病原性タンパク質凝集体がプリオンのようなプロパティを持つセルの間に広がって神経変性疾患に関連する考えを支持する証拠を蓄積します。ここでは、モデル生物、ショウジョウバエのプリオンのような骨材の細胞-細胞拡散の可視化を可能にする手法について述べる。
ほとんどの神経変性疾患、アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの中枢機能が蛋白質の集計です。異常な蛋白質の集合、通常生体のホメオスタシスを混乱させる正確なメカニズムは知られていないが、タンパク質凝集体が密接に関連付けられてこれらの疾患の神経病理学。データを新たな広告、PD、HD でその病原性骨材仮説のための強力なサポートを提供し、ALS プリオンは、タンパク質だけ感染性病原体伝染性海綿状脳症の責任は、多くの類似点があります。プリオンは自己テンプレートによって集約表現の広がりを引き起こす同じ蛋白質のネイティブに折り返されているバージョンの変換を複製します。どのようにプリオンとプリオン様タンパク質の広告、PD、HD、および ALS 1 つのセルから別への移行が強烈な調査の領域では現在。ここでは、HD に関連する変異ハンチンチン (Htt) 集計のプリオンのような細胞間伝達の監視を許可するショウジョウバエモデルを説明します。このモデルは多くの異なるショウジョウバエのティッシュの遺伝子発現を操作するための強力なツールを活用して、直接変異 Htt 骨材のプリオンのような転送を報告する蛍光タグ細胞質蛋白質を利用しています。重要なは、我々 はここで説明するアプローチは、新規遺伝子および蛋白質集積体はさまざまな細胞のタイプの生体間の広がりを仲介する経路を識別するために使用できます。これらの研究から得られる情報は、神経変性疾患の根底にある、治療的介入のための新しい機会を明らかにする病原性のメカニズムの限られた理解を拡大します。
プリオン仮説では、感染性病原体 (例えばヒトのクロイツ フェルト ・ ヤコブ病、スクレイピー羊、鹿、ヘラジカ、慢性消耗性疾患や牛の「狂牛病」の伝達性海綿状脳症を担当) 蛋白質と核酸1を欠いているだけで構成されています。プリオン病の細胞プリオンタンパク質 (PrPC) ではネイティブではない、安定した倍 (PrPSc) 高ベータ版シートが豊富な自己に変換し、安定したアミロイドに単量体の PrPC分子を募集を反映することを前提としています集計します。PrPSc集合体は、生物に異なる細胞の間とも個々 の生物2を広げるためこの自己複製機構を使用します。
タンパクはまたほとんどの神経変性疾患 (アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、(HD)、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)) の中央特徴3。これらの疾患の内、または極細胞集計タンパク質複合体の形成は時間5,細胞毒性4と脳を高い再現性で疾患固有のパスに沿って進行と密接に関連6。 普及のこれらのパターンはプリオンのような性質があるこれらの疾患に関連付けられている病原性の骨材をお勧めします。広告に関連付けられている集計のプリオンのような伝達のための強力なサポートが今存在する PD、HD、および ALS – 彼らは細胞間およびテンプレート以前影響を受けない細胞7、同じ蛋白質の単量体の形態の構造変化から広がる 8。
集計は、ナイーブ細胞の細胞質に転送場所細胞外スペースから、またはから別のセルの哺乳類の細胞培養モデルを使用して実行された日付にタンパク質凝集体のプリオンのような広がりを調査し、研究の大半細胞質9,10、11,12,13,14,15、または骨材含有材料をマウスの脳に注入し、監視インジェクション サイト16,17,18,19,20,21,22,の外の出現を集計23. 最近では、トランスジェニック動物の細胞内凝集体は、そのまま脳24,25,26,27、内の他のセルに広がったことを示すに使用されています。 28,29,30。ここでは、ショウジョウバエのまま脳の個々 のセルの間の転送の直接可視化の手法について述べる。HD/ポリグルタミン (polyQ) 症ショウジョウバエモデル最初ほぼ二十年前に開発された31,32これらの疾患の根底にある病原性のメカニズムに多くの非常に貴重な洞察力を提供しています。33. HD はタンパク質 huntingtin (Htt)34をコードする遺伝子の常染色体の優性突然変異によって引き起こされる継承した神経変性疾患。この突然変異の結果、polyQ ストレッチの病原性のしきい値を超えて Htt の N 末端付近の展開 〜 37 glutamines、ミスフォールドタンパクし集計35,36タンパク質を引き起こしています。野生型 Htt 蛋白質を含む < このストレッチで 37 glutamines そのネイティブの倍を実現するに誘導することができます、Htt 集計「シード」12,27,37直接物理的な接触時に集計。このエネルギーは、プリオンのような転送用読み出しとして野生型 Htt の核の集約と変異 Htt 集計元の他のセルの細胞内のエントリを利用します。
プリオンのような集計でメカニズムを決定する細胞間の旅行は難治性神経変性疾患の新たな治療標的の同定に します。我々 は、迅速なライフ サイクルの利点は、使いやすさと変異 Htt 集計の細胞間伝播の分子メカニズムを定義するショウジョウバエの遺伝学的トレーサビリティを取る。私たちの実験的戦略では、ショウジョウバエ、老舗 Gal4 固有上流活性化シーケンス (Gal4 UAS) システム38および最近開発された QF 擬システム39で利用可能な 2 つの二項式システムを採用しています。これらの 2 つの独立したシステムを結合には、同じフライ40内の異なる細胞集団に突然変異体と野生型の Htt 遺伝子の表現を制限することができます。このアプローチを使用して、集約の状態に前もって形成された変異体 Htt と物理的に接触の直接の結果、通常拡散反射光の可溶性の状態から細胞質の野生型 Htt の再分配を監視することによって変異体 Htt の広がっているプリオンのようなを調べた「seed」を集計生化学的変異 Htt 野生型 Htt の転換を確認ことができますまたは蛍光共鳴エネルギーなどの蛋白質蛋白質の相互作用の報告生物物理技術移転 (FRET)9,27,41.
重要なは、我々 も多数の遺伝子やタンパク質凝集体のプリオンのような広がりを仲介する経路を識別するためにショウジョウバエの遺伝的ツールにアクセスできます。我々 は最近細胞表面のスカベン ジャー受容体、ドレーパー42,43,ショウジョウバエ中心部の近くに貪食グリアに神経細胞の軸索から突然変異体 Htt 集計を転送するのに重要な役割を明らかにするのにこのアプローチを使用しています。神経系 (CNS)27。したがって、ここで述べる遺伝とイメージング ベースのアプローチは、使用する簡単な強力なモデル生物、ショウジョウバエが病気に関連する現象についての重要な基本的な生物学的情報を表示できます。
神経変性疾患の患者数は増加し続けているより良い治療法を開発することができますので、これらの疾患の病態の理解を高めるための緊急の必要性があります。ここでは、監視モデル生物、ショウジョウバエの異なる細胞型の間の病原性タンパク質凝集体のプリオンのような通信を可能にする方法をについて説明します。最近、突然変異体 Htt 集計生体内でのプリオンのような?…
The authors have nothing to disclose.
これらのメソッドの開発の間に多くの役に立つ議論の Kopito、羅、ピアースのラボのメンバーに感謝いたします。我々 はまた、この原稿の批判的読解のブライアン Temsamrit を感謝します。この作品は、大学科学大戦スミスの公益信託からの資金によって支えられました。
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
LAS X image analysis software | Leica | ||
Imaris image analysis software | Bitplane |