Raccogliendo la prova sostiene l’idea che aggregati proteici patogeni associati con malattie neurodegenerative diffuse tra cellule con proprietà simil-da prioni. Qui, descriviamo un metodo che permette la visualizzazione della cellula–cellula diffusione del prione-come i complessi nell’organismo modello, Drosophila melanogaster.
L’aggregazione della proteina è una caratteristica centrale della maggior parte delle malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD) e sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Aggregati proteici sono strettamente associati con neuropatologia in queste malattie, anche se non è noto l’esatto meccanismo attraverso il quale l’aggregazione di proteine aberranti sconvolge la normale omeostasi cellulare. Emergendo dati forniscono l’appoggio importante per l’ipotesi che aggregati patogeni in AD, PD, HD e ALS hanno molte somiglianze ai prioni, che sono agenti infettivi sola proteina responsabili per le encefalopatie spongiformi trasmissibili. I prioni auto-replicano di templating la conversione delle versioni piegato in modo nativo della stessa proteina, causando la diffusione del fenotipo aggregazione. Come i prioni e proteine prioniche-like in annuncio, PD, HD e ALS mossa da una cellula a altra è attualmente un’area di intensa ricerca. Qui, è descritto un modello di Drosophila melanogaster che permette il monitoraggio della trasmissione del prion-like, cellula–cellula di aggregati di huntingtina (Htt) connesso con HD. Questo modello si avvale di strumenti potenti per manipolare l’espressione del transgene in molti tessuti differenti di Drosophila e utilizza una proteina citoplasmatica fluorescente contrassegnati al direttamente del prion-come trasferimento del rapporto di mutante Htt aggregati. D’importanza, l’approccio che descriviamo qui può essere utilizzato per identificare nuovi geni e vie che mediano la diffusione degli aggregati della proteina tra cellulari diversi tipi in vivo. Informazioni acquisite da questi studi si espanderà la limitata comprensione dei meccanismi patogenetici che sono alla base di malattie neurodegenerative e rivelare nuove opportunità per intervento terapeutico.
L’ipotesi del prion afferma che l’agente infettivo responsabile per le encefalopatie spongiformi trasmissibili (ad es., malattia di Creutzfeldt – Jakob in esseri umani, scrapie nelle pecore, malattia del deperimento cronico in cervi e alci e “malattia della mucca pazza” nei bovini ) è esclusivamente composto di proteine e privo di acidi nucleici1. In malattie da prioni, la proteina prionica cellulare (PrPC) assume una piega non nativi, stabile (PrPSc) che è altamente beta foglio-ricco e auto-propagarsi convertendo e reclutamento monomerico PrPC molecole in amiloide stabile funzioni di aggregazione. PrPSc aggregati utilizzano questo meccanismo di auto-replica per diffondere tra diverse cellule dell’organismo e anche tra gli organismi individuali2.
Misfolding e aggregazione è anche una caratteristica centrale della maggior parte delle malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD) e sclerosi laterale amiotrofica (ALS))3. Formazione di assemblee di proteina aggregati intra – o extra – cellulare in queste malattie è strettamente associato con citotossicità4 e progredisce lungo percorsi altamente riproducibili e malattia-specifica attraverso il cervello sopra tempo5, 6. questi modelli di diffusione suggeriscono che aggregati patogeni associati a questi disturbi del prion-come le proprietà. Forte sostegno ora esiste per la trasmissione di prioni-come degli aggregati associati con l’annuncio, PD, HD e ALS – si sono sparsi dalla cellula–cellula e modello il cambiamento conformazionale di monomeriche forme della stessa proteina in cellule precedentemente inalterato7, 8.
La maggior parte degli studi che studiano da prioni-come diffusione di aggregati proteici fino ad oggi è stata effettuata utilizzando modelli di coltura di cellule di mammifero, dove gli aggregati trasferire nel citoplasma delle cellule naive dallo spazio extracellulare o da un’altra cella citoplasma9,10,11,12,13,14,15, o iniettando materiale contenente aggregato nel cervello di topo e monitoraggio aggregare aspetto fuori le iniezione sito16,17,18,19,20,21,22, 23. più recentemente, gli animali transgenici sono stati utilizzati per dimostrare che gli aggregati intracellulari diffondersi ad altre cellule all’interno di cervelli intatti24,25,26,27, 28,29,30. Qui, descriviamo un metodo per la visualizzazione diretta di trasferimento aggregati tra le singole celle nel cervello intatto di Drosophila melanogaster. Quasi due decenni fa in primo luogo sono stati sviluppati in Drosophila modelli di HD/poliglutammina (polyQ) malattie31,32 e hanno intestimabile molti meccanismi patogenetici che sono alla base di questi disordini 33. HD è un disordine neurodegenerative ereditato causato da una mutazione autosomica dominante del gene che codifica per la proteina huntingtina (Htt)34. Questa mutazione provoca dilatazione di un tratto poliQ nei pressi N-terminale di Htt di là di una soglia di patogena di ~ 37 Glutamine, causando la proteina di misfold e aggregazione35,36. Selvaggio-tipo Htt proteine contenenti < 37 Glutamine in questo tratto raggiungere loro ovile nativo, ma possono essere indotte a aggregato al diretto contatto fisico con un Htt aggregazione "seme"12,27,37. Sfruttiamo questo homotypic, aggregazione nucleato di selvaggio-tipo Htt come una lettura per il trasferimento del prion-like e citoplasmico voce di mutante Htt aggregati originari di altre cellule.
Determinare i meccanismi da cui aggregati del prion-come viaggio tra le celle può portare all’identificazione di nuovi bersagli terapeutici per le malattie neurodegenerative incurabili. Prendiamo vantaggio del ciclo di vita rapido, facilità d’uso e trattabilità genetica della Drosophila melanogaster definire meccanismi molecolari per cellula–cellula diffusione del mutante Htt aggregati. La nostra strategia sperimentale utilizza due sistemi di espressione binaria disponibile in Drosophila, la consolidata Gal4 specifici a Monte d’attivazione sequenza (Gal4-UAS) sistema38 e il recentemente sviluppato QF-QUAS sistema39. Questi due sistemi indipendenti di aggancio permette di limitare l’espressione dei transgeni Htt mutanti e wild-type a popolazioni distinte delle cellule all’interno della stessa volare40. Utilizzando questo approccio, esaminiamo da prioni-come diffusione del mutante Htt monitorando la ridistribuzione di citoplasmico Htt di selvaggio-tipo dallo stato normalmente diffusa, solubile a uno stato aggregato, una diretta conseguenza del contatto fisico con un mutante pre-formato Htt aggregazione “seme”. Conversione di selvaggio-tipo Htt dal mutante Htt possa essere confermati mediante biochimici o trasferire tecniche biofisiche che segnalano interazioni proteina-proteina, quali l’energia di risonanza di fluorescenza (FRET)9,27,41 .
Soprattutto, possiamo anche accedere un gran numero di strumenti genetici in Drosophila per identificare geni e/o le vie che mediano del prion-come diffusione di aggregati proteici. Recentemente abbiamo utilizzato questo approccio per svelare un ruolo chiave per il recettore delle cellule superficiali dell’organismo saprofago,42,Draper43, nel trasferimento mutante Htt aggregati da un neurone assoni a vicina glia fagocitica in Drosophila centrale sistema nervoso (SNC)27. Così, l’approccio e la formazione immagine-base genetica che descriviamo qui può rivelare importanti informazioni di base biologiche su un fenomeno malattia rilevanti in simple-to-use ma organismo modello potente, Drosophila.
Come i numeri dei pazienti affetti da malattie neurodegenerative continua ad aumentare, c’è un urgente bisogno di aumentare la comprensione della patogenesi molecolare di queste malattie, in modo che possono essere sviluppate terapie migliori. Qui, descriviamo i metodi che consentono il monitoraggio del prion-come trasmissione degli aggregati della proteina patogena tra diversi tipi di cellule nell’organismo modello, Drosophila melanogaster. Recentemente abbiamo utilizzato questa metodologia per dimostrare da p…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i membri dei laboratori Kopito, Luo e Pearce per molte discussioni utili durante lo sviluppo di questi metodi. Ringraziamo anche Brian Temsamrit per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dall’Università delle scienze e le fondazioni di beneficenza W.W. Smith.
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
LAS X image analysis software | Leica | ||
Imaris image analysis software | Bitplane |