Summary
Прямые нейрональных перепрограммирования генерирует нейронов, которые поддерживают возраст начала соматических клеток. Здесь мы описываем одного вектора на основе метода для создания искусственных нейронов из дермы фибробластов, полученные от взрослого человека доноров.
Abstract
Искусственных нейронов (iNs), продукт соматических клеток, непосредственно преобразованы в нейронах, являются способом для получения нейронов, пациент производные от ткани, которая легко доступна. Через этот маршрут зрелых нейронов могут быть получены в течение нескольких недель. Здесь мы описываем простых и быстрых одношаговый протокол для получения iNs от дермального фибробластов, полученные через биопсии образцы от взрослого человека доноров. Мы объяснить каждый шаг процесса, включая поддержание дермального фибробласты, процедуре замораживания для построения запас клеточной линии, заполнение ячейки для перепрограммирования, а также в условиях культуры во время процесса преобразования. Кроме того мы описываем подготовки стекла coverslips для электрофизиологических записей, долгосрочных условий покрытия и клеток активированных флуоресцированием сортируя (FACS). Мы также показываем примеры результатов можно ожидать. Протокол, описанные здесь легко выполнить, и может быть прикладной для человека фибробластов, производным от биопсии кожи человека от пациентов с различными разные диагнозы и возрастов. Этот протокол генерирует достаточное количество модулей, которые могут использоваться для широкого спектра биомедицинских приложений, включая моделирование болезней, наркотиков скрининг и целевые проверки.
Introduction
Разработка эффективных методов лечения неврологических расстройств сдерживаются ограниченным доступом к живые клетки мозга человека для выполнения механистический исследования и функциональных анализов. Около десяти лет назад эта ситуация радикально изменилась с развитием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) технологии1,2. Это, в сочетании с более глубокое понимание механизмов нейронных дифференциации, происходящих во время нормального человеческого развития, позволила для генерации определены и различных нейрональных подтипы от пациента и болезни конкретного материала. С таким материалом это теперь возможно изучить лежащие в основе неврологических заболеваний и потенциал различных соединений, чтобы облегчить эти патологические особенности3внутриклеточных механизмов.
В то время как iPSCs был революционным в области неврологии, один главный недостаток этих клеток является, что их старения подпись удаляется в процессе перепрограммирования таким образом, что помолодевшим нейрон не сохраняют уязвимость, связанная с старение4,5,6. Эта особенность нейронов, которые производятся может в конечном итоге решающее значение для изложив многие аспекты внутриклеточных патогенных Каскад, особенно в случае заболеваний, для которых старости является важным фактором риска.
Прямые, нейронные перепрограммирования – это технология, где соматической клетки преобразуется непосредственно в в без прохождения через плюрипотентных промежуточные стадии. Это позволяет для быстрого поколения человеческих нейронов в vitro который может быть как пациента, так и конкретных болезней. Замечательной особенностью прямых перепрограммирования, что начальный возраст донора клеток поддерживается, и с тем, ее уязвимость к процессы старения, таких как увеличил производство Оксидативный стресс4,7. В результате Син от больных с неврологическими заболеваниями связанные с старения, такие, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, хорошо подходят для широкого спектра биомедицинских приложений, включая болезни, моделирование, наркотиков скрининговых анализов и токсикологических исследований .
Основные предостережение, что помешало iNs пациентов с нейродегенеративных расстройств широко используется является, что они не являются легко перепрограммировать, и это становится еще более сложным с расширением фибробластов. В результате поколения в клетках в количествах, необходимых для этих типов приложений не был достигнут пока лишь недавно8. Теперь мы разработали простой метод для перепрограммирования фибробластов от доноров любого возраста очень эффективным образом. Этот метод сочетает в себе принудительного выражение нейрональных транскрипционных факторов, Ascl1 и Brn2 с нокдаун репрессор белки RE1 глушителей транскрипционного фактора (REST) с помощью одного вектора. Здесь мы описываем различные шаги, ведущие к поколение модулей, преобразованные из фибробластов кожи биопсию пожилых доноров.
Protocol
Взрослые фибробласты дермы были получены от исследований болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона клиник в центре Джона Ван Geest для ремонта мозга (Кембридж, Великобритания) и используются под местные этические утверждения (REC 09/H0311/88). Дополнительные сведения о процедуре отбора проб биопсии кожи смотрите ссылку8.
1. Подготовка фибробластов кожи для перепрограммирования
- С помощью автоматизированной ячейки, размораживания системы или ванну воды 37 ° C, оттепель взрослых человека фибробластов дермы (aHDFs) и тарелка 200000 в колбу (счетчик с автоматизированной клеток счетчиком) T75 в 10 мл среды фибробластов (см. таблицу 1) при 37 ° C в 5% CO2.
- Выполнение полного среднего изменения с фибробластов среднего на следующий день.
- Изменение среднего фибробластов каждые 3 – 4 дня до 95% confluency клетки.
Примечание: Один вырожденная настой будет содержать около 1 000 000 ячеек. AHDFs могут быть заморожены построить акции клеточной линии (раздел 2) или непосредственно повторно покрытием готовых для перепрограммирования (раздел 3).
2. Замораживание фибробластов кожи
- Поместите контейнер контролировать скорость замораживания в коробке со льдом или в холодильнике при температуре 4 ° C.
- Разбить ячейки с 0,05% трипсина (1,5 мл на колбу T75) при 37 ° C для 3-5 мин.
- Добавьте средне фибробластов (содержащие плода бычьим сывороточным (ФБС)) для нейтрализации трипсина (3 мл очищаемых за флакон T75) и собирать отдельные ячейки в 15 мл, смыв клетки в колбу дважды.
- Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматизированных клеток; (рекомендуется) заморозить около 500 000 aHDFs за флакон.
- Спин вниз клетки на 400 x g за 5 мин.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл замораживания среды (см. таблицу 1) и передача в криогенных трубку. Место труб непосредственно в контролируемых скорость замораживания контейнер.
- Храните руемой скорости замораживания аппарат в-80 ° C на ночь. На следующий день, передача трубы в морозильной камере-140 ° C и хранить до тех пор, пока требуется.
3. покрытие для перепрограммирования (день −1)
Примечание: Рекомендуется использовать покрытие желатин для краткосрочных экспериментов (до 30 дней); Кроме того для экспериментов в долгосрочной перспективе рекомендуется начать на поли L-орнитин, фибронектин и Ламинин (PFL) покрытие.
- 60 мин до покрытие aHDFs для перепрограммирования, пальто 24-ну плита с 0,1% желатина (250 мкл/а) и Инкубируйте на 37 ° C.
- Аспирационная фибробластов средство на aHDFs. Мыть раз с DPBS. Разбить ячейки с 0,05% трипсина (1,5 мл на колбу T75) при 37 ° C для 3-5 мин.
- Добавьте фибробластов среднего для нейтрализации трипсина (3 мл очищаемых за флакон T75) и собирать отдельные ячейки в 15 мл, смыв клетки в колбу дважды.
- Спин вниз клетки на 400 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл среды фибробластов.
- Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматизированных клеток (для обеспечения хорошего качества преобразования убедитесь, что жизнеспособность клеток выше 90% с Трипановый синий окрашивание).
- Для полного 24-ну плита готовить подвеска 1,320,000 клеток в 13,2 мл среды фибробластов добиться приостановления 100000 клеток/мл среды (или 55 000 клеток/колодец в 550 мкл среды фибробластов, умноженное на количество скважин необходимо).
- Аспирационная желатин с плиты и мыть дважды с DPBS. Добавить 500 мкл суспензии клеток в каждой скважине и инкубировать на ночь при 37 ° C в 5% CO2.
4. вирусные трансдукции (день 0)
Примечание: Работа с лентивирусные частиц требует 2 категории оборудования и использования агента для нейтрализации вируса. Также настоятельно рекомендуется носить двойной пары перчаток.
- Разминка 13.2 мл фибробластов средних 37 ° C.
- Оттепель лентивирусные вектор, содержащий факторов транскрипции, Ascl1 и Brn2 с двумя шпильки короткие РНК (индуцируемый) ориентация отдых при комнатной температуре.
Примечание: Обратитесь к ссылки8; Конструкция доступен в репозитории плазмиды. Для подробной информации о процедуре производить lentiviruses обратитесь к ссылка9. - Добавьте необходимый объем человека заразить aHDFs на обилие инфекции (МВД) 20 средних без каких-либо трансдукции усилителей.
- Заменить средний в пластине 24-ну фибробластов носитель, содержащий лентивирусные вектор (500 мкл/а) и инкубировать на ночь при 37 ° C в 5% CO2.
- Следующий день, замените свежие фибробластов среднего без лентивирусные вектор средних в скважинах.
Примечание: Средство считается инфекционных за 7 дней и как таковой, адекватной защиты и процедуры обработки должны использоваться в течение первой недели после вирусных трансдукции.
5. техническое обслуживание преобразования ячеек
Примечание: После того, как начинается преобразование клетки чувствительны к отмене; Позаботьтесь, чтобы наконечник пластину и использовать 1000 мкл пипетки, когда удаление средств массовой информации, чтобы избежать клетки отсоединение.
- На 3 день, удалите средство фибробластов и 500 мкл ранних нейронов преобразования среды (см. таблицу 1).
- Два-три раза в неделю, вывезти 225 мкл старой среды из колодца и -в 250 мкл свежие ранних нейронов преобразования среды.
- В день 18, удалить все среды из каждой скважины и заменить 500 мкл конце нейрональных преобразования среды (см. таблицу 1).
- Продолжайте изменять половина среды как выше с конца среднего нейрональных преобразования каждые 2-3 дня до дня 25 или эксперимент конечной точки (Рисунок 1A).
Примечание: Если не клетки покрыты в каждый хорошо для эксперимента, заполните пустые скважин с PBS или воды для предотвращения испарения открытой среды и свести к минимуму различия между скважинами.
| Складе концентрация | Рабочая концентрация | |
| Средний фибробластов | ||
| Базальные среднего | Н/Д | Н/Д |
| Пенициллин/стрептомицина | 10 000 ед/мл | 100 мг/мл |
| FBS | Н/Д | 10% |
| Замораживание среднего | ||
| Средний фибробластов | Н/Д | 45% |
| FBS | Н/Д | 45% |
| ДМСО | Н/Д | 10% |
| Ранних нейронов преобразования среднего (ENM) | ||
| Нейронные дифференциации среднего | Н/Д | Н/Д |
| Пенициллин/стрептомицина | 10 000 ед/мл | 100 мг/мл |
| CHIR99021 | 10 мм | 2 МКМ |
| SB-431542 | 20 мм | 10 МКМ |
| Башка | 100 мкг/мл | 0,5 мкг/мл |
| LDN-1931189 | 10 мм | 0,5 МКМ |
| VPA | 2. | 1 мм |
| LM-22A4 | 20 мм | 2 МКМ |
| GDNF | 20 мкг/мл | 2 нг/мл |
| STN | 10 мкг/мл | 10 нг/мкл |
| DB лагерь | 50 мм | 0,5 мм |
| Конце нейрональных преобразования среднего (компании) | ||
| Нейронные дифференциации среднего | Н/Д | Н/Д |
| Пенициллин/стрептомицина | 10 000 ед/мл | 100 мг/мл |
| LM-22A4 | 20 мм | 2 МКМ |
| GDNF | 20 мкг/мл | 2 нг/мл |
| STN | 10 мкг/мл | 10 нг/мкл |
| DB лагерь | 50 мм | 0,5 мм |
| СУИМ буфер | ||
| HBSS 1 x [- кальций, магний, - фенола Красного] | Н/Д | Н/Д |
| BSA | Н/Д | 1% |
| DNAase | Н/Д | 0,05% |
Таблица 1: состав различных средств массовой информации используется. Полное описание состава для всех средств массовой информации, необходимой в настоящем Протоколе, включая средний фибробластов, замораживание среднего, ранних нейронов преобразования среды, конце нейрональных преобразования средних и СУИМ буфера.
6. стекла Coverslips для электрофизиологических записей
Примечание: Рекомендуется носить пальто лаборатории, очки, двойные перчатки и завершить всю работу в зонта. Этот протокол является адаптирована из 10.
- Место coverslips стекла в нижней части стекла блюдо без перекрытия.
- Добавление общего Лаборатория очистки моющим средством, чтобы потопить все coverslips без рискуя переполнения во время встряхивания (около 30 мл). Поместите на орбитальный шейкер на медленной скорости за 2 ч.
- Вымойте шесть раз (30 мин) автоклавного деионизированной водой.
- Добавьте этанола 95% за 2 ч.
- Удаление этанола и ждать, пока coverslips сухой.
- После высыхания, передачи coverslips в стеклянный стакан и добавить 70% азотной кислоты, до тех пор, пока coverslips погружены.
- Место стеклянный стакан в sonicator ванну для 60 мин.
- Удаление азотной кислоты и мыть три раза газобетона деионизированной водой.
Предупреждение: Всегда добавьте кислоты воду, никогда не другой путь вокруг, как это может привести к бурной реакции. - Удалить столько воды из стакана как можно и добавить концентрированной соляной кислоты (HCI), до тех пор, пока coverslips будут погружены в воду; водоворот, стакан и крышку с парафином фильм.
- Sonicate 60 мин (50 – 60 Гц, 30 Вт).
- Удалите столько HCI из coverslips как можно скорее и место в соответствующей мусорное ведро. Промыть газобетона деионизированную воду дважды.
- Взять coverslips из капюшона и промыть 20 раз (или более) автоклавного деионизированной воды до тех пор, пока все HCI будет удалена.
- После высыхания, место coverslips в стерильных пластин 24-хорошо.
- Поместите пластины под ультрафиолетового (УФ) света на ночь. Следующий день coverslips готовы к использованию.
Примечание: Если используется стекло coverslips, рекомендуется использовать покрытие PFL. Просто поместите один coverslip в каждую лунку 24-ну плиты (с использованием стерильный пинцет) и следовать протоколу как показано ниже.
7. PFL покрытие для долгосрочной перспективе культуры
- Слой 24-ну пластины с поли L-орнитин (500 мкл/а) и оставить на ночь при 37 ° C в 5% CO2.
- Аспирационная поли L-орнитин и подождать до тех пор, пока он достаточно сухой, в форме капель на вершине.
- Сделайте падение (примерно 60 мкл) Ламинин в центре каждого Ну и распространился на всю поверхность coverslip. Оставьте на 2 ч 45 мин при 37 ° C в 5% CO2.
- Промыть DPBS три раза.
- Добавить фибронектина (500 мкл/а) и оставить на ночь при 37 ° C в 5% CO2.
- Мыть раз с DPBS перед добавлением клетки.
Примечание: PFL покрытие может использоваться для долгосрочной термин культуры iNs (свыше 100 дней), хотя прогрессивный клеточную смерть следует ожидать от дня 30.
8. СУИМ
Примечание: Чтобы повторно пластины клетки после СУИМ сортировки PFL-покрытием плиты 48 h заранее подготовить. Клетки могут быть отсортированы с помощью нейронных клеток сцепления молекул (NCAM) антитела от 20-й день года после трансдукции.
- Удалите средства массовой информации с 1000 мкл пипетки (не мыть, чтобы избежать отсоединение клетки).
- Добавить ячейку отделения агент (250 мкл/а), оставить на 10-20 мин до клетки лифта и поплавок как отдельные клетки.
- В это время подготовьте СУИМ буфера.
- Нарезанных нежно с 1000 мкл пипетки. Если остаются некоторые сгустки, Инкубируйте немного дольше.
- Как только одну ячейку подвеска получается, удалите его из скважины и место в 1,5 мл трубку.
- Заподлицо хорошо дважды с конца нейрональных преобразования средних и место в том же 1,5 мл трубку.
- Спин вниз на 400 g x 5 минут и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мкл буфера СУИМ.
- Спин вниз клетки на 400 g x 5 минут и удалить супернатант.
- Повторите шаги 8.8 и 8,9 дважды.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл буфера СУИМ, содержащих человеческие антитела CD56 (NCAM) в концентрации 1:50 для 15 мин на льду. Защищайте от света.
- Спин вниз клетки на 400 x g за 5 мин.
- Ресуспензируйте 200 мкл буфера СУИМ мыть и спин вниз клетки на 400 x g за 5 мин.
- Повторите шаг 8.13.
- Ресуспензируйте в 200 мкл буфера СУИМ, содержащий пропидий йодидом (PI; 10 мкг/мл). Сортировать NCAM положительные (iNs) и PI отрицательные (live) клетки с помощью СУИМ, строб, основанный на уровень интенсивности флуоресценции контрольных образцов, которые не были окрашены с NCAM антитела или PI.
- Соберите NCAM положительные клетки в тубы конце среднего нейрональных преобразования.
- Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматизированных клеток и повторно пластины клетки на высокой плотности (50 000 клеток/см2) в конце среднего нейрональных преобразования в блюдо PFL покрытием.
- Продолжайте изменять половина среды 2 – 3 раза в неделю с конца нейрональных преобразования среднего до конечной точки эксперимента (рис. 1A).
Representative Results
Четкое изменение в морфологии клеток должен быть виден с дня 5 года (рис. 1B). Некоторые смерти клетки ожидается после вирусных трансдукции, хотя не открыто. От каждой скважины в пластине 24-ну ячейке доходность 20 000-40 000 ячеек следует ожидать в день 25, из которых около половины должен был стать нейронов. Важно отметить, что урожайность и чистоты может варьироваться по всей линии клеток, а также с сериями государства и вирус болезни.
Клетки будут выражать большинство стандартных маркеров нейронов, включая MAP2 и Тау (рис. 1 c) на день 25 в дополнение к выставке зрелых нейронов морфологии. Это позволяет получить чистый населения, делая СУИМ, основанные на маркер NCAM (см. ссылки8,11). Клетки могут впоследствии быть либо повторно покрытием на тройной покрытия PFL (см. ссылку10) или непосредственно замороженных биомолекулярных анализа.
Если клетки не сортируются, иммунофлюоресценции маркировки с MAP2 или Тау должны быть выполнены для идентификации успешно преобразованных ячеек и совместно помечены протеина интереса.
Рисунок 1: эволюция в преобразования над временем. (A) Хронология эксперимент и карта конструкции, упакованы в Лентивирусы, используемый для перепрограммирования взрослых фибробластов дермы. Каждая черная стрелка представляет собой средний изменение. (B) представитель этап контрастность изображения изображающие изменениям в морфологии клеток во время процесса преобразования между день 0 день 22 (как указано в верхнем правом углу каждой группы). Изображения были взяты на микроскопе контраст фазы с использованием 10 X цель. (C) образ иммунофлюоресценции Тау и MAP2 двойной пятнать в день 35 после трансдукции. Клетки были зафиксированы в параформальдегида 4% и permeabilized с 0,1% Тритон в DPBS за 10 мин клетки были заблокированы на 30 мин в сыворотке 5% раствор в DPBS. Антитела были разводят в преграждая разрешение и применяется на ночь при 4 ° C. Флюорофор конъюгированных вторичные антитела были разводят в преграждая разрешение и применять за 2 ч. клетки были counterstained с DAPI 15 мин, следуют 3 стирок с DPBS. Изображения были взяты на Перевернутый флуоресценции микроскопа с помощью 20 X цель. Масштаб баров = 100 мкм (B, C). Сокращения: ENM: ранних нейронов среднего; LNM: поздно нейронов среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Это один шаг/один вектор перепрограммирования метод обеспечивает эффективный способ получения iNs от взрослых фибробластов. Взрослый фибробластов обычно гораздо сложнее Коверт чем плода фибробластов, с ограниченным исследования, ранее отчетность эффективность примерно 5-10%12,13. Однако с этой новой протокола можно добиться нейрональных доходность (измеряется как MAP2 + клеток) приблизительно 50%8. Кроме того наш протокол может использоваться на кожный фибробласты, которые были пассированной несколько раз без потери эффективности конверсии. До настоящего времени мы использовали клетки, пассированные до 14 раз без обнаружения любого снижения эффективности преобразования. Кроме того нет никакой разницы в эффективности в наших руках с фибробластов от доноров возраста между 52 и 87 перепрограммирования. Для более подробной информации о возрасте и болезни других клеточных линий, протестированных на совместимость с этой конструкции смотрите ссылку8. Другие исследования также сообщили никакой разницы в эффективности преобразования с помощью лентивирусные основе и малые молекулы расширение протокола с донорами между 0 и 89 лет4. Кроме того последовательное применимости с на основе Мирна нейрональных перепрограммирования сообщалось в фибробласты всех возрастов, с донорами между 0 и786 лет. Через этот маршрут зрелых нейронов можно получить в приблизительно 12-15 недель в пробирке или около 8 недель после пересадки в vivo8. Это выгодно, потому что она дает доступ к болезни и пациент конкретного человека модули из ткани, которая легко доступна. Хотя этот протокол является эффективным, он не будет производить 100% нейронов доходности, и таким образом требуется очистка шаг, например с помощью СУИМ.
Наиболее важным шагом в рамках этого протокола является вирусной трансдукции (протокол раздел 4). Важно, что титр вируса является точным, наряду покрытием точное количество aHDFs для преобразования. Титр рекомендуется для использования с настоящим Протоколом составляет 4 x 10-8 и 4 x 10-9. С помощью титр ничего ниже 1 x 10-8 не рекомендуется использовать как добавление больших объемов вирус будет токсичны для клеток. Кроме того как фибробласты начинают скрытые модули они станут более хрупкими и чувствительными к отмене. Важно, чтобы быть нежным, при изменении средства массовой информации, чтобы не нарушить клетки слишком много. Это может быть сделано путем удаления жидкости медленно с пипетки 1000 мкл. Наконец когда покрытие для перепрограммирования (протокол раздел 3) имеет важное значение для обеспечения здорового фибробластов населения перед началом эксперимента; Это обозначается жизнеспособность клеток из выше 90% с Трипановый синий пятнать. AHDFs всегда должно быть пассированной дойдя до 95% confluency.
Если есть заметные клеточной гибели до вирусной трансдукции, не начать преобразования: Проверьте, что жизнеспособность клеток выше 90% и что не было никаких проблем с покрытием плиты. Это, как ожидается, будет иметь небольшое количество смерти клетки после вирусных трансдукции, однако, это не должно быть значительным. В этом случае Подтвердите точный высев семян 50 000 aHDFs/хорошо и проверьте титр вируса. Если есть заметные расхождения между скважинами во время преобразования, сначала проверьте, что каждый хорошо содержит одинаковое количество средств массовой информации и открытой испарения не происходит на краях (при необходимости дополнительных средств массовой информации могут быть добавлены к краю скважин). Кроме того проверить шаг 4.4 и обеспечить надлежащее смешивание для однородных подвеска, когда преобразователя. Важно добавить человека среды во-первых, перед добавлением этого в скважины. Непосредственного добавления человека в скважины увеличится до скважины изменчивости и представляется также токсичны для клеток. И наконец всегда проверяйте, что носителя нагревают до 37 ° C перед добавлением в клетки.
Этот протокол включает в себя дополнительные разделы для покрытия условия для давно термин культуры iNs и СУИМ, сортировка увеличить нейрональных чистоты. Для желающих исследовать функциональных характеристик модулей экспериментов протокол для подготовки стекла coverslips электрофизиологии также были включены. Протокол преобразования настроен для использования с 24-ну плиты; При необходимости это может быть изменено для 6-, 12-, 48, 96-луночных пластины или фляги. В этом случае пожалуйста, измените все тома на площади поверхности плиты или настой использовать.
Этот протокол использует принудительный выражение Ascl1 и Brn2 в сочетании с остальной нокдаун все упаковано в один единый вектор8 для создания модулей Пан нейронов фенотип. Поколения любой глиальных подтипы с помощью этого метода, однако, проведена не была. Этот метод будет таким образом должны быть модифицированы для использования с другими перепрограммирования факторов для получения подтип конкретные нейронов. Прямые перепрограммирования ранее показал возможность генерировать двигательных нейронов, Сенсорные нейроны, фоторецепторов, полосатой средних колючий нейронов и дофаминергические нейроны10,14. Это будет полезно при расследовании неврологических заболеваний, в которых конкретные нейрональных подтип преференциально пострадавших, например болезнь Паркинсона и дофаминергических нейронов.
До совсем недавнего времени, прямая технологии нейронных перепрограммирования не допускает производства модулей в стандартизированной и эффективным образом — до уровня, который необходим для токсикологии и наркотиков скрининг анализов в широком масштабе. Этот новый метод очень эффективен и может быть использован на фибробласты, которые были пассированные много раз, что он сейчас снимает эти ограничения и открывает широкий спектр исследований, не только в нервной системы человека, но и в системе, которая может быть пациентом конкретные. Простота этого подхода оказывает в технологии доступными для любых групп, желающих выполнять аналогичные исследования собственными силами и может легко использоваться не только для больших масштабах биомедицинских приложений, таких как наркотиков скрининг и токсикологии анализов, но и для поддержки данные, полученные от животных моделей и человека посмертное образцы тканей.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Мария Перссон Vejgården для оказания технической помощи. Исследований, приведших к эти результаты получил финансирование от Нью-Йоркского фонда стволовых клеток, Европейский исследовательский совет по седьмой рамочной программы Европейского союза: FP/2007-2013 нейро стволовых клеток ремонт (№ 602278) и КЧП Грант соглашения нет. 30971, Шведский исследовательский совет (грантовое соглашение 521-2012-5624, 2016-00873 и 70862601 / Bagadilico), Шведский фонд Паркинсона (Parkinsonfonden) и стратегическая область исследований в Лундском университете Multipark (междисциплинарных исследований в Болезнь Паркинсона). Джанель Drouin-Уэлле поддерживается стипендий Канадского институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ) (#358492), и Роджер Баркер поддерживается грантом NIHR центр биомедицинских исследований в университете в Кембридже/Адденбрукс. Малин Parmar является следователь Робертсон фонд стволовых клеток Нью-Йорке. Шелби Shrigley финансируется программой Европейского союза Horizon 2020 (H2020-МСКА-ITN-2015) под Марии Склодовской-Кюри инновационной учебной сети и Грант соглашение № 676408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
| Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
| Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
| Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
| Milli-Q Water | Millipore | ||
| Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
| Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
| Neural differentiation medium - NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
| LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
| NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
| db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
| LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
| Reagents for Coatings | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
| Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
| Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
| DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
| Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
| Reagents for Glass Coverslips | |||
| Autoclaved deionized water | |||
| Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
| Ethanol 95% | |||
| Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
| Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
| Reagents for Immunocytochemistry | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
| Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
| Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
| Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| Equipment | |||
| T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
| 1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
| 15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
| Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
| Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
| Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL. | ||
| Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
| Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
| Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
| Parafilm M | VWR | ||
| ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
| CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
| Laminar flow hood | |||
| Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
| Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
| Orbital shaker | |||
| Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
| FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, 170-182 (2016).
- Mertens, J., et al. Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects. Cell Stem Cell. 17, 705-718 (2015).
- Hashizume, O., et al. Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects. Sci Rep. 5, 10434 (2015).
- Lapasset, L., et al. Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state. Genes Dev. 25, 2248-2253 (2011).
- Huh, C. J., et al. Maintenance of age in human neurons generated by microRNA-based neuronal conversion of fibroblasts. Elife. 5, (2016).
- Drouin-Ouellet, J., et al. REST suppression mediates neural conversion of adult human fibroblasts via microRNA-dependent and -independent pathways. EMBO Mol Med. , (2017).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Richner, M., Victor, M. B., Liu, Y., Abernathy, D., Yoo, A. S. MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons. Nat Protoc. 10, 1543-1555 (2015).
- Lau, S., Rylander Ottosson, D., Jakobsson, J., Parmar, M. Direct neural conversion from human fibroblasts using self-regulating and nonintegrating viral vectors. Cell Rep. 9, 1673-1680 (2014).
- Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts. Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).
- Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Masserdotti, G., Gascón, S., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: learning from and for development. Development. 143, 2494-2510 (2016).
- Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain. Sci Rep. 4, 6330 (2014).
