Summary
Direkta neuronala omprogrammering genererar nervceller som upprätthåller en ålder av somatiska startcellen. Här beskriver vi en enda vektor-baserade metod för att generera inducerade nervceller från dermal fibroblaster från vuxen människa givare.
Abstract
Inducerade nervceller (iNs), produkten av somatiska celler direkt omvandlas till nervceller, är ett sätt att få patientderiverade nervceller från vävnad som är lättillgängligt. Genom denna väg, kan mogna nervceller erhållas inom loppet av några veckor. Här, beskriver vi en enkel och snabb one-step protokoll för att erhålla iNs från dermal fibroblaster erhålls genom biopsi prov från vuxen mänskliga donatorer. Vi förklara varje steg av processen, inklusive underhåll av dermal fibroblaster, frysning förfarandet för att bygga upp ett lager av cellen, sådd av cellerna för omprogrammering, samt villkor som kultur under konverteringen. Dessutom beskriver vi utarbetandet av glas coverslips för elektrofysiologiska inspelningar, långsiktiga beläggning förutsättningar och fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). Vi visar också exempel på resultaten kan förväntas. Protokollet beskrivs här är lätt att utföra och kan härledas tillämpas på mänskliga fibroblaster från mänsklig hud biopsier från patienter med olika åldrar och olika diagnoser. Detta protokoll genererar en tillräcklig mängd av moduler som kan användas för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar, inklusive sjukdom modellering, drogkontroll och målet validering.
Introduction
Utveckling av effektiva behandlingar för neurologiska sjukdomar har hämmats av begränsad tillgång till levande mänskliga hjärnceller att utföra mekanistiska studier och funktionella analyser. Om ett decennium sedan, denna situation radikalt med utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) teknik1,2. Detta i kombination med en bättre förståelse av de neurala differentiering mekanismer som inträffar under normal mänsklig utveckling, har tillåtit för generering av definierade och varierande neuronala subtyper från patienten och sjukdomen specifika material. Med sådant material är det nu möjligt att studera intracellulära mekanismer bakom neurologiska sjukdomar och potentialen hos olika föreningar att lindra de patologiska funktioner3.
Medan iPSCs har varit revolutionerande inom neurovetenskap, är en stor nackdel av dessa celler att deras åldrande signatur raderas under processen omplanering så att föryngrad neuron inte behåller den sårbarhet som är associerad med åldrande4,5,6. Denna särskilda funktion av nervceller som produceras kan hamna kritiska för går igenom många aspekter av den intracellulära patogena cascade, särskilt när det gäller sjukdomar som ålderdomen är en viktig riskfaktor.
Direkt neurala omprogrammering är en teknik där en somatisk cell omvandlas direkt till en i utan att gå via en pluripotenta mellanliggande skede. Detta möjliggör snabb generering av mänskliga nervceller in vitro- som kan vara både patienten och sjukdomen specifika. En anmärkningsvärd egenskap hos direkt omprogrammering är att cellen givaren start år upprätthålls, och med det, dess sårbarhet för åldrande processer såsom ökad produktion av oxidativ stress4,7. Som ett resultat, iNs från patienter med neurologiska sjukdomar associerade med åldrande, såsom Alzheimers och Parkinsons sjukdom, lämpar sig väl för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar inklusive sjukdom modellering, drug screening analyser och toxikologiska studier .
Det huvudsakliga förbehållet som har hindrat iNs från patienter med neurodegenerativa sjukdomar som ofta används är att de inte är lätt att programmera, och detta blir ännu svårare med utbyggnad av fibroblaster. Som ett resultat, har generation av celler i kvantiteter som krävs för dessa typer av program inte uppnåtts fram till nyligen8. Vi har nu utvecklat en enkel metod att omprogrammera fibroblaster från givare oavsett ålder på ett mycket effektivt sätt. Denna metod kombinerar uttrycket påtvingad av de neuronala transkriptionsfaktorerna Ascl1 och Brn2 med en knockdown av repressor protein RE1-ljuddämpning Transkriptionfaktorn (resten) använder en enda vektor. Här beskriver vi de olika steg som leder till generation av iNs konverteras från huden fibroblaster biopsier från äldre donatorer.
Protocol
Vuxen dermal fibroblaster var erhållits från Parkinsons Sjukdomforskning och Huntingtons sjukdom klinikerna i John van Geest centrum för hjärnan reparation (Cambridge, UK) och som används under lokala etiska godkännande (REC 09/H0311/88). För information om huden biopsi provtagningsförfarandet, se referens8.
1. förberedelse av huden fibroblaster för omprogrammering
- Använda en automatiserad cell upptining system eller 37 ° C vattenbad, Tina vuxen mänskliga dermal fibroblaster (aHDFs) och platta 200.000 per T75 kolv (räkna med en automatisk cell counter) i 10 mL av fibroblast medium (se tabell 1) vid 37 ° C i 5% CO2.
- Utför en fullständig medium förändring med fibroblast medium på nästa dag.
- Ändra det fibroblast mediet var 3 – 4 dagar tills cellerna nå 95% konfluens.
Obs: En konfluenta kolven kommer att innehålla cirka 1 000 000 celler. AHDFs kan frysas för att bygga ett bestånd av cell linje (avsnitt 2) eller direkt åter guldpläterade redo för omprogrammering (avsnitt 3).
2. frysning av huden fibroblaster
- Placera en kontrollerad-rate frysning behållare i en låda med is eller i kylen vid 4 ° C.
- Separera celler med 0,05% trypsin (1,5 mL per T75 kolv) vid 37 ° C i 3 – 5 min.
- Lägg till fibroblast medium (innehållande fetalt bovint serum (FBS)) för att neutralisera trypsin (3 mL per spolning per T75 kolv) och samla fristående cellerna i en 15 mL tub av spola ut cellerna i kolven två gånger.
- Räkna cellerna använder räknaren automatiserade cell; (rekommenderas) frysa ungefärligt 500.000 aHDFs per injektionsflaska.
- Snurra ner cellerna vid 400 x g i 5 min.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 mL iskallt medium (se tabell 1) och överföring i kryogena röret. Placera rören direkt i behållaren kontrolleras-rate frysning.
- Lagra andelen kontrollerade frysning apparater vid-80 ° C över natten. Följande dag, överföra rören till-140 ° C frys och lagra tills behövs.
3. plätering för omprogrammering (dag −1)
Obs: Det rekommenderas att använda en gelatin beläggning för kort sikt experiment (upp till 30 dagar); Alternativt för långsiktiga experiment rekommenderas det att starta på en poly-L-ornitin, Fibronektin och laminin (PFL) beläggning.
- 60 min före plätering av aHDFs för omprogrammering, coat en 24-well platta med 0,1% gelatin (250 µL per brunn) och inkubera vid 37 ° C.
- Aspirera fibroblast mediet på aHDFs. Tvätta en gång med DPBS. Separera celler med 0,05% trypsin (1,5 mL per T75 kolv) vid 37 ° C i 3 – 5 min.
- Lägg till fibroblast medium för att neutralisera trypsin (3 mL per spolning per T75 kolv) och samla fristående cellerna i en 15 mL tub av spola ut cellerna i kolven två gånger.
- Snurra ner cellerna vid 400 x g i 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 mL av fibroblast medium.
- Räkna cellerna med en automatisk cell räknare (för att säkerställa en god kvalitet konvertering Kontrollera att cellen livskraft över 90% med trypan blå färgning).
- För en komplett 24-väl plåt, Preparera en suspension av 1,320,000 celler i 13,2 mL fibroblast medium att uppnå en suspension av 100 000 celler/mL medium (eller 55 000 celler per brunn i 550 µL av fibroblast medium multiplicerat med antalet brunnar behövs).
- Aspirera gelatin från plattan och tvätta två gånger med DPBS. Tillsätt 500 µL cellsuspension i varje brunn och inkubera över natten vid 37 ° C i 5% CO2.
4. viral Transduction (dag 0)
Obs: Arbeta med lentiviral partiklar kräver kategori 2 utrustning och användning av en agent att neutralisera virus. Bär dubbla par handskar rekommenderas också starkt.
- Värm upp 13,2 mL fibroblast medium till 37 ° C.
- Tina en lentiviral vektor som innehåller transkriptionsfaktorerna Ascl1 och Brn2 med två korta hårnål RNAs (shRNA) inriktning vila i rumstemperatur.
Obs: Se om du vill referera8; bygga är tillgänglig i en plasmid-databas. För detaljer om proceduren för att producera lentiviruses se hänvisning9. - Lägga till volymen som behövs av lentivirus att infektera aHDFs på multiplicity av infektion (MOI) 20 till medium utan någon transduktion smakförstärkare.
- Ersätta mediet i 24-väl plattan med fibroblast medium innehållande lentiviral vektorn (500 µL per brunn) och inkubera över natten vid 37 ° C i 5% CO2.
- Nästa dag, ersätta mediet i brunnarna med färska fibroblast medium utan lentiviral vektorn.
Obs: Medium anses smittsamma i 7 dagar och som sådan, adekvat skydd och hantering bör användas under den första veckan efter viral transduktion.
5. underhåll av konvertera cellerna
Obs: När konvertering börjar cellerna är känsliga för lyft; var noga med att tippa plattan upp och använda 1000 µL pipett när borttagning av media att undvika celler du lossar.
- Dag 3, ta bort fibroblast medium och tillsätt 500 µL av tidig neuronala konvertering medium (se tabell 1).
- Två till tre gånger i veckan, ta ut 225 µL av gamla medium från brunnen och -tillägg 250 µL av färska tidiga neuronala konvertering medium.
- Dag 18, ta bort alla medium från varje brunn och ersätta med 500 µL av sena neuronala konvertering medium (se tabell 1).
- Fortsätta att ändra hälften av mediet som ovan med sena neuronala konvertering medium efter 2 – 3 dagar tills dag 25 eller experiment endpoint (figur 1A).
Obs: Om celler inte är klädd i varje brunn för experimentet, fylla tomma brunnar med PBS eller vatten för att förhindra overt avdunstning av medium och minimera variationen mellan brunnar.
| Beståndet koncentration | Arbetar koncentration | |
| Fibroblast medium | ||
| Basala medium | EJ TILLÄMPLIGT | EJ TILLÄMPLIGT |
| Penicillin/Streptomycin | 10 000 E/mL | 100 mg/mL |
| FBS | EJ TILLÄMPLIGT | 10% |
| Frysa medium | ||
| Fibroblast medium | EJ TILLÄMPLIGT | 45% |
| FBS | EJ TILLÄMPLIGT | 45% |
| DMSO | EJ TILLÄMPLIGT | 10% |
| Tidiga neuronala konvertering medium (ENM) | ||
| Neurala differentiering medium | EJ TILLÄMPLIGT | EJ TILLÄMPLIGT |
| Penicillin/Streptomycin | 10 000 E/mL | 100 mg/mL |
| CHIR99021 | 10 mM | 2 ΜM |
| SB-431542 | 20 mM | 10 ΜM |
| Skalle | 100 µg/mL | 0,5 µg/mL |
| LDN-1931189 | 10 mM | 0,5 ΜM |
| VPA | 1 M | 1 mM |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg/mL | 10 ng/µL |
| DB-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| Sen neuronala konvertering medium (LNM) | ||
| Neurala differentiering medium | EJ TILLÄMPLIGT | EJ TILLÄMPLIGT |
| Penicillin/Streptomycin | 10 000 E/mL | 100 mg/mL |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg/mL | 10 ng/µL |
| DB-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| FACS buffert | ||
| HBSS 1 x [- kalcium och -magnesium, - fenolrött] | EJ TILLÄMPLIGT | EJ TILLÄMPLIGT |
| BSA | EJ TILLÄMPLIGT | 1% |
| DNAase | EJ TILLÄMPLIGT | 0,05% |
Tabell 1: sammansättningen av de olika medierna används. Fullständig beskrivning av sammansättningen för alla medier som behövs i detta protokoll inklusive fibroblast medium, frysning medium, tidig neuronala konvertering medium, sena neuronala konvertering medium och FACS buffert.
6. glas Coverslips för elektrofysiologiska Recordings
Obs: Det rekommenderas att bära en labbrock, skyddsglasögon, dubbla handskar och slutföra allt arbete i dragskåp. Detta protokoll är anpassade från 10.
- Placera glas coverslips längst ned i en glasskål utan överlappning.
- Lägga till allmänna lab rengöring diskmedel för att dränka alla coverslips utan riskerar spill under skakning (cirka 30 mL). Placera på orbitalskak på långsam hastighet för 2 h.
- Tvätta sex gånger (30 min varje) med Ånghärdad avjoniserat vatten.
- Lägg till 95% etanol för 2 h.
- Ta bort etanol och vänta tills coverslips är torra.
- När torra, överför coverslips till en glasbägare och tillsätt 70% salpetersyra tills coverslips är nersänkta.
- Placera glasbägaren i ett någon sonikator bad för 60 min.
- Ta bort salpetersyra och tvätta tre gånger med Ånghärdad avjoniserat vatten.
Försiktighet: Lägg alltid syra till vatten, aldrig tvärtom eftersom detta kan leda till en våldsam reaktion. - Ta bort så mycket vatten från bägaren som möjligt och tillsätt koncentrerad saltsyra (HCL) tills coverslips är nersänkta; snurra den bägare och täck med paraffin film.
- Sonikera för 60 min (50 – 60 Hz, 30 W).
- Ta bort så mycket HCI från coverslips som möjligt och plats i en lämplig avfallsbehållare. Skölj med Ånghärdad avjoniserat vatten två gånger.
- Ta coverslips av huven och skölj 20 gånger (eller mer) med Ånghärdad avjoniserat vatten tills alla HCI tas bort.
- När torra, placera coverslips i sterila 24 brunnar.
- Placera plattorna under ultraviolett (UV) ljus under natten. Nästa dag coverslips är redo att använda.
Obs: Om glas coverslips används, är det rekommenderat att använda PFL beläggning. Helt enkelt placera en täckglas i varje brunn 24-well platta (med steril pincett) och följa protokollet enligt nedan.
7. PFL beläggning för lång sikt kultur
- Coat 24-väl plattan med poly-L-ornithine (500 µL per brunn) och lämna över natten vid 37 ° C i 5% CO2.
- Aspirera den poly-L-ornitin och vänta tills det är tillräckligt torrt för att bilda droppar på toppen.
- Gör en droppe (ca 60 µL) laminin i mitten av varje brunn och sprida för att täcka hela ytan av täckglaset. Låt verka i 2 h 45 min vid 37 ° C i 5% CO2.
- Tvätta tre gånger med DPBS.
- Lägg till Fibronektin (500 µL per brunn) och lämna över natten vid 37 ° C i 5% CO2.
- Tvätta en gång med DPBS innan du lägger till celler.
Obs: PFL beläggningen kan användas för lång sikt kulturer av iNs (över 100 dagar), även om progressiva celldöd kan förväntas från dag 30.
8. FACS
Obs: Att åter tallrik cellerna efter FACS sortering förbereda en PFL-belagd plåt 48 h i förväg. Celler kan sorteras med hjälp av en neurala cell adhesion molekyl (NCAM) antikropp från dag 20 och framåt efter transduktion.
- Ta bort media med 1000 µL pipett (tvätta inte för att undvika celler du lossar).
- Lägga till cell separera agent (250 µL per brunn), lämna för 10 – 20 min tills cellerna lift, och flyta som enstaka celler.
- Under denna tid förbereda FACS bufferten.
- Pulverisera försiktigt med 1000 µL pipett. Om några klumpar kvar, inkubera lite längre.
- När en enda cellsuspension erhålls, ta bort den från brunnen och placera i en 1,5 mL tub.
- Spola ut brunnen två gånger med sena neuronala konvertering medium och placera i en och samma 1,5 mL tub.
- Snurra ner vid 400 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 200 µL FACS buffert.
- Snurra ner cellerna vid 400 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
- Upprepa steg 8,8 och 8,9 två gånger.
- Återsuspendera cellpelleten i 50 µL av FACS buffert som innehåller human antikropp som CD56 (NCAM) vid en koncentration på 1:50 för 15 min på is. Ljuskänsligt.
- Snurra ner cellerna vid 400 x g i 5 min.
- Återsuspendera i 200 µL FACS buffert att tvätta och snurra ner cellerna vid 400 x g i 5 min.
- Upprepa steg 8,13.
- Återsuspendera i 200 µL FACS buffert innehållande propidium jodid (PI; 10 µg/mL). Sortera NCAM positiva (iNs) och PI negativa (live) celler med FACS genom gating baserat på en intensitetsnivå som fluorescens av kontrollprover som inte var målat med NCAM antikropp eller PI.
- Samla NCAM positiva cellerna i en tub innehållande sena neuronala konvertering medium.
- Räkna cellerna med en automatiserad cell counter och åter tallrik cellerna vid hög täthet (50 000 celler/cm2) i sena neuronala konvertering medium i en PFL belagda maträtt.
- Fortsätta att ändra hälften av medium 2 – 3 gånger per vecka med sena neuronala konvertering medium tills slutpunkten experiment (figur 1A).
Representative Results
En tydlig förändring i cellmorfologi ska synas från dag 5 och framåt (figur 1B). Vissa celldöd förväntas kan efter viral transduktion, även om inte öppet. Från varje brunn i en 24-well platta bör summacell kapacitet på 20.000-40.000 celler förväntas av dag 25, varav ungefär hälften bör ha blivit nervceller. Det är viktigt att notera att avkastning och renhet kan varierar över cellinje, samt med sjukdom stat och virus batchar.
Celler kommer att uttrycka de flesta vanliga neuronala markörer inklusive MAP2 och TAU (figur 1 c) på dag 25 förutom uppvisar en mogen neuronala morfologi. Det är möjligt att få en ren i befolkningen genom att göra FACS baserat på markören NCAM (se hänvisningar8,11). Celler kan därefter antingen åter pläteras på PFL trippel beläggning (se hänvisning10) eller direkt frysta för Biomolekylär analyser.
Om cellerna inte är sorterade, bör immunofluorescens märkning med antingen MAP2 eller TAU utföras för att identifiera cellerna som framgångsrikt konverterade och samtidig märkt med proteinet av intresse.
Figur 1: Evolution av i omvandlingen med tiden. (A) tidslinje av experiment och karta över den bygga förpackad i ett lentivirus som används för att omprogrammera vuxna mänskliga dermal fibroblaster. Varje svarta pilen representerar en medellång förändring. (B) representativa fas kontrast bilder som skildrar förändringarna i morfologi av celler under konverteringen mellan dag 0 till dag 22 (som anges i det övre högra hörnet av varje panel). Bilder togs på en fas kontrast Mikroskop med målsättningen 10 X. (C) immunofluorescens bilden av en TAU och MAP2 dubbel färgning på dag 35 efter transduktion. Cellerna var fast i 4% PARAFORMALDEHYD och permeabilized med 0,1% Triton i DPBS för 10 min. celler blockerades i 30 min i en 5% serum lösning i DPBS. Antikropparna var utspädd i blockering lösning och tillämpas över natten vid 4 ° C. Fluorophore-konjugerad sekundära antikroppar var utspädd i blockering lösning och tillämpas för 2 h. celler var counterstained med DAPI för 15 min följt av 3 tvättar med DPBS. Bilder togs på en inverterad fluorescens Mikroskop med målsättningen 20 X. Skala barer = 100 µm (B, C). Förkortningar: ENM: tidig neuronala medium; LNM: sena neuronala medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Denna en-One-Step/one vektor omprogrammering metoden erbjuder ett effektivt sätt att få iNs från mänskliga vuxen fibroblaster. Mänskliga vuxen fibroblaster är normalt mycket svårare att covert än fostrets fibroblaster, med begränsade studier tidigare rapportering effektivitetsvinsterna av cirka 5-10%12,13. Med detta nya protokoll dock det möjligt att uppnå en neuronal avkastning (mätt som MAP2 + celler) av ungefärligt 50%8. Våra protokoll kan dessutom användas på dermal fibroblaster som har blivit överförda flera gånger utan att förlora effektivitet av konvertering. Hittills har vi använt celler anpassade upp till 14 gånger utan att upptäcka någon minskning av verkningsgraden. Dessutom finns det ingen skillnad i omprogrammering effektivitet i våra händer med fibroblaster från givare i ålder mellan 52 och 87. Se referens8för mer information om ålder och sjukdom i andra cellinjer som testade med denna konstruktion. Andra studier har också rapporterat någon skillnad i verkningsgrad med ett lentiviral-baserade och liten molekyl-förbättrade protokoll med givare mellan 0 och 89 år4. Konsekvent tillämpning med miRNA-baserade neuronala omprogrammering har dessutom rapporterats hos fibroblaster i alla åldrar, med givare mellan 0 och 86 år7. Genom denna väg, kan mogna nervceller erhållas i cirka 12-15 veckor in vitro- eller cirka 8 veckor efter transplantation in vivo8. Detta är en fördel eftersom det ger tillgång till både sjukdom och patienten specifika mänskliga iNs från vävnad som är lättillgängligt. Även om detta protokoll är effektiv, det kommer inte att producera en 100% neuronala avkastning, och som sådan ett reningssteg som använder FACS exempelvis krävs.
Det mest kritiska steget inom detta protokoll är viral transduction (protokoll avsnitt 4). Det är avgörande att virus titern är exakt, förutom att ha klädd ett korrekt antal aHDFs för konvertering. Rekommenderade titern för användning med detta protokoll är mellan 4 x 108 och 4 x 109. Använda en titer av något lägre än 1 x 108 skulle inte rekommenderas som att lägga stora mängder virus kommer att vara giftigt för cellerna. Dessutom som fibroblaster börjar covert ins kommer att de bli mer sköra och mottagliga för lyft. Det är viktigt att vara varsam när du byter media som inte att störa cellerna för mycket. Detta kan göras genom att ta bort vätskan långsamt med 1000 µL pipett. Slutligen, när plätering för omprogrammering (protokoll avsnitt 3) är det viktigt att säkerställa en hälsosam fibroblast befolkning innan du börjar ett experiment; Detta indikeras av en cellviabilitet av över 90% med trypan blå färgning. AHDFs bör alltid vara passaged innan den når 95% konfluens.
Om det finns märkbara celldöd innan viral transduktion, inte börjar konvertering: Dubbelkolla att cellviabiliteten är över 90% och att det fanns inga problem med beläggning av plattan. Det förväntas att ha en liten mängd celldöd efter viral transduktion, detta bör dock inte vara betydande. I detta fall bekräfta exakt sådd av 50.000 aHDFs per brunn och kolla virus titern. Om det finns märkbara inkonsekvens mellan brunnar under konverteringen, kontrollera först att varje brunn innehåller en lika stor mängd media och overt avdunstning sker inte vid kanterna (om nödvändigt extra media kan läggas till kanten brunnarna). Alternativt, kontrollera steg 4,4 och lämplig blandning för en homogen suspension när transducing. Det är viktigt att lägga till lentivirus till medium först, innan du lägger till detta i brunnar. Att direkt lägga till lentivirus i brunnar ökar brunn till brunn variabilitet och sannolikt också att vara giftigt för cellerna. Slutligen, Kontrollera alltid att mediet värms till 37 ° C innan du lägger till celler.
Detta protokoll innehåller valfria avsnitt för beläggning villkor för lång sikt kultur av iNs och FACS sortering för att öka neuronal renhet. För experiment vill undersöka funktionell karakterisering av iNs, har ett protokoll för beredning av glas coverslips för elektrofysiologi också tagits med. Konvertering protokollet här är inställd för användning med en 24-bra platta. om så önskas detta kan ändras till en 6 - 12, 48-, plattan med 96 brunnar eller flaskor. I detta fall justera alla volymer till ytan av plattan eller kolven utnyttjas.
Detta protokoll använder uttrycket påtvingad av Ascl1 och Brn2 i kombination med en resten knockdown alla förpackade i en enda vektor8 för att generera iNs av en pan-neuronala fenotyp. Generering av någon gliaceller subtyper med den här metoden har dock inte utvärderats. Denna metod skulle således behöva ändras för användning med andra omplanering faktorer att erhålla subtyp specifika nervceller. Direkta omprogrammering har tidigare visat möjligheten att generera motoriska nervceller, sensoriska nervceller, fotoreceptorer, striatum medellång taggig nervceller och dopaminerga nervceller10,14. Detta kommer att gynna när du undersöker neurologiska sjukdomar i vilka specifika neuronala subtyp påverkas prioriterat, till exempel Parkinsons sjukdom och dopaminerga neuron.
Tills helt nyligen, direkt neurala omplanering tekniken tillät inte för produktion av moduler i ett standardiserat och effektivt sätt — till en nivå som krävs för toxikologi och drug screening analyser i stor skala. Denna nya metod är mycket effektiv och kan användas på fibroblaster som har blivit överförda många gånger, så att det nu tar bort dessa begränsningar och öppnar upp för en lång rad studier, inte bara i en mänsklig neurala system, men också i ett system som kan vara patientens specifika. Enkelheten i denna metod återger i tekniken tillgänglig för alla grupper som vill utföra liknande studier in-house och lätt kan användas inte bara för storskaliga biomedicinska applikationer, såsom drogkontroll och toxikologiska analyser, men också att stödja uppgifter som härrör från djurmodeller och mänskliga besiktning vävnadsprover.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Marie Persson Vejgården för tekniskt bistånd. Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från stiftelsen New York Stem Cell, Europeiska forskningsrådet inom EU: s sjunde ramprogrammet: FP/2007-2013 Neuro Stem Cell reparation (nr 602278) och ERC bidragsavtalet ingen. 30971, Vetenskapsrådet (bidragsöverenskommelse 521-2012-5624, 2016-00873 och 70862601 / Bagadilico), svenska Parkinson Foundation (Parkinsonfonden) och den strategiskt forskningsområde vid Lunds universitet Multipark (tvärvetenskaplig forskning i Parkinsons sjukdom). Janelle Drouin-Ouellet stöds av en kanadensisk institut för hälsa forskning (CIHR) gemenskap (#358492), och Roger Barker stöds av en NIHR Biomedical Research Centre bidrag till de Universitetar av Cambridge/Addenbrooke's Hospital. Malin Parmar är en New York Stem Cell Foundation Robertson utredare. Shelby Shrigley finansieras av Europeiska unionen programmet Horisont 2020 (H2020-behöriga myndigheters-ITN-2015) under Marie Skłodowska-Curie-nätverket för innovativ utbildning och Grant avtal nr 676408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
| Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
| Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
| Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
| Milli-Q Water | Millipore | ||
| Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
| Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
| Neural differentiation medium - NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
| LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
| NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
| db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
| LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
| Reagents for Coatings | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
| Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
| Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
| DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
| Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
| Reagents for Glass Coverslips | |||
| Autoclaved deionized water | |||
| Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
| Ethanol 95% | |||
| Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
| Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
| Reagents for Immunocytochemistry | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
| Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
| Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
| Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| Equipment | |||
| T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
| 1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
| 15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
| Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
| Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
| Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL. | ||
| Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
| Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
| Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
| Parafilm M | VWR | ||
| ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
| CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
| Laminar flow hood | |||
| Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
| Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
| Orbital shaker | |||
| Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
| FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, 170-182 (2016).
- Mertens, J., et al. Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects. Cell Stem Cell. 17, 705-718 (2015).
- Hashizume, O., et al. Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects. Sci Rep. 5, 10434 (2015).
- Lapasset, L., et al. Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state. Genes Dev. 25, 2248-2253 (2011).
- Huh, C. J., et al. Maintenance of age in human neurons generated by microRNA-based neuronal conversion of fibroblasts. Elife. 5, (2016).
- Drouin-Ouellet, J., et al. REST suppression mediates neural conversion of adult human fibroblasts via microRNA-dependent and -independent pathways. EMBO Mol Med. , (2017).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Richner, M., Victor, M. B., Liu, Y., Abernathy, D., Yoo, A. S. MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons. Nat Protoc. 10, 1543-1555 (2015).
- Lau, S., Rylander Ottosson, D., Jakobsson, J., Parmar, M. Direct neural conversion from human fibroblasts using self-regulating and nonintegrating viral vectors. Cell Rep. 9, 1673-1680 (2014).
- Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts. Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).
- Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Masserdotti, G., Gascón, S., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: learning from and for development. Development. 143, 2494-2510 (2016).
- Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain. Sci Rep. 4, 6330 (2014).
