Summary
病原性タンパク質凝集体がプリオンのようなプロパティを持つセルの間に広がって神経変性疾患に関連する考えを支持する証拠を蓄積します。ここでは、モデル生物、ショウジョウバエのプリオンのような骨材の細胞-細胞拡散の可視化を可能にする手法について述べる。
Abstract
ほとんどの神経変性疾患、アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの中枢機能が蛋白質の集計です。異常な蛋白質の集合、通常生体のホメオスタシスを混乱させる正確なメカニズムは知られていないが、タンパク質凝集体が密接に関連付けられてこれらの疾患の神経病理学。データを新たな広告、PD、HD でその病原性骨材仮説のための強力なサポートを提供し、ALS プリオンは、タンパク質だけ感染性病原体伝染性海綿状脳症の責任は、多くの類似点があります。プリオンは自己テンプレートによって集約表現の広がりを引き起こす同じ蛋白質のネイティブに折り返されているバージョンの変換を複製します。どのようにプリオンとプリオン様タンパク質の広告、PD、HD、および ALS 1 つのセルから別への移行が強烈な調査の領域では現在。ここでは、HD に関連する変異ハンチンチン (Htt) 集計のプリオンのような細胞間伝達の監視を許可するショウジョウバエモデルを説明します。このモデルは多くの異なるショウジョウバエのティッシュの遺伝子発現を操作するための強力なツールを活用して、直接変異 Htt 骨材のプリオンのような転送を報告する蛍光タグ細胞質蛋白質を利用しています。重要なは、我々 はここで説明するアプローチは、新規遺伝子および蛋白質集積体はさまざまな細胞のタイプの生体間の広がりを仲介する経路を識別するために使用できます。これらの研究から得られる情報は、神経変性疾患の根底にある、治療的介入のための新しい機会を明らかにする病原性のメカニズムの限られた理解を拡大します。
Introduction
プリオン仮説では、感染性病原体 (例えばヒトのクロイツ フェルト ・ ヤコブ病、スクレイピー羊、鹿、ヘラジカ、慢性消耗性疾患や牛の「狂牛病」の伝達性海綿状脳症を担当) 蛋白質と核酸1を欠いているだけで構成されています。プリオン病の細胞プリオンタンパク質 (PrPC) ではネイティブではない、安定した倍 (PrPSc) 高ベータ版シートが豊富な自己に変換し、安定したアミロイドに単量体の PrPC分子を募集を反映することを前提としています集計します。PrPSc集合体は、生物に異なる細胞の間とも個々 の生物2を広げるためこの自己複製機構を使用します。
タンパクはまたほとんどの神経変性疾患 (アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、(HD)、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)) の中央特徴3。これらの疾患の内、または極細胞集計タンパク質複合体の形成は時間5,細胞毒性4と脳を高い再現性で疾患固有のパスに沿って進行と密接に関連6。 普及のこれらのパターンはプリオンのような性質があるこれらの疾患に関連付けられている病原性の骨材をお勧めします。広告に関連付けられている集計のプリオンのような伝達のための強力なサポートが今存在する PD、HD、および ALS - 彼らは細胞間およびテンプレート以前影響を受けない細胞7、同じ蛋白質の単量体の形態の構造変化から広がる 8。
集計は、ナイーブ細胞の細胞質に転送場所細胞外スペースから、またはから別のセルの哺乳類の細胞培養モデルを使用して実行された日付にタンパク質凝集体のプリオンのような広がりを調査し、研究の大半細胞質9,10、11,12,13,14,15、または骨材含有材料をマウスの脳に注入し、監視インジェクション サイト16,17,18,19,20,21,22,の外の出現を集計23. 最近では、トランスジェニック動物の細胞内凝集体は、そのまま脳24,25,26,27、内の他のセルに広がったことを示すに使用されています。 28,29,30。ここでは、ショウジョウバエのまま脳の個々 のセルの間の転送の直接可視化の手法について述べる。HD/ポリグルタミン (polyQ) 症ショウジョウバエモデル最初ほぼ二十年前に開発された31,32これらの疾患の根底にある病原性のメカニズムに多くの非常に貴重な洞察力を提供しています。33. HD はタンパク質 huntingtin (Htt)34をコードする遺伝子の常染色体の優性突然変異によって引き起こされる継承した神経変性疾患。この突然変異の結果、polyQ ストレッチの病原性のしきい値を超えて Htt の N 末端付近の展開 〜 37 glutamines、ミスフォールドタンパクし集計35,36タンパク質を引き起こしています。野生型 Htt 蛋白質を含む < このストレッチで 37 glutamines そのネイティブの倍を実現するに誘導することができます、Htt 集計「シード」12,27,37直接物理的な接触時に集計。このエネルギーは、プリオンのような転送用読み出しとして野生型 Htt の核の集約と変異 Htt 集計元の他のセルの細胞内のエントリを利用します。
プリオンのような集計でメカニズムを決定する細胞間の旅行は難治性神経変性疾患の新たな治療標的の同定に します。我々 は、迅速なライフ サイクルの利点は、使いやすさと変異 Htt 集計の細胞間伝播の分子メカニズムを定義するショウジョウバエの遺伝学的トレーサビリティを取る。私たちの実験的戦略では、ショウジョウバエ、老舗 Gal4 固有上流活性化シーケンス (Gal4 UAS) システム38および最近開発された QF 擬システム39で利用可能な 2 つの二項式システムを採用しています。これらの 2 つの独立したシステムを結合には、同じフライ40内の異なる細胞集団に突然変異体と野生型の Htt 遺伝子の表現を制限することができます。このアプローチを使用して、集約の状態に前もって形成された変異体 Htt と物理的に接触の直接の結果、通常拡散反射光の可溶性の状態から細胞質の野生型 Htt の再分配を監視することによって変異体 Htt の広がっているプリオンのようなを調べた「seed」を集計生化学的変異 Htt 野生型 Htt の転換を確認ことができますまたは蛍光共鳴エネルギーなどの蛋白質蛋白質の相互作用の報告生物物理技術移転 (FRET)9,27,41.
重要なは、我々 も多数の遺伝子やタンパク質凝集体のプリオンのような広がりを仲介する経路を識別するためにショウジョウバエの遺伝的ツールにアクセスできます。我々 は最近細胞表面のスカベン ジャー受容体、ドレーパー42,43,ショウジョウバエ中心部の近くに貪食グリアに神経細胞の軸索から突然変異体 Htt 集計を転送するのに重要な役割を明らかにするのにこのアプローチを使用しています。神経系 (CNS)27。したがって、ここで述べる遺伝とイメージング ベースのアプローチは、使用する簡単な強力なモデル生物、ショウジョウバエが病気に関連する現象についての重要な基本的な生物学的情報を表示できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. カップリングショウジョウバエの Htt 遺伝子発現により媒介 Gal4 と QF
- 収集および/または組換えショウジョウバエを生成組織固有 Gal4 または QF「ドライバー」を含む行として野生型や突然変異体 Htt 遺伝子下流 Gal4 UAS38の QF 擬39を含む行。確実にこれらの遺伝子から発現するタンパク質蛍光タンパク質融合またはエピトープ タグ同じフライの突然変異体と野生型の Htt 遺伝子製品の差別化を可能にします。図 1を参照してください。
注: 我々 は通常人間の Htt 遺伝子27のエクソン 1 フラグメントを使用します。ただし、遺伝子組換えハエは、必要な場合に長い Htt フラグメントまたは他の遺伝子を表現する代わりに生成できます。 - Htt 遺伝子の突然変異体と野生型は別個の重複の細胞集団で表現されますような遺伝的戦略を計画してください。
- 式重複が発生した場合、同じ細胞の突然変異体と野生型の Htt 蛋白質は共同集計して、プリオンのようなイベントの検出を防ぐため。この問題を回避を使用 Gal4 と QF 特定リプレッサー、Gal80 と QS40、それぞれ (図 1)。発達制御 Gal4 や QF ドライバーを選択することができます制限変異体 Htt の式可能性を排除後分裂期の細胞分裂に助けかもしれない拡散に貢献セルに集計。
- 標準的な培養条件を使用して、突然変異体「ドナー」に QF (または Gal4) 経由で Htt セル人口と野生型「受信者」の Gal4 (または QF) 経由で Htt セル人口を表す子孫を生成するハエを仲間します。可能な遺伝子の組み合わせを示す回路図は、図 1を参照してください。
注:、前文書27に図 1-4に示すデータの生成に使用された QF と Gal4 ドライバー DA1 嗅覚受容ニューロン (ORN) ドライバー、レポ Gal4 と Or67d-QF パン グリアのドライバーがあります。 - 並行して両方の QF と Gal4 標識細胞数の野生型 Htt を表すコントロール ハエを生成します。
- 目的遺伝子の子孫を収集し、適切な動物の年齢します。
図 1.QF 擬、Gal4 UAS のバイナリ表現システムを使用して突然変異体と野生型の Htt 遺伝子の結合式に対する遺伝的アプローチします。ある QF ドライバーを使用して病原性長さ polyQ ストレッチ (Q91) が含まれているタグ付きの mCherry 突然変異体 Htt 蛋白質を表現「セルには、」組織固有のプロモーター、(「PA」) の下流。「セル B、」通常 polyQ ストレッチ (Q25) を含む YFP タグ野生型 Htt は組織固有のプロモーター B (「PB") によって制御される Gal4 ドライバー経由で表されます。図 2-4に Or67d QF は、DA1 ORNs で擬 HttQ91 mCherry 式を運転する使用され、レポ Gal4 すべてグリア27UA HttQ25 YFP を表現するため。重要なは、HttQ91 mCherry は遺伝子の上流側に配置擬順序のおかげで QF 発現細胞でのみ表されます。同様に、HttQ25 YFP は UAS を特異的に認識する Gal4 を介してのみ表現されます。QF Gal4 ドライバーの組織分布の任意の重複が検出された場合エンコード Gal4 発現細胞で、QS と Gal80 QF 発現細胞で遺伝子を導入できます。イメージングと適切なドナー/アクセプターのペア (例えばCFP/YFP または YFP/mCherry) 間フレットを測定する能力の中に 2 つの蛋白質の分化野生型と変異体 Htt に蛍光タンパク質タグを追加することが可能です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
2. マイクロ郭清と大人のショウジョウバエ脳の固定
注: この術前文書44から変更されているし、Htt 蛍光タンパク質融合からの画像の直接蛍光信号を脳を準備する使用ことができます。脳免疫染色を行うことができます手順への変更は、次のセクションで説明します。
- 次の資料を収集し、氷の場所: 0.03% を含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS/T); トリトン X-100遠心チューブ 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 固定液 200 μ L の 20% を追加することによって準備の含んでいる 970 μ 770 μ L に PFA PBS/T;井戸を含む明確なガラス皿使い捨てのピペットです。2 つの解離性の鉗子 (1 番 3、1 番 5)。
- CO2を使用して大人のハエを麻酔、氷の上のガラスの皿の 1 つも。
- 少量の追加、ピペットを使用して (~ 500 μ L) も含む空井戸としてハエを同様に冷たい PBS/T の。彼らは解剖を妨げることができるとあまりにも多くの気泡を導入することは避けてください。
- 解剖顕微鏡の下の平らな面にガラスの皿を置き、フォーカスで、ビューのフィールドを塗りつぶしますハエの体内まで倍率を調整します。
- 光はガラス皿の両側を照らしているようにグースネック光源のペアを配置します。解剖中の体パーツ/キューティクルを破棄するガラス皿の下で折られたラボ組織を固定します。
- 第 3 鉗子を使用すると、非利き手で、腹側を上に、腹部のホールドをつかんで飛ぶも含む PBS/t. 固定に 1 つのフライを転送します。
- PBS/T で完全に水中に沈むフライを維持し、利き手で第 5 鉗子でハエの頭を削除します。フライのヘッドの片側にテングに隣接する小さなスペースでキューティクルの下でこの鉗子の先端を挿入します。両側から目のホールドをつかむ鉗子をつまんで頭にグリップを確保します。
- 2 つの鉗子を離れて引いてその体からフライのヘッドを取り外します。近くに配置されているラボ組織上飛行体の処分。フライの頭が失われないので、利き手で鉗子の圧力を維持します。
- 非利き手の第 3 鉗子の位置の 1 つのヒントは、テングの反対側にキューティクルの同じ小さなスペースで手します。一度に位置は、頭の両側に同じ場所で目をグリップに鉗子をピンチします。
- キューティクルのグリップが安全で、一度軽く引き離す鉗子 180 °。このアクションが空中分解ヘッドのキューティクル、脳を損傷することがなく。ラボ組織上キューティクル残渣を破棄します。
- 理想的な頭のキューティクル完全削除できません 1 つのステップ。この場合、脳は完全にさらされるまで、キューティクルの各作品を削除します。鉗子との直接接触を避けることによって脳に損傷を与えないように注意してください。
- 接続されている気管のグラブ ahold または毛管作用によって鉗子先端間の空間に脳を吸引によって PBS/T から切り裂かれた脳を削除します。
注: 気管除去はオプションでそれは我々 が通常イメージ脳の前部表面に触角葉をあいまいにする傾向があります。ただし、画像と干渉して、気管場合、それらを削除慎重に脳はこの操作によって破損していないので。 - ハエの脳を氷に固定液を含むマイクロ遠心チューブ用のいずれかに転送します。脳が鉗子からデタッチし、固定液に浸漬を確保します。
- 一度すべて脳の解剖はの nutator に閉じた管を置くことによって「短い修正」にそれらを服従 〜 暗闇の中で部屋の温度で 5 分間。
メモ: この短い固定ステップは、脳は以降の手順で扱いやすいと遠心チューブの側面に準拠していないことを確認します。 - P1000 ピペットと固定液の大部分を削除し、それを破棄します。
- これと、その後洗浄ステップ中にチューブから脳を吸引を避けます。P1000 を (例えば、650 μ L) の音量に設定し、2 つの手順で上清を削除します。さらに、脳をうまく視覚化に吸引しながら光源 (例えば天井の照明) に伴いマイクロ遠心チューブ用を保持します。
- 脳に新鮮な PBS/T の 1 つの mL を追加します。すぐに洗って (< 1 分)、暗闇の中、脳から上清を吸引し、破棄します。
- 次のスケジュールによると室温で暗闇の中で PBS/T と洗濯を繰り返す: 2 のクイック (< 1 分) 洗浄、1 × 5 分、3 X 20 分、1 X 1 h 洗浄。マイクロ遠心チューブ用のトップをセキュリティで保護し、洗浄の間に nutator のチューブを配置します。
- DAPI 染色が必要な場合 PBS/T で希釈した 250 ng/ml の DAPI 1 X 30 分インキュベーションと最終的な 1 h 洗浄置換続いて 2 クイック X と 1 X 20 分洗浄します。
- 最後の洗浄後、脳を邪魔しないように世話洗浄バッファー清の大半を削除し、脳へ antifade 試薬のグリセリン ベースの 30 μ L を追加します。少なくとも 1 h、24 h の動きなしで暗闇で 4 ° C で孵化させなさい。
3. 染色大人の頭脳のセクション 2 に変更
注: が弱い蛍光蛍光タンパク質融合、非蛍光性タンパク質のイメージングのためにこのプロトコルを使用します。
- PBS/T でトリトン X-100 の濃度を 10 倍増やす (PBS + 0.3% トリトン X-100) すべてのステップのため。これにより、細胞膜を permeabilize し細胞内スペースにアクセスするための抗体を許可する十分な洗剤があります。
- 4% で脳を修正 PBS/T 室温で 20 分間で PFA。
- 洗浄のすべてを実行した後は、暗闇の中で部屋の温度で 30 分間出来立てのブロック バッファー (PBS/T + 5% ヤギ血清 (NGS)) で脳を孵化させなさい。
- 削除し、ブロック バッファーを破棄します。チューブ マスター ミックスとして新鮮なブロック バッファーに適切な一次抗体を希釈した一次抗体溶液 0.5 mL を追加 (一般的に使用される抗体の希釈材の表を参照)。暗闇の中で 4 ° C で 24 時間、少なくとも nutator の一次抗体の脳を孵化させなさい。
- 一次抗体のソリューション、P1000 を使用して脳から削除し、新鮮なチューブで予約します。脳を洗浄する PBS/T の 1 つの mL を追加します。
注: 予約された一次抗体溶液は 4 ° C で最大 4 週間以内に格納できます。我々 が正常に一次抗体まで 2 回でリサイクル以降実験。 - すぐに脳を洗って (< 1 分) PBS/T で脳から上清を吸引し、破棄します。もう一度この迅速に洗浄を繰り返します。
- 次のスケジュールによると室温で 1 mL の PBS/T で洗濯を続ける: 1 X 5 分、3 X 20 分、1 X 1 h 洗面。マイクロ遠心チューブ用のトップを保護し、洗浄中に、nutator のチューブを配置します。
- 最後の洗浄後 PBS/T 上清の大半を削除し、マスター ミックスとして新鮮なブロック バッファーに適切な抗体を希釈した二次抗体溶液 0.5 mL を追加 (よく使用される抗体の材料表を参照してください。および希薄)。暗闇の中で 4 ° C で 24 時間の二次抗体頭脳を孵化させなさい。
- 二次抗体の孵化後、3.5、3.6、3.7 の手順で洗浄手順を繰り返します。
- 最終的な洗浄後洗浄バッファーの大半を削除し、管の下部にすべての脳にあることを確認してください。脳に 30 μ L antifade 試薬を追加します。16-24 h の動きなしで暗闇で 4 ° C で孵化させなさい。
4. 全脳取付
- 解剖顕微鏡および識別情報をラベルの下でガラス顕微鏡スライドを配置します。
注: また、脳がイメージ投射の間、脳の両側にアクセスするカバー ガラスに直接装着できます。この取付手順を記述するプロトコルは、以前に公開された45をなっています。 - 鈍化のピペット チップを使用して各微量遠心チューブから脳を削除 (下部を削除するかみそりの刃を使用して準備 〜 1-200 μ L の先端から 1 cm) してスライドの中央に移転します。可能な限り頭脳を持つ小さな antifade 試薬として転送します。
- 鉗子を使用して、希望する方向 (例えばスライド イメージング触角葉の前方の面の上部に向かって指して背側) で脳を配置します。脳を方向づけるときそれらをイメージングに使用される顕微鏡の光路を検討してください。
- 脳を乱すことがなく折り返しラボ組織の先のとがった角を使ってスライドから過剰な antifade 試薬を削除します。座ってスライドを聞かせて 〜 スライドに準拠する脳を許可する暗闇の中で 5-10 分。
- カバー ガラスは正方形を形成する脳の両側に配置の 4 つの小さな断片とハエの脳を囲む 〜 19 mm × 19 mm ガラスのこれらの小さな作品の 1 つの外にちょうど 22 mm × 22 mm 号 1.5 カバー ガラスの一方の端を配置。、脳橋マウントを完了する上、coverslip ゆっくりと下げます。
- ゆっくりと、coverslip または頭脳の邪魔にならないように注意しながら、coverslip の下の表面に合わせて新鮮な antifade 試薬を分注します。任意の余分な antifade、coverslip に直接接続せず折り畳まれたラボ ティッシュの先のとがった角を使用して拭き取ってください。
- カバーガラスの 4 つのコーナーのそれぞれに明確な速乾マニキュアのドロップを追加します。乾燥することができます 〜 10 分。完全に脳を囲むマニキュアとカバーガラスの 4 つのエッジを封印します。
- すぐに、脳を画像か準備ができるまで 4 ° C で保存します。
- Htt 蛍光タンパク質融合から本質的な蛍光イメージングは場合、は、最高の信号 24 h 内で脳をイメージします。
5. イメージングと骨材のプリオンのような伝送を定量化
- 共焦点顕微鏡 40 X または石油目的 X 60/63 の装備選択した Gal4 と QF ドライバーを表現した脳の領域を通って z スライス画像を収集する (図 2A、B) を使用してマウントされた脳をイメージします。
- 蛍光タンパク質融合や適切なレーザーを用いたカルビンディン抗体タンパク質を刺激 (例えば、488 nm mCherry/Cy3 の GFP/YFP/FITC または 552 nm)。最大蛍光をキャプチャ設定検出 windows どちらかスペクトル検出システムを使用してチャンネル クロストークを排除しながら信号を渡したりバンド/長い放出フィルター各 fluorophore の特定。
注: は、タンパク質凝集体のイメージングに気配り。特により大きな凝集体で、飽和状態になる各骨材センター内のピクセルは簡単です。画像の彩度を最小限に抑えるが小さく集約された種 (図 2B, C, D) から信号を失うことのリスクを認識しようとします。あまり彩度は、孤立点を識別することが難しく、画像の背景を増加します。各データ セットで最終的な画像を撮る前に最適化するためにさまざまなイメージング設定をテストします。
- 蛍光タンパク質融合や適切なレーザーを用いたカルビンディン抗体タンパク質を刺激 (例えば、488 nm mCherry/Cy3 の GFP/YFP/FITC または 552 nm)。最大蛍光をキャプチャ設定検出 windows どちらかスペクトル検出システムを使用してチャンネル クロストークを排除しながら信号を渡したりバンド/長い放出フィルター各 fluorophore の特定。
- いずれか各 z スライス (例えば、Cの図 2と図 4A) または 3 次元 (図 3の共焦点のスライスをレンダリングした後に移動することによって手動で個々 の涙点を定量化することでデータを分析します。A、B)
注: これは、イメージ J や他の画像処理ソフトで行うことが。- 凝集体が十分に分離、最小限の背景の蛍光性、画像解析ソフトを使用して体系的に特定、定量化、および明確な「オブジェクト」または「表面」3 D 共焦点スタック (復興として集計、分析図 3B)。
注: 記載されているソフトウェア操作、計測器およびここで使用されるソフトウェアに固有 (材料の表を参照してください)。- 3 D 表示モードで共焦点 z シリーズを視覚化します。「分析」ウィザードを使用すると、選択したチャネル (例えば図 3HttQ91 mCherry の赤のチャネルの集計) で個々 のスポットを識別します。イメージ内の個々 のオブジェクトとして不均一サイズすべての集計を正確に表現するためのフィルターのしきい値を調整します。
- フィルターの下に"バイナリ処理前"が異常にソフトウェア アルゴリズムによってマージされる密接に関連する集計を分離する「オブジェクトを分割」を有効にします。オブジェクトとその関連する測定結果の合計数が「測定」の下で報告されることに注意してください
注: アミロイド凝集のセンターは抗体を通さないので、変異 Htt 集計の定量化法は免疫染色プロトコルに従うありません。その結果、凝集体はリングのような構造として顕微鏡に表示され、画像解析ソフトウェアは正確に識別し、これらの個々 の「スポット」を区別することができます。
- 手動で z スタックを介して移動して、得点野生型 Htt 集計、集計ダブル-得点している 1 つ以上である場合を確かめて野生型 Htt 集計を定量化するスライス (図 4A)。
注: 各共焦点スタックの集計の数は、合理的な (例えば20-50) ときは、このマニュアルの定量化手法を使用できます。画像解析ソフトは同じチャネルを (例えば、周辺細胞のびまん性の野生型 Htt から信号) で周辺の信号から個々 の点を区別できないときも便利です (図 2B, Cおよび図 4A). 野生型 Htt 集計を定量化することができますも挑戦する点状 (例えば、細胞プロセスおよびシナプス) 脳の多くの通常の構造が表示されるため。野生型と変異型の Htt 信号の共局在; 選択基準として使用できます。ただし、いくつかの突然変異体の Htt「種」は、共焦点の検出限界を下回るは不可能です。受信者の細胞 (例えばGFP) で集計されない Htt 以外のタンパク質は、脳に関係のない点状表層構造のラベルに使用できます。
- 凝集体が十分に分離、最小限の背景の蛍光性、画像解析ソフトを使用して体系的に特定、定量化、および明確な「オブジェクト」または「表面」3 D 共焦点スタック (復興として集計、分析図 3B)。
- 画像解析ソフトを使用すると、さらに個別集計の評価を実行できます。たとえば、集計 (図 3C)、突然変異体と野生型 Htt タンパク質 (図 4A) のパーセントの共局在のサイズ分布を決定またはフレット (を用いたタンパク質間相互作用の直接測定図 4B)。
- 特定のチャネルにすべての表示されている集計を正確に識別するスポットまたは表面の検出アルゴリズムを使用して個々 の点のサイズ分布を決定します。スポットまたはサーフェスに関連する寸法を画像解析ソフトを使用して、たとえば (図 3 C)、'ボリューム'、'集計直径' を得るまたは 5.2.1 の手順に従ってソフトウェアの「分析」ウィザードで '測定' から '強度' 情報。
メモ:図 3Cで単一 DA1 糸球体で識別されるすべての HttQ91 mCherry 涙点の直径の分布を報告します。 - 共焦点 z スタック (最も正確な方法) を介してスライスを手動で移動することによって HttQ25 YFP と HttQ91 mCherry 集計パーセントの共局在を決定します。ただし、任意の集計を 2 回当てにしない注意してください。これを防ぐためには、焦点の平面が集計 (図 4A) の中心を通る場合のみ特定の z スライスでの集計をカウントします。
- コードして, HttQ91 mCherry 信号のアクセプター フォトブリーチング法による誘導 HttQ25 YFP 集計の FRET 効率を計算します。
- まず、他のチャンネルで信号が生成 mCherry のみ、YFP 専用の信号のための検出窓を確立することによって YFP と mCherry チャンネル間の潜在的なクロストークを排除します。これらの設定を使用して、'イメージ' 個々 の HttQ25 YFP 涙点とその関連付けられた HttQ91 mCherry 信号 (図 4B) の前に。
- その後、photobleach、mCherry は、赤色レーザーを調整することによって信号 (例えば、552 nm) 100% の照度と信号がなくなるまでのスキャンに。'前の画像、' に、と同じ涙点 (図 4B) の '後イメージ' を取るに使用される設定に戻ります。
- 前に、画像解析ソフトを使用して退色後各涙の蛍光強度測定を計算します。
- YFP ドナー蛍光の測定を引いて FRET 効率を計算、'イメージ' の前に (YFP初期) '後イメージ' に YFP ドナー蛍光から (YFP最終)。YFP最終でこの値を割り、100 を掛けます。
注: ピクセル単位でまたは (図 4B) の各 HttQ25 YFP 集計全体、FRET 効率を計算できます。受容体の退色は FRET 効率の計算各 HttQ25 YFP 涙に関連付けられている mCherry 信号が十分に高い検出 YFP は、mCherry 退色後の dequenching を生成するときに特に便利な方法です。
- 特定のチャネルにすべての表示されている集計を正確に識別するスポットまたは表面の検出アルゴリズムを使用して個々 の点のサイズ分布を決定します。スポットまたはサーフェスに関連する寸法を画像解析ソフトを使用して、たとえば (図 3 C)、'ボリューム'、'集計直径' を得るまたは 5.2.1 の手順に従ってソフトウェアの「分析」ウィザードで '測定' から '強度' 情報。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここで説明する方法は、そのままフライ中枢神経系内の別の 1 つのセルの人口から Htt タンパク質凝集体のプリオンのような転送を示す堅牢なデータを生成します。点状に拡散反射光から野生型 Htt の変換は、この YFP 融合タンパク質の直接蛍光 HttQ91 mCherry ドナー ORNs (A ~ Cの図 2と図 4A, B) に式の結果として受信者のグリア細胞で観察されます。これら 2 つの細胞集団間のプリオンのような転送イベントの正確な報告トランスジェニック ハエや間に重なることがなく突然変異体と野生型の Htt 遺伝子の強い表現レベルを生成する Gal4/QF ドライバーの慎重な選択が必要です。開発または成人期に。さらに、蛍光タンパク質 Htt 融合遺伝子の考え抜かれた設計は、強力なダウン ストリーム解析を有効にできます。変異体と野生型 Htt 集計をすることができますたとえば、定量化点状オブジェクトとしてどちらか手動で (図 2Cと図 4) または測定することができる画像解析ソフト (図 3a, B) を使用して、特徴として集計人口 (図 3C) さらに、変異体と野生型蛋白質 (図 4A) の間の共局在の評価することができ。、フレット27 (図 4 を分析することができます。 B)。これらの分析を必要とする間ドナーとアクセプターのペア (例えばCFP/YFP9フレットを有効にする蛍光タンパク質タグ十分に分離された蛍光特性が十分なスペクトル重複する突然変異体と野生型の Htt の融合または YFP/mCherry27)。
図 2.神経 HttQ91 mCherry 集計によってグリア HttQ25 YFP のプリオンのような変換の共焦点画像。(A) 最大強度投影の ~ HttQ91 mCherry を表現する男性のはえから (赤) DA1 ORN 軸索レポ Gal4 を使用してグリア細胞で Or67d QF と HttQ25 YFP (緑) を使用して 1 つの触角葉を示すスライスの 30 μ m。触角葉と DA1 糸球体、DA1 ORN 軸索が終了のおおよその境界線は、それぞれ点線および実線の線で示されます。(B) 最大強度投影から 〜 20 μ m 単一 A. (C) A の 0.35 μ m 共焦点スライス単一 HttQ25 YFP 涙点とその関連付けられた HttQ91 mCherry 信号 (表示から DA1 糸球体領域の拡大ビューを表示スライスの各チャンネルの矢印によって示されます)。赤のチャネルの信号は、HttQ25 YFP と HttQ91 mCherry 信号との間の共局在を視覚化する強化されました。すべての画像は、40 X 1.4NA 油目的に買収されました。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.DA1 ORN 軸索内 HttQ91 mCherry 集計の三次元解析します。Or67d QF 同じ図 2Bに示すようにデータを使用してを介して DA1 糸球体で表現 HttQ91 mCherry 集計の (A) 3 D 描写です。A (B) 個々 のオブジェクトや画像解析ソフトウェア パッケージを使用して (A) の生のデータから識別の「スポット」を示すスクリーン ショット。ソフトウェアには、このチャネル/イメージの様々 なサイズの 56 オブジェクトが識別されます。(B) の矢印で示されるスポットの直径を持っている測定 〜 1.2 μ m 矢印ポイント所場所 2 つのオブジェクトが正確にない一つの場所に個々 の涙点の近接可能性がありますソフトウェアによって。ソフトウェアでこれを克服するために異なるしきい値設定をテストする必要がありますおよび/または結合されたスポットを指定する手動で可能であれば。スケール バー = 10 μ m 径の分布を示す (C) ヒストグラム測定ソフトウェアによって HttQ91 mCherry (B) に示すように「スポット」。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.共局在とフレットの解析による HttQ25 YFP 凝集体。4 個別 0.35 μ m 共 z スライス DA1 ORNs レポ Gal4 を使用してグリア細胞で Or67d QF と HttQ25 YFP の使用で HttQ91 mCherry を表現する男性のハエの脳からの (A) A モンタージュ。信号も小さな HttQ91 mCherry の集計、表示、誘導 HttQ25 YFP 集計が拡散信号を周囲から目立つように調整されました。示されているスライスはそれぞれで区切られた 〜 1.0 μ m (マージされた画像の右下隅に示されているスライス番号)、複数の集計を観察することができます。矢印は、z スタックを手動で移動またはその特定の z スライスでフォーカスの近くにあると判断された HttQ25 YFP 涙点を示します。ここに示される 7 HttQ25 YFP 点の六つは、検出可能である HttQ91 mCherry 信号を関連付けられている (すなわち、HttQ25 YFP 集計の 86% 共同でローカライズ HttQ91 mCherry)。HttQ25 YFP 涙点に関連付けられている mCherry 信号が頻繁に DA1 糸球体の mCherry 肯定的な点の大半よりも弱いことに注意してください。スケール バー = 5 μ m. (B) A HttQ25 YFP/HttQ91-mCherry-co-ローカライズされた涙 (左側パネル) の前に、(右側のパネル) mCherry (受容体) の退色後。YFP (ドナー) 蛍光性の増加は、ImageJ46AccPbFRET プラグインを使用してピクセル単位で FRET 効率 (フレットeff) イメージの生成に使用されました。この特定の集計は 61% の全体的なフレットeffです。スケール バー = 1 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
神経変性疾患の患者数は増加し続けているより良い治療法を開発することができますので、これらの疾患の病態の理解を高めるための緊急の必要性があります。ここでは、監視モデル生物、ショウジョウバエの異なる細胞型の間の病原性タンパク質凝集体のプリオンのような通信を可能にする方法をについて説明します。最近、突然変異体 Htt 集計生体内でのプリオンのような伝送を実証してグリア27にニューロンからこれらの凝集体の普及を仲介する貪食受容体を識別するためにこの方法を利用させていただきました。我々 のアプローチは、ショウジョウバエを使用して人間の遺伝病を研究するいくつかの利点を悪用: そのライフ サイクルは短いと広大な遺伝的ツールセットにより、治療に関連する基本的な生物学的情報の発見を加速することができます。
ここで述べる方法他の既存の動物 2 つの主要な利点を提供して培養細胞モデル プリオンのような伝送のため: (1) 集計する病原体 (例えば、突然変異体 Htt) はそのままの組織、(2) に存在する細胞で生産されて別のセル人口で同じ蛋白質 (例えば野生型 Htt) の通常折り畳まれたバージョンの式は、プリオンのようなイベントのために容易にアクセスできる「レポーター」を提供します。ショウジョウバエ40で定評ある洗練された遺伝的ツールを使用して突然変異体と同じ有機体内の細胞数の非重複の野生型 Htt タンパク質発現を実現しました。多くの異なる組織固有の Gal4 と QF ドライバーは容易に入手可能なのでは、実現可能なハエの体内で本質的に任意の細胞型のプリオンのような転送を調べることです。
アプローチの重要なコンポーネントは、変異体と野生型 Htt 蛋白質同じ動物内の異なる細胞集団の分離式を達成します。いずれかの式が重なって受信者細胞における野生型 Htt 集計がプリオンのような集計ドナー細胞9,12,27、元の細胞質の浸透を正確に報告するように除去される必要があります。 41。これは、その他の遺伝的ツール (例えばGal80 と QS のリプレッサー40) この問題を軽減するために導入することで実現できます。理想的な遺伝子型を設計して選択すると、一度涙点を定量化するための体系的な方法を確立する必要があります。これは、ラベル付けされているセルの数、表示、集計数とサンプルの信号対雑音比で大きく異なります。ここで図 4に述べたよう、データを分析するための共局在および/または肯定的なフレットなどの条件を使用できます。ただし、野生型 Htt の選択を制限するこれらの機能に基づいた集計可能性プリオンのような転送イベントの過小評価するいくつかの突然変異の Htt 骨材種が共焦点顕微鏡の検出限界を下回る可能性がありますので。
ここで説明した生体内でアプローチが HD または他 polyQ 障害もに関連付けられている集計のプリオンのような動作のための排他的ではありません。プリオンのような α-シヌクレイン PD、広告、タウの広がりを調べる遺伝子組換えハエを開発ことができます SOD1 や同じ実験パラダイムを使用して ALS で TDP 43。これらのタンパク質ごとに、集計しやすい変異体をドナー細胞と核形成したときのみの集計が受信者の細胞に表現されるべき同じタンパク質の可溶性バージョンで表されるべきです。この実験パラダイムは、さまざまな病気に関連付けられている病原性タンパク質は、47クロス播種機構を通じてやり取りします出現の考えを調査するために有用なことができます。最後に、ショウジョウバエの無数の遺伝学的ツールは、調査し、細胞質-細胞質はこれらの致命的な病気に関連付けられている病原性タンパク質凝集体の広がりの基礎となる分子機構の識別に適用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
これらのメソッドの開発の間に多くの役に立つ議論の Kopito、羅、ピアースのラボのメンバーに感謝いたします。我々 はまた、この原稿の批判的読解のブライアン Temsamrit を感謝します。この作品は、大学科学大戦スミスの公益信託からの資金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
| Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
| 20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
| Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
| Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
| FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
| Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
| Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
| Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
| LAS X image analysis software | Leica | ||
| Imaris image analysis software | Bitplane |
References
- Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
- Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting Proteostasis for Disease Intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
- Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease. Front Neurosci. 11, 64 (2017).
- Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
- Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
- Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases. Lancet Neurol. 16 (4), 323-332 (2017).
- Walker, L. C., Jucker, M. Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept. Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 3138-3147 (2013).
- Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
- Nonaka, T., et al. Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
- Ren, P. H., et al. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat Cell Biol. 11 (2), 219-225 (2009).
- Trevino, R. S., et al. Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface. J Biol Chem. 287 (35), 29722-29728 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Zeineddine, R., et al. SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation. Mol Neurodegener. 10, 57 (2015).
- Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O'Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways. Acta Neuropathol. 131 (1), 103-114 (2016).
- Clavaguera, F., et al. Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (23), 9535-9540 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Eisele, Y. S., et al. Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12926-12931 (2009).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
- Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (39), 5427-5433 (2015).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Liu, L., et al. Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo. PLoS One. 7 (2), 31302 (2012).
- Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nat Commun. 6, 6768 (2015).
- Pearce, M. M. Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease. Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).
- Pecho-Vrieseling, E., et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons. Nat Neurosci. 17 (8), 1064-1072 (2014).
- Wu, J. W., et al. Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo. Nat Neurosci. 19 (8), 1085-1092 (2016).
- Jackson, G. R., et al. Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons. Neuron. 21 (3), 633-642 (1998).
- Warrick, J. M., et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93 (6), 939-949 (1998).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15005 (2015).
- Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
- Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity. J Mol Biol. 311 (1), 173-182 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Riabinina, O., Potter, C. J. The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila. Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).
- Costanzo, M., et al. Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes. J Cell Sci. 126 (16), 3678-3685 (2013).
- Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function. Neuron. 38 (4), 567-580 (2003).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
- Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images. BMC Bioinformatics. 9, 346 (2008).
- Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases. Acta Neuropathol. 134 (2), 187-205 (2017).
