毒性学を含む医療アプリケーションの広い範囲に適しています.
広く使用されている神経変性疾患患者からの iNs を妨げている主な注意点は、彼らを再プログラムする簡単ではありませんこれ繊維芽細胞の拡大をさらにもっと困難になることです。その結果、これらの種類のアプリケーションに必要な量のセルの世代ばかり8まで達成されていません。非常に効率的な方法であらゆる年齢層のドナーから線維芽細胞をプログラムし直すための簡単な方法を開発しました。このメソッドは、リプレッサー蛋白質 re1 トランスクリプション要因 (残り) 1 つのベクトルを使用してのノックダウンと神経細胞の転写因子Ascl1 Brn2の強制発現を兼ね備えています。ここでは、我々 は皮膚線維芽細胞高齢者ドナーから生検から変換アドインの世代につながる別の手順を説明します。
Protocol
成人皮膚線維芽細胞は脳修復 (ケンブリッジ、イギリス) のジョン ・ ヴァン ・ Geest センターで研究パーキンソン病やハンチントン病の診療所から得られ、ローカル倫理的な承認 (REC 09/H0311/88) の下で使用されます。皮膚生検の手順の詳細については、参照8を参照してください。
1. 皮膚線維芽細胞のプログラムし直すための準備
- システムまたは 37 ° C の水浴を融解自動セルを使用して、大人のひと皮膚繊維芽細胞 (aHDFs) を解凍し、線維芽細胞培地 10 mL に T75 フラスコ (自動化された細胞カウンターの数) あたりの 200,000 のプレート (表 1参照) で 5% CO237 ° C。
- 次の日に線維芽細胞培地で完全な中型の変更を実行します。
- 線維芽細胞培地ごとに 3-4 日、電池が 95% の confluency に達するまでを変更します。
注: 1 つの合流フラスコ約 1,000,000 セルが含まれます。細胞株 (セクション 2) の株式または (セクション 3) をプログラムし直すための直接再メッキの準備を構築する、aHDFs を固定できます。
2. 皮膚線維芽細胞の凍結
- 4 ° C で冷蔵庫、アイス ボックスに速度制御凍結コンテナーを配置します。
- 3-5 分の 37 ° C で 0.05% トリプシン (T75 フラスコあたり 1.5 mL) と細胞を切り離します。
- 線維芽細胞培地 (ウシ胎児血清 (FBS) を含む) トリプシン (T75 フラスコあたりフラッシュあたり 3 mL) を中和し、フラスコ内のセルを 2 回フラッシュで 15 mL チューブの剥離細胞を収集するを追加します。
- 自動化された細胞カウンターの値を使用してセルをカウントします。(推奨) の凍結バイアルあたり約 500,000 aHDFs。
- 5 分間 400 x g で細胞をスピンします。
- 凍結培地 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します (表 1参照) や極低温の管に転送。速度制御の冷凍コンテナーに直接チューブを配置します。
- -80 ° c の装置を一晩凍結制御率を格納します。次の日は-140 ° C のフリーザーにチューブを転送し、必要になるまでを格納します。
3. (日 − 1) をプログラムし直すためのめっき
短期的実験 (最大 30 日) にゼラチン コーティングを使用する勧めします注意。また、長期実験のためポリ L-オルニチン、フィブロネクチン、ラミニン (PFL) コーティングを開始する勧めします。
- ため、aHDFs をめっきする前に 60 分 0.1% ゼラチン (250 μ L/ウェル) で 24 ウェル プレートをコートし、37 ° c. で孵化させなさい
- 線維芽細胞、aHDFs 培地を吸引します。DPBS で一度洗います。3-5 分の 37 ° C で 0.05% トリプシン (T75 フラスコあたり 1.5 mL) と細胞を切り離します。
- トリプシン (T75 フラスコあたりフラッシュあたり 3 mL) を中和し、フラスコ内のセルを 2 回フラッシュで 15 mL チューブの剥離細胞を収集する線維芽細胞培地を追加します。
- スピン ・ ダウン 5 分破棄上清の 400 x g で細胞と線維芽細胞培地 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
- (染色トリパン ブルー色素の 90% 以上は細胞質の良い変換チェックできるように) 自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
- 完全な 24 ウェル プレート 1,320,000 13.2 mL 中の 100,000 セル/mL の懸濁液 (または 550 μ L 必要な井戸の数を掛けた線維芽細胞培地で細胞/ウェル 55,000) を達成するために線維芽細胞中の細胞の懸濁液を準備します。
- プレートからゼラチンを吸引し、DPBS で 2 回洗ってください。各ウェルに、細胞懸濁液 500 μ L を追加し、37 ° c 5% CO2で一晩インキュベートします。
4. ウイルス伝達 (0 日)
注: カテゴリ 2 装置およびウイルスを中和するためにエージェントが使用にレンチ ウイルス粒子の操作が必要です。ダブル ペア手袋の身に着けていることを強くお勧めします。
- ウォーム アップ 13.2 mL 37 ° c. に線維芽細胞中の
- 転写因子Ascl1 Brn2 2 つ短いヘアピン Rna (shRNA) を室温で残りをターゲットを含むレンチウイルスベクターを解凍します。
注:8; を参照を参照してください。プラスミドのリポジトリで利用可能です。レンチを生成する手順の詳細については9を参照を参照してください。 - 20 の任意の伝達の増強物のない媒体にレンチ ウイルス感染 (MOI) の多様性で aHDFs に感染するために必要な量を追加します。
- 線維芽細胞培レンチウイルスベクター (500 μ L/ウェル) 24 ウェル プレートの中に置き換えるし、5% CO2の 37 ° C で一晩インキュベートします。
- 次の日は、レンチウイルスベクターせず新鮮な線維芽細胞培地で井戸の中を置き換えます。
注: 媒体は感染 7 日間と次のウイルスの伝達の最初の週の間に十分な保護と処理手順の使用など。
5. 変換細胞の維持
注: 変換が開始されるとセルが持ち上げるに敏感プレートをチップアップし、1,000 μ L ピペットを使用してデタッチ細胞を避けるためにメディアを削除するときに注意してください。
- 3 日目、線維芽細胞培地を取り除き、早期神経変換中を 500 μ l 添加 (表 1参照)。
- 週に 2 ~ 3 回は 225 の井戸から古い媒体の μ L と新鮮な初期神経変換中の追加の 250 μ L を取る。
- 18 日に各ウェルから媒体をすべてを削除し、後半神経変換中の 500 μ L に置き換えます (表 1参照)。
- 後期神経変換中と上のとして媒体の半分の 25 日目または実験エンドポイント (図 1 a) まで 2-3 日を変更していきます。
注: セルは実験のためのすべてのよくないメッキパーツされた場合、は、媒体の明白な蒸発を防ぐため、井戸の間の変動を最小限に抑えるために、PBS または水で空井戸を記入します。
| ストック濃度 | 作業濃度 | |
| 線維芽細胞培地 | ||
| 基礎培地 | N/A | N/A |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 10,000 U/mL | 100 mg/mL |
| 政府短期証券 | N/A | 10% |
| 凍結中 | ||
| 線維芽細胞培地 | N/A | 45% |
| 政府短期証券 | N/A | 45% |
| DMSO | N/A | 10% |
| 初期神経変換中 (ENM) | ||
| 神経分化培地 | N/A | N/A |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 10,000 U/mL | 100 mg/mL |
| CHIR99021 | 10 mM | 2 Μ M |
| SB 431542 | 20 mM | 10 Μ M |
| 酒を飲むこと | 100 μ g/mL | 0.5 μ g/mL |
| LDN 1931189 | 10 mM | 0.5 Μ M |
| バルプロ酸 | 1 M | 1 mM |
| LM 22A4 | 20 mM | 2 Μ M |
| GDNF | 20 μ G/ml | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 μ G/ml | 10 ng/μ l |
| db キャンプ | 50 mM | 0.5 mM |
| 後期神経変換中 (LNM) | ||
| 神経分化培地 | N/A | N/A |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 10,000 U/mL | 100 mg/mL |
| LM 22A4 | 20 mM | 2 Μ M |
| GDNF | 20 μ G/ml | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 μ G/ml | 10 ng/μ l |
| db キャンプ | 50 mM | 0.5 mM |
| FACS バッファー | ||
| HBSS 1 x [- カルシウム、- マグネシウム - フェノールレッド] | N/A | N/A |
| BSA | N/A | 1% |
| DNAase | N/A | 0.05% |
表 1: 使用異なる培地の組成します。線維芽細胞培地を含む、媒体、初期神経変換中、後期の神経変換中、FACS バッファーを凍結このプロトコルで必要なすべてのメディア構成の完全な説明。
6. ガラス Coverslips 電気生理学的記録
注: 白衣、ゴーグルを着用、手袋をダブル、ヒューム フードの仕事のすべてを完了することをお勧めします。このプロトコルは10から適応です。
- 重複なしのガラス皿の底にガラス coverslips を配置します。
- 掃除用洗剤 (約 30 mL) を振動中に危険にさらすオーバーフローなし coverslips のすべてが水没する一般的なラボを追加します。2 h の遅い速度で軌道シェーカーの上に置きます。
- 脱イオン水をオートクレーブで 6 回 (各 30 分) を洗ってください。
- 95% のエタノールの 2 h を追加します。
- エタノールを取り外して coverslips が乾くまで待ちます。
- 一度乾燥、ガラス ビーカー、coverslips に転送し、coverslips が水中に沈むまでに 70% の硝酸を追加します。
- 60 分間の超音波発生装置浴にガラス ビーカーを配置します。
- 硝酸を取り外してオートクレーブ脱イオン水にて 3 回洗浄します。
注意: は、暴力的な反応につながるよう常に酸と水、周りの他の方法ではないに追加します。 - できるだけビーカーから同様に多くの水を削除し、coverslips が水中に沈む; まで濃塩酸 (塩酸) を追加ビーカーとパラフィン フィルムでカバーを旋回します。
- 60 分間超音波 (50-60 Hz、30 W)。
- 可能であり、場所として coverslips から適切なゴミ箱に限り HCI を削除します。2 回オートクレーブ脱イオン水ですすいでください。
- フードから coverslips を取り出して、HCI のすべてが削除されるまで、20 回 (またはそれ以上) に脱イオン水をオートクレーブですすいでください。
- 一度乾燥、滅菌 24 ウェル プレート coverslips に配置。
- Uv (紫外線) を受ける板を配置一晩光。次の日、coverslips を使用する準備ができています。
注: ガラス coverslips が使用されている場合は、PFL コーティングを使用する推奨です。単純に (滅菌鉗子を使用して) 24 ウェル プレートの各ウェルに 1 つ coverslip を配置し、以下のプロトコルに従います。
7. PFL 長期的文化のコーティング
- ポリ-L-オルニチン (500 μ L/ウェル) と 24 ウェル プレートをコート、5% CO2の 37 ° C で一晩置いておきます。
- ポリ L-オルニチンを吸引し、フォーム滴上十分乾燥しているまで待ちます。
- ドロップ (約 60 μ L) それぞれの中心でラミニンのよくし、カバーガラスの表面全体をカバーを確認します。5% CO2の 37 ° C で 2 時間 45 分を残します。
- DPBS 3 回洗います。
- フィブロネクチン (500 μ L/ウェル) を追加し、37 ° c 5% CO2で一晩おきます。
- セルを追加する前に DPBS で一度洗う。
注: PFL コーティングは進歩的な細胞死は 30 日から予想されることですが、プラグイン (100 日以上) の長い言葉文化に使用できます。
8. FACS
注: 再 FACS 後細胞をプレートに並べ替え PFL コーティング プレート 48 h で事前準備します。細胞は伝達次以降 20 日目から神経細胞接着分子 NCAM 抗体を使用して並べ替えることができます。
- 1,000 μ L ピペットでメディアを削除 (細胞分離を避けるためには洗浄しないでください)。
- 解離エージェント (250 μ L/ウェル) セルを追加、単一セルとして細胞リフトとフロートまで 10-20 分間おきます。
- この時間の間に FACS バッファーを準備します。
- 1,000 μ L ピペットで軽くカップを刻んだ。いくつかの塊が残っている場合はもう少し、インキュベートします。
- 単一細胞懸濁液を取得すると、井戸からそれを削除し、1.5 mL チューブに配置。
- 同じ 1.5 mL チューブに後期神経変換中と場所でうまく 2 回フラッシュします。
- 5 分間 400 x g でスピン ・ ダウンと上澄みを廃棄します。
- FACS バッファーを 200 μ l 添加の細胞ペレットを再懸濁します。
- スピン ・ ダウン 5 分 400 x g でセルと上澄みを廃棄します。
- 8.8、8.9 の手順を 2 回繰り返します。
- 1:50 15 分間氷の上の濃度でひと CD56 (NCAM) 抗体を含む FACS バッファーの 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。光から保護します。
- 5 分間 400 x g で細胞をスピンします。
- 200 μ L FACS バッファーを洗浄し、5 分の 400 x g で細胞をスピンで再懸濁します。
- 8.13 のステップを繰り返します。
- Propidium ヨウ化 (PI; 10 μ G/ml) を含む FACS バッファーの 200 μ L で再懸濁します。NCAM 正 (iNs) および PI 否定的な (ライブ) 細胞の FACS を用いたゲート NCAM 抗体または PI 染色しないコントロール サンプルの蛍光強度レベルに基づいて並べ替えます。
- 後期神経変換媒体を含んでいる管における NCAM の陽性細胞を収集します。
- PFL コーティング皿に後期神経変換中高密度 (50,000 セル/cm2) でセル自動化された細胞カウンターと再プレートを使用してセルをカウントします。
- 培地の半分に実験エンドポイント (図 1 a) まで後期神経変換中週 2-3 回を変更していきます。
Representative Results
細胞の形態の明確な変化が一日 5 以降 (図 1 b) から表示されます。いくつかの細胞の死はウイルス伝達後予想されるがあからさまにしません。24 ウェル プレートの各ウェルから 25、うち約半分はニューロンをなっているはずの日で 20,000-40,000 セルの合計セル収量を期待すべき。細胞間でだけでなく、病気の状態とウイルスのバッチと収量、純度が異なることに注意することが重要です。
細胞は、成熟した神経細胞形態の展示に加えて、25 日 MAP2 とタウ (図 1) を含む最も標準的な神経細胞マーカーを表明します。NCAM マーカーに基づく FACS により純粋な人口を得ることは可能です (を参照してください8,11を参照)。細胞その後めっきすることがどちらか再 PFL トリプル コーティングに (参照10参照) または直接生体分子解析用冷凍します。
セルが並べ替えられていない場合蛍光ラベリング MAP2 とタウが正常に変換されたセルを識別するために実行されますでされ、共同ラベル興味の蛋白質。
図 1: 時系列の変換の進化します。(A) 実験と大人ひと真皮線維芽細胞をプログラムし直すためのレンチ ウイルスのパッケージ構築の地図の年表それぞれの黒い矢印は、中型の変更を表します。(B) 代表的な位相コントラストの画像 (各パネルの右上隅に示されている) として 22 日に 0 日間の変換処理中に細胞の形態の変化を描いたします。対物レンズ 10 倍を使用して位相差顕微鏡で撮影を行った。(C)、タウと MAP2 重染め色の 35 日後伝達で蛍光イメージ。セル 4% パラホルムアルデヒドで固定され、グリセリン 0.1 %10 分セルの DPBS でトリトン DPBS で 5% 血清溶液中 30 分間ブロックされていた。抗体がソリューションをブロックで薄くなり、4 ° C で一晩に適用蛍光標識二次抗体がソリューションをブロックで希釈し、2 h. セルされた 3 洗浄 DPBS と続く 15 分の DAPI で counterstained のための適用。画像は、20 × 対物を用いた倒立蛍光顕微鏡で撮影されました。スケール バー = 100 μ m (B、C)。略語: ENM: 初期神経媒体;LNM: 後期神経中。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
メソッドをプログラムし直すこの一ステップ/1 つのベクトルは、大人の線維芽細胞からプラグインを取得する効率的な方法を提供します。大人の線維芽細胞は、以前報告の約 5-1012,13効率限られた研究胎児線維芽細胞よりも隠密に通常はるかに困難。ただし、この新しいプロトコルでは、約 508神経の収量 (MAP2 + 細胞として測定) を達成するために不可能です。さらに、我々 のプロトコルは、変換効率を失うことがなく複数回を継が真皮の繊維芽細胞で使用できます。これまで変換効率の低下を検出することがなく最大 14 回の継代細胞を使用しています。また、52 と 87 歳のドナーから線維芽細胞と私たちの手で効率をリプログラミングに違いはありません。年齢や他の細胞をこのコンス トラクターを使用してテストの病気の詳細については、参照8を参照してください。他の研究はまた報告ない 0 から 89 年4ドナーとレンチ ウイルス ベースおよび小さい分子が強化されたプロトコルを使用して変換効率の違い。さらに、0 から 86 年間7間ドナーとのすべての年齢層の線維芽細胞神経細胞リプログラミングの miRNA ベースの一貫した適用を報告されています。このルートを通じて成熟したニューロンは約 12-15 週間生体外でまたは生体内移植8に続く約 8 週間で取得できます。それは病気と患者の双方にアクセスを与えるので、これは便利ですが簡単にアクセスできる組織から特定の人間を。このプロトコルは効率的、100% 神経収量を生成しないこと、例えば FACS を用いた浄化手順が必要なようです。
このプロトコルの中で最も重要なステップは、ウイルス伝達 (プロトコル セクション 4) です。ウイルス価は正確には、変換のための aHDFs の正確な数を持つメッキに加えてが重要です。このプロトコルで使用する推奨価は 4 × 108 ~ 4 × 10 の9です。1 x 10 の8の下に何の価を使用して大量のウイルスが細胞に有毒であるを追加する推奨されませんでしょう。また、繊維芽細胞を開始するプラグインに隠密はより壊れやすく、持ち上げやすいをなります。セルを十分すぎるほど邪魔をしないようにメディアを変更するときに優しくなることが欠かせません。これは、1,000 μ L ピペットをゆっくりと液体を削除することによって行うことができます。最後に、(プロトコル セクション 3) をプログラムし直すためにめっきするときは; 実験を開始する前に健康な線維芽細胞の人口を確保することが重要これは、トリパン ブルー染色で 90% 以上の細胞生存率で示されます。AHDFs は 95% の confluency に達する前に継代常にする必要があります。
ウイルス伝達の前に顕著な細胞死がある場合は、変換を開始しないでください: 細胞生存率が 90% 以上で、プレートのコーティングの問題がなかったことを再確認。それウイルス伝達の細胞死の少量が期待できる、ただし、これはいない重要なする必要があります。この場合、50,000 aHDFs/ウェルの正確な播種を確認し、ウイルス力価を確認します。変換中に井戸の間顕著な矛盾があると、まず各ウェルにメディアの同じ量が含まれていて、(存在する場合は、必要な余分なメディアは、エッジの井戸に追加できます) あからさまな蒸発が端で発生していないを確認します。または、4.4、ステップをチェックし、伝達するとき、均一な懸濁液の適切な混合を確実します。井戸にこれを追加する前に、まず、媒体に、レンチ ウイルスを追加することが重要です。井戸にレンチ ウイルスを直接追加する坑変動を増加する、また細胞に有害である可能性が高い。最後に、媒体は 37 ° c のセルに追加する前に温めて、常にチェックします。
このプロトコルには、iNs と神経細胞の純度を高めるため並べ替え FACS の長い言葉の文化の塗装条件について省略可能セクションが含まれています。アドインの機能特性を調査する希望の実験用ガラス coverslips の電気生理学のための準備のためのプロトコルも含まれています。ここで変換プロトコルが設定されている、24 ウェル プレートでの使用これは 6-、12-、48 - 変更することができます希望する場合 96 ウェル プレートやフラスコ。この場合、プレートや活用フラスコの表面領域にすべてのボリュームを調整してください。
このプロトコルはパン神経の表現型のプラグインを生成するのに残り打撃との組み合わせでAscl1とBrn2強制式をすべてのパッケージ化された 1 つ 1 つのベクトル8 を使用します。この方法では、任意のグリア細胞のサブタイプの発生ただしが評価されていません。このメソッドはこうしてサブタイプの特定のニューロンを取得するその他の初期化因子で使用するために変更する必要があります。直接リプログラミング以前運動ニューロン、ニューロン、視細胞、線条体中型のとげだらけニューロン、ドーパミン作動性ニューロンの10、14を生成する可能性を示しています。どの特定の神経細胞サブタイプが優先的に影響を受けるで、例パーキンソン病とドーパミン作動性ニューロンの神経疾患を調査する場合に有益になります。
ごく最近まで直接神経リプログラミング技術を許可していないプラグインの生産標準化された効率的な方法で-毒物学および薬剤のスクリーニングの大規模なアッセイに必要なレベルに。この新しいメソッドは非常に効率的でし、今これらの制限を削除し、人間の神経系のみならず患者の特定をすることができますシステム研究の広大な配列を開くように、何度も継代されている線維芽細胞に使用することができます。この方法のシンプルさは、社内同様の研究を実行するすべてのグループのアクセスの技術をレンダリングし、簡単に使えるだけでなく大規模な医用、薬剤のスクリーニングおよび毒性アッセイなどもサポートするにはデータは、動物モデルやひと死後組織サンプルから派生します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
テクニカル サポートありがとうマリー persson さん Vejgården。これらの結果につながる研究は、欧州連合の第 7 フレームワーク プログラムの下で欧州研究評議会ニューヨーク幹細胞財団から資金を受けている: FP/2007-2013 神経幹細胞修復 (号 602278) し ERC 助成契約なし。30971、スウェーデン研究評議会 (許諾契約 2016-00873 521-2012-5624 と 70862601/Bagadilico)、スウェーデンのパーキンソン財団 (Parkinsonfonden) とルンド大学 Multipark (で学際的な研究に戦略的研究分野パーキンソン病)。ジャネル Drouin Ouellet はカナダの協会の健康研究 (機構) フェローシップ (#358492) によってサポートされ、ロジャー ・ バーカーがサポートされている、大学のケンブリッジ/アデンブの病院に NIHR バイオメディカル研究センター助成金によって。マリン Parmar がニューヨーク幹細胞財団ロバートソン捜査官です。シェルビー シュリグレー マリー キュリー スクウォドフスカ革新的なトレーニング ネットワークと付与契約第 676408 の下で欧州連合の地平線 2020 プログラム (H2020 MSCA ITN 2015) によって資金を供給します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
| Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
| Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
| Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
| Milli-Q Water | Millipore | ||
| Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
| Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
| Neural differentiation medium - NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
| LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
| NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
| db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
| LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
| Reagents for Coatings | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
| Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
| Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
| DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
| Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
| Reagents for Glass Coverslips | |||
| Autoclaved deionized water | |||
| Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
| Ethanol 95% | |||
| Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
| Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
| Reagents for Immunocytochemistry | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
| Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
| Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
| Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| Equipment | |||
| T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
| 1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
| 15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
| Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
| Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
| Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL. | ||
| Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
| Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
| Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
| Parafilm M | VWR | ||
| ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
| CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
| Laminar flow hood | |||
| Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
| Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
| Orbital shaker | |||
| Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
| FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |
References
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