Summary
Acumular evidências suporta a ideia que agregados de proteínas patogênicas associam com doenças neurodegenerativas espalhados entre as células com o prião-como propriedades. Aqui, descrevemos um método que permite a visualização de propagação de célula para célula de príon como agregados no organismo modelo, Drosophila melanogaster.
Abstract
A agregação da proteína é uma característica central da maioria das doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e esclerose lateral amiotrófica (ela). Agregados de proteína estão intimamente associados com neuropatologia destas doenças, embora o mecanismo exato pelo qual a agregação da proteína aberrante interrompe a homeostase celular normal não é conhecido. Emergentes dados fornecer forte apoio para a hipótese que agregados patogénicos em AD, PD, HD, e ALS tem muitas semelhanças com os prions, que são somente proteína agentes infecciosos responsáveis para as encefalopatias espongiformes transmissíveis. Priões auto replicam por modelagem a conversão das versões nativamente-dobrado da mesma proteína, causando a propagação do fenótipo agregação. Como príons e proteínas de príon, como no anúncio, PD, HD e ALS mover de uma célula para outra é atualmente uma área de intensa investigação. Aqui, um modelo de Drosophila melanogaster que permite o monitoramento da transmissão príon-like, célula a célula do mutant huntingtin (Htt) agregados associados com HD é descrito. Este modelo aproveita-se de poderosas ferramentas para manipular a expressão do transgene em muitos tecidos diferentes da drosófila e utiliza uma proteína citoplasmática marcados fluorescentemente diretamente transferência de prião, como relatório de mutante Htt agregados. Importante, a abordagem que descrevemos aqui pode ser usada para identificar novos genes e vias que medeiam o espalhamento de agregados de proteínas entre célula diversos tipos em vivo. Informações obtidas a partir desses estudos irão expandir a compreensão limitada dos mecanismos patogénicos que fundamentam a doenças neurodegenerativas e revelar novas possibilidades de intervenção terapêutica.
Introduction
A hipótese do príon afirma que o agente infeccioso responsável para as encefalopatias espongiformes transmissíveis (por exemplo, doença de Creutzfeldt - Jakob nos seres humanos, o tremor epizoótico dos ovinos, doença desperdiçando crônica em cervos e alces e "doença da vaca louca" em bovinos ) é unicamente composto de proteína e desprovidos de ácidos nucleicos1. Em doenças de príon, a proteína príon celular (PrPC) pressupõe uma dobra não-nativas, estável (PrPSc) que é altamente beta folha-rico e pode propagar self convertendo e recrutamento monomérico PrPC moléculas em amiloide estável agregados. PrPSc agregados usam esse mecanismo de auto-replicação para espalhar entre diferentes células em um organismo e mesmo entre organismos individuais2.
Enrolamento de proteínas e agregação é também uma característica central da maioria das doenças neurodegenerativas (a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e esclerose lateral amiotrófica (ela))3. Formação das assembleias intra ou extra cellular agregados da proteína nestas doenças está intimamente associada com a citotoxicidade4 e progride ao longo de caminhos altamente reprodutíveis e doenças específicas, através do cérebro ao longo do tempo5, 6. estes padrões de propagação sugerem que agregados patogénicos associados a esses transtornos tem príon-como propriedades. Forte apoio agora existe para transmissão de príons, como dos agregados associados AD, PD, HD e ALS - espalham de célula para célula e modelo a mudança conformacional monomérico formas da mesma proteína em células anteriormente afetado7, 8.
A maioria dos estudos investigando o prião, como propagação de agregados de proteínas até à data têm sido realizada usando modelos de cultura de células de mamíferos, onde agregados transferir para o citoplasma das células ingênuo do espaço extracelular ou de outra célula citoplasma9,10,11,12,13,14,15, ou pela injeção de material agregado contendo em cérebro de rato e monitoramento agregar aparência fora a injeção local16,17,18,19,20,21,22, 23. mais recentemente, os animais transgénicos têm sido utilizados para demonstrar que agregados intracelulares se espalhar para outras células no cérebro intacto24,25,26,27, 28,29,30. Aqui, descrevemos um método para a visualização directa de transferência agregada entre células individuais do cérebro intacto de Drosophila melanogaster. Drosófila modelos de HD/polyglutamine (polyQ) doenças foram desenvolvidos primeiramente há quase duas décadas de31,32 e forneceram muitos insights inestimáveis sobre os mecanismos patogénicos subjacentes a estes distúrbios 33. HD é uma desordem neurodegenerativa hereditária causada por uma mutação autossômica dominante no gene que códigos para a proteína huntingtina (Htt)34. Esta mutação resulta na expansão de um trecho de polyQ perto N-terminal do Htt, além de um limite de patogenicidade de ~ 37 glutaminas, fazendo com que a proteína misfold e agregado35,36. Proteínas de Htt do selvagem-tipo contendo < 37 glutaminas neste estiramento alcançar seu aprisco nativo, mas pode ser induzidas a agregada ao contacto físico directo com um Htt agregada "semente"12,,27,37. Exploramos este homotypic, nucleada agregação do selvagem-tipo Htt como uma leitura para transferência de príon-como e citoplasmática entrada dos mutantes Htt agregados originários de outras células.
Determinar os mecanismos pelos quais agregados de príon-como viagens entre células podem levar à identificação de novos alvos terapêuticos para doenças neurodegenerativas incuráveis. Levamos vantagem do ciclo de vida rápido, facilidade de uso e rastreabilidade genética da Drosophila melanogaster para definir mecanismos moleculares para propagação de célula para célula do mutant Htt agregados. Nossa estratégia experimental emprega dois sistemas de expressão binário disponíveis em Drosophila, o bem-estabelecida Gal4 específicas upstream ativando sequência (Gal4-UAS) sistema38 e o recentemente desenvolvido QF-QUAS sistema39. Estes dois sistemas independentes de acoplamento permite restringir a expressão dos mutantes e selvagem-tipo Htt transgenes para populações de células distintas dentro da mesma voar40. Usando essa abordagem, nós examinamos príon como difusão do mutant Htt, monitorando a redistribuição de citoplasmática Htt selvagem-tipo de estado solúvel, normalmente difuso a um estado de agregados, uma consequência direta do contato físico com um mutante pré-formado Htt agregado "semente". Conversão de tipo selvagem Htt por mutant Htt pode ser confirmado usando bioquímicas ou transferência de técnicas biofísicas que relatam as interações da proteína-proteína, tais como energia de ressonância de fluorescência (FRET)9,,27,41 .
Importante, também podemos acessar um grande número de ferramentas genéticas em Drosophila para identificar genes e/ou caminhos que medeiam príon como propagação de agregados de proteínas. Temos recentemente usado essa abordagem para desvendar um papel-chave para o receptor de superfície ao tesouro de célula,42,Draper43, na transferência de mutante Htt agregados de axônios neuronais para glia fagocítica nas proximidades em Drosophila central sistema nervoso (SNC)27. Assim, a abordagem genética e imagem latente-baseada que descrevemos aqui pode revelar importantes informações biológicas básicas sobre um fenômeno doença relevantes no simples de usar mas organismo modelo poderoso, Drosophila.
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Protocol
1. acoplamento Gal4 e QF-mediada Htt Transgene expressão em Drosophila
- Coletar e/ou gerar transgénicos Drosophila melanogaster linhas contendo tecido-específica Gal4 ou QF "drivers", bem como as linhas que contêm o selvagem-tipo ou mutant Htt transgenes a jusante da Gal4-UAS38 ou QF-QUAS39. Certifique-se de que as proteínas que são expressas de transgenes estes são fundidos para proteínas fluorescentes ou epítopo-Tags para permitir a diferenciação dos mutantes e selvagem-tipo Htt transgene produtos na mosca da mesma. Veja a Figura 1.
Nota: Normalmente usamos fragmentos do exon 1 do gene humano Htt27. No entanto, moscas transgênicas em vez disso podem ser geradas para expressar mais fragmentos de Htt ou outros genes se desejado. - Planeje a estratégia genética tal que mutantes e selvagem-tipo Htt transgenes será expressa em populações de células distintas, não sobrepostas.
- Se ocorrer qualquer sobreposição de expressão, mutantes e selvagem-tipo Htt proteínas sintetizadas nas células mesmas serão co agregar e impedir a detecção de príons, como eventos. Para evitar isso, use o Gal4 e QF repressores específicos, Gal80 e QS40, respectivamente (Figura 1). Seleção de drivers de Gal4 e/ou QF mentalmente controlada pode ajuda para restringir a expressão do mutant Htt a células pós mitóticas, eliminando a possibilidade que a divisão celular pode contribuir para espalhando agregada de célula para célula.
- Usando as condições normais de cultivo, mate as moscas para gerar descendência que expressam a população de célula mutante Htt via QF (ou Gal4) em um "doador" e população de celular do selvagem-tipo Htt via Gal4 (ou QF) em um "destinatário". Veja a Figura 1 para um esquema mostrando uma possível combinação genética.
Nota: Os drivers QF e Gal4 que foram usados para gerar os dados mostrados nas figuras 1-4 e no nosso anterior publicação27 incluem o driver de neurônio (ORN) DA1 olfactory do receptor Or67d-QF e o motorista pangliais, repo-Gal4. - Gere o controle de moscas em paralelo que expressam o selvagem-tipo Htt em ambas as populações de células QF - e Gal4-etiquetadas.
- Recolher a descendência do genótipo desejado e idade dos animais conforme apropriado.
Figura 1 . Abordagem genética para expressão acoplado de mutantes e selvagem-tipo transgenes Htt usando os sistemas de expressão binário QF-QUAS e Gal4-UAS. Em "célula A" uma proteína de Htt mutante mCherry-tag contendo um trecho de patogenicidade-comprimento polyQ (Q91) é expressa usando um driver de QF localizado a jusante de um promotor de tecido-específica um ("PA"). Em "célula B," um Htt YFP-Tag do selvagem-tipo que contém um trecho de polyQ normal (P25) é expresso por meio de um driver de Gal4 controlado pelo promotor de tecido-específica B ("PB"). Nas figuras 2-4, Or67d-QF foi usado para conduzir a expressão QUAS-HttQ91-mCherry em ORNs DA1 e repo-Gal4 foi usado para expressar UAS-HttQ25-YFP em todos glia27. Importante, HttQ91-mCherry só é expressa em células QF-expressando em virtude da sequência QUAS colocados a montante do transgene. Da mesma forma, HttQ25-YFP só é expresso por meio de Gal4, que reconhece especificamente a UEA. Se for detectada qualquer sobreposição na distribuição do tecido dos motoristas QF e Gal4, transgenes codificação QS nas células Gal4-expressando e Gal80 em células de QF-expressando pode ser introduzido. Acrescentar tags proteína fluorescente no selvagem-tipo e do mutant Htt permite a diferenciação das duas proteínas durante a imagem e a capacidade de medir FRET entre pares de doador/aceitador apropriado (por exemplo, PCP/YFP ou YFP/mCherry). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. microdissecção e fixação dos cérebros de adultos drosófila
Nota: Este procedimento de dissecação foi modificado de uma anterior publicação de44e pode ser usado para preparar o cérebro para sinal de fluorescência direta da imagem latente de fusões de proteína de Htt-fluorescente. Modificações para o procedimento que pode ser feito por imunocoloração os cérebros são discutidas na próxima seção.
- Coletar os seguintes materiais e colocar no gelo: tampão fosfato salino contendo 0,03% Triton X-100 (PBS/T); microcentrifuge tubos contendo 970 μL de solução fixador paraformaldeído 4% (PFA), preparada pela adição de 200 µ l 20% PFA a 770 µ l PBS/T; um prato de vidro transparente contendo bem; uma pipeta de transferência descartável; duas pinças dissecação (um n. º 3 e um n. º 5).
- Anestesiar as moscas adultas usando CO2 e transferi-los para um poço do prato de vidro no gelo.
- Usando uma pipeta de transferência, adicione uma pequena quantidade (~ 500 µ l) de frio PBS/T para o bem que contenham as moscas tão bem quanto um poço vazio. Evite a introdução de muitas bolhas, que podem interferir com a dissecação.
- Coloque o prato de vidro sobre uma superfície plana abaixo um microscópio dissecação e ajuste a ampliação até o corpo voar preenche o campo de visão e está em foco.
- Coloque um par de fontes de luz de pescoço de cisne para que a luz está iluminando a ambos os lados do prato de vidro. Ancore um lenço dobrado laboratório sob o prato de vidro para descarte de partes do corpo/cutícula durante a dissecção.
- Usando a pinça n º 3 na mão não dominante, transferi uma única mosca bem contendo PBS/T. imobilizar a mosca, agarrando a preensão de seu abdômen com a parte ventral virada para cima.
- Mantendo a mosca totalmente submergida em PBS/T, remova a cabeça voar com o fórceps n º 5 na mão dominante. Introduza uma ponta desta pinça sob a cutícula no pequeno espaço adjacente a tromba de um lado da cabeça voar. Garantir a pega na cabeça por beliscar o fórceps para agarra-te os olhos de ambos os lados.
- Retire a cabeça voar seu corpo puxando a dois pinça separados. Descarte do corpo voar sobre um tecido de laboratório posicionado nas proximidades. Manter a pressão sobre a mão dominante pinça para que o cabeça de mosca não está perdida.
- Uma dica de posição da pinça n º 3 no não-dominante mão no mesmo espaço pequeno sob a cutícula do outro lado da probóscide. Uma vez posicionado, belisque a pinça para segurar os olhos no mesmo local de ambos os lados da cabeça.
- Uma vez que a aderência sobre a cutícula é segura, puxe delicadamente a pinça separados em 180°. Esta ação irá separar a cutícula cabeça sem danificar o cérebro. Descarte o resíduo de cutícula sobre um tecido de laboratório.
- Embora ideal, a cutícula de cabeça não pode ser totalmente removida em uma única etapa. Neste caso, remova a cutícula peça por peça até que o cérebro está completamente exposto. Tome cuidado para não danificar o cérebro, evitando o contato direto com a pinça.
- Remova o cérebro dissecado de PBS/T agarrar ahold de uma traqueia anexada, ou aspirando o cérebro para o espaço entre as pontas da pinça por ação capilar.
Nota: Remoção de traqueia é opcional, pois ele tende a não obscurecem os lóbulos da antena na superfície anterior do cérebro onde nós tipicamente de imagem. No entanto, se a traqueia interferir com imagem latente, removê-los cuidadosamente para que o cérebro não é danificado por esta manipulação. - Transferi o cérebro de voar em um dos tubos microcentrifuga contendo fixador solução no gelo. Certifique-se que o cérebro separa o fórceps e está submersa na solução fixador.
- Uma vez que todos os cérebros têm sido dissecados, sujeitá-los a um "curto-fix", colocando os tubos fechados em uma nutator para ~ 5 min à temperatura ambiente no escuro.
Nota: Este passo curto fixação garante que os cérebros são mais fáceis de manipular em etapas subsequentes e não adere aos lados do tubo do microcentrifuge. - Remover a maioria da fixador solução com uma pipeta P1000 e descartá-lo.
- Evite cérebros do tubo de aspiração durante este e qualquer etapa de lavagem posterior. Definir o P1000 para um menor volume (por exemplo, 650 µ l) e remover o sobrenadante em duas etapas. Além disso, mantenha os tubos microcentrifuga em consonância com uma fonte de luz (por exemplo, luzes aéreas) enquanto aspiração para visualizar melhor o cérebro.
- Adicione 1 mL de PBS/T fresco para o cérebro. Lave rapidamente (< 1 min) no escuro, aspirar o sobrenadante do cérebro e descartar.
- Repita a lavagem com PBS/T no escuro à temperatura de acordo com o seguinte calendário: 2 lavagens rápidas (< 1 min), 1 X 5 min, 3 X 20 min e lavagem de 1 X 1 h. Seguro no máximo na microcentrifuga tubos e colocar os tubos em um nutator entre as lavagens.
- Se DAPI coloração é desejado, substituir a lavagem final 1 h com incubação de 1 X 30 min com 250 ng/mL DAPI diluída em PBS/T, seguido por 2 X rápida e min 1 X 20 lavagens.
- Após a última lavagem, remover a maior parte do sobrenadante de tampão de lavagem, tomando cuidado para não incomodar o cérebro e adicionar 30 µ l de reagente antidesgaste glicerol-baseado para o cérebro. Incube a 4 ° C, no escuro sem movimento pelo menos 1 h e até 24 h.
3. modificações seção 2 para cérebros Immunostaining adulto
Nota: Utilize este protocolo para proteínas não-fluorescente de imagem ou para fusões de proteína fluorescente com fluorescência fraca.
- Aumentar a concentração de Triton X-100 em PBS/T por 10-fold (PBS + 0,3% Triton X-100) para cada etapa. Isso garante que o detergente suficiente está presente permeabilize as membranas das células e permitir que os anticorpos acessar espaços intracelulares.
- Consertar o cérebro em 4% PFA em PBS/T por 20 min em temperatura ambiente.
- Depois de executar todas as lavagens, incube o cérebro em tampão de recém-preparado bloqueio (PBS/T + 5% de soro de cabra normal (NGS)) durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
- Remova e descarte o tampão de bloqueio. Adicionar 0,5 mL da solução de anticorpo primário por tubo preparado como uma mistura de mestre diluindo os anticorpos primários conforme apropriado em tampão de bloqueio fresco (ver Tabela de materiais para anticorpos comumente usados e diluições). Incube os cérebros em anticorpos primários em um nutator pelo menos 24 h a 4 ° C, no escuro.
- Remover a solução de anticorpo primário do cérebro usando um P1000 e reservar em um tubo de fresco. Adicione 1 mL de PBS/T para lavar o cérebro.
Nota: A solução de anticorpo primário reservados pode ser armazenada a 4 ° C por até quatro semanas. Nós temos com sucesso reciclado anticorpos primários até duas vezes em experimentos subsequentes. - Lavar o cérebro rapidamente (< 1 min) em PBS/T, aspirar o sobrenadante de cérebros e descarte. Repeti esta lavagem rápida mais uma vez.
- Continuar a lavar roupa com 1 mL de PBS/T à temperatura de acordo com a seguinte programação: 1 X 5 min, 3 X 20 min e lavagem de 1 X 1 h. Seguro no máximo na microcentrifuga tubos e colocar os tubos em um nutator durante lavagens.
- Após a última lavagem, remover a maior parte do sobrenadante de PBS/T e adicionar 0,5 mL de solução anticorpo secundário preparada como uma mistura de mestre diluindo os anticorpos conforme apropriado em tampão de bloqueio fresco (ver Tabela de materiais para anticorpos comumente usados e diluições). Incube os miolos em anticorpos secundários por 24 h a 4 ° C, no escuro.
- Repita os passos de lavagem em etapas, 3.5, 3.6 e 3.7 após incubação com anticorpos secundários.
- Após a lavagem final, remover a maior parte do tampão de lavagem e certifique-se de que todos os cérebros estão localizados na parte inferior do tubo. Adicione o reagente antidesgaste de 30 µ l para o cérebro. Incube a 4 ° C, no escuro sem movimento para 16 a 24 h.
4. todo o cérebro montagem
- Coloque um vidro de microscópio sob um microscópio de dissecação e rótulo com informações de identificação.
Nota: Como alternativa, o cérebro pode ser montado diretamente em um vidro de tampa para acessar ambos os lados do cérebro durante a imagem latente. Um protocolo descreve este procedimento de montagem tem sido publicado anteriormente45. - Remover o cérebro de cada tubo microcentrifuga usando uma ponta da pipeta cega (preparado usando uma lâmina de barbear para remover o fundo ~ 1 cm fora uma ponta de µ l 1-200) e transferi-los para o meio do slide. Transferência como pouco reagente antidesgaste com o cérebro quanto possível.
- Use fórceps para posicionar o cérebro na orientação desejada (por exemplo, dorsal, apontando para a parte superior do slide e superfície anterior voltada para cima para o lóbulo da antena de imagem). Ao orientar o cérebro, considere o feixe luminoso do microscópio para ser usado para a imagem latente-los.
- Remova excesso reagente antidesgaste de slide usando o canto apontado de um tecido dobrado laboratório sem incomodar o cérebro. Deixar o slide para ~ 5-10 min no escuro para permitir que os cérebros de aderir ao slide.
- Cercar o cérebro voar com quatro pequenos pedaços de vidro tampa colocada em cada lado do cérebro para formar um quadrado que é ~ 19 mm x 19 mm. Coloque uma borda de um vidro de tampa 22 x 22 mm n º 1.5 fora um destes pequenos pedaços de vidro e abaixe suavemente a lamela sobre o cérebro para completar a montagem da ponte.
- Lentamente, dispense fresco reagente antidesgaste para preencher a superfície sob a lamela, tomando cuidado para não perturbar a lamela ou o cérebro. Limpe qualquer excesso Media usando canto apontado de um tecido dobrado laboratório sem contatar diretamente a lamela.
- Adicione uma gota de esmalte claro, secagem rápida para cada um dos quatro cantos da lamela. Deixe-a secar por ~ 10 min. Em seguida, sele as quatro bordas da lamela com esmaltes para encerrar completamente o cérebro.
- Cérebros de imagem imediatamente, ou loja a 4 ° C até que esteja pronto.
- Se a fluorescência intrínseca de fusões de proteína de Htt-fluorescente de imagem, imagem o cérebro dentro de 24 h para o melhor sinal.
5. imagem latente e quantificação do prião, como transmissão de agregados
- Imagem do cérebro montado usando um microscópio confocal, equipado com um X de 40 ou 60/63 X objetivo de óleo para coletar imagens de z-fatia pela região do cérebro onde os drivers Gal4 e QF selecionados são expressos (Figura 2A, B).
- Excitar a fusões de proteína fluorescente ou immunolabeled proteínas usando o laser apropriado (por exemplo, 488 nm para FITC/GFP/YFP ou 552 nm para mCherry/Cy3). Configurar o windows de deteção que capturam fluorescente máximo sinal ao eliminar canal-conversas cruzadas usando um sistema de deteção espectral ou banda/long filtros passa-emissão específica para cada fluoróforo.
Nota: Se atencioso quando agregados de proteínas de imagem. É fácil para pixels no centro de cada agregado para tornar-se saturado, especialmente em agregados maiores. Tentativa de minimizar a saturação da imagem, mas esteja ciente do risco de perder o sinal de menores agregados espécies (Figura 2B, C, D). Demasiada saturação aumentará o fundo da imagem, tornando mais difícil para identificar partitura isolada. Teste diferente configurações para otimizar antes de tomar as imagens finais em cada conjunto de dados de imagem.
- Excitar a fusões de proteína fluorescente ou immunolabeled proteínas usando o laser apropriado (por exemplo, 488 nm para FITC/GFP/YFP ou 552 nm para mCherry/Cy3). Configurar o windows de deteção que capturam fluorescente máximo sinal ao eliminar canal-conversas cruzadas usando um sistema de deteção espectral ou banda/long filtros passa-emissão específica para cada fluoróforo.
- Analisar os dados através da quantificação individual partitura ou manualmente movendo através de z-fatias individuais (por exemplo, 2 figuraC e Figura 4A) ou após processamento as fatias confocal em 3 dimensões (Figura 3 A, B).
Nota: Isto pode ser feito na imagem J ou outra software de processamento de imagem.- Se os agregados são bem separados e há fluorescência de fundo mínimo, usar software de análise de imagem para identificar, quantificar e analisar os agregados como "objetos" distintos ou "superfícies" em uma reconstrução 3D a pilha confocal (sistematicamente Figura 3 B).
Nota: As ações de Software descritas são específicas para o instrumento e o software usado aqui (veja a Tabela de materiais).- Visualize um z-series confocal no modo de visualização em 3D. Use o assistente de "Análise" para identificar pontos individuais em um canal selecionado (por exemplo, o canal vermelho para HttQ91-mCherry agrega na Figura 3). Ajuste o limiar e filtros para representar fielmente todos os agregados de forma heterogénea e médias como objetos individuais na imagem.
- Habilite "Dividir objetos" sob "Binário processamento pré-filtro" para separar os agregados intimamente associadas que são mesclados aberrantly pelo algoritmo de software. Observe que o número total de objetos e suas medições associadas é relatado em "Medições".
Nota: Este método para quantificar mutant Htt agregados não é passível de imunocoloração protocolo porque o centro dos agregados amiloides, é impenetrável aos anticorpos. Como resultado, os agregados aparecem no microscópio como anel-como estruturas, e software de análise de imagem é incapaz de com precisão identificar e distinguir essas "manchas" individuais.
- Quantificar os agregados de Htt do selvagem-tipo manualmente passando pela z-pilha e marcando agregados de Htt do selvagem-tipo, certificando-se de agregados não são duplo-marcou se eles aparecem em mais de uma fatia(Figura 4).
Nota: Esta abordagem quantificação manual pode ser usada quando o número de agregados em cada pilha confocal é razoável (por exemplo, 20-50). Também é útil quando o software de análise de imagem não consegue distinguir a partitura individual de sinal circundante no mesmo canal (por exemplo, sinal de difusa tipo selvagem Htt em células vizinhas) (Figura 2B, C e a Figura 4 A). quantificação dos agregados de Htt do selvagem-tipo pode também ser um desafio porque muitas estruturas normais no cérebro aparecem punctate (por exemplo, processos celulares e sinapses). Localização co do selvagem-tipo e do mutantes Htt sinais pode ser usada como um critério de seleção; no entanto, é possível que alguns mutantes Htt "sementes" cair abaixo do limite de detecção do confocal. Uma proteína diferente Htt que não agregado nas células destinatários (por exemplo, GFP) pode ser usada para rotular independentes punctate estruturas no cérebro.
- Se os agregados são bem separados e há fluorescência de fundo mínimo, usar software de análise de imagem para identificar, quantificar e analisar os agregados como "objetos" distintos ou "superfícies" em uma reconstrução 3D a pilha confocal (sistematicamente Figura 3 B).
- Use o software de análise de imagem para executar outras caracterização dos agregados individuais. Por exemplo, determinar a distribuição de tamanho dos agregados (Figura 3C), localização de co por cento entre mutantes e selvagem-tipo Htt proteínas (Figura 4A), ou diretamente medir interações da proteína-proteína usando (FRET Figura 4 B).
- Determine a distribuição de tamanho de partitura individual usando um algoritmo de deteção de superfície ou ponto que identifica com precisão todos os agregados visíveis em um determinado canal. Usar o software de análise de imagem para tomar medidas pertinentes das manchas ou superfícies, por exemplo obter 'diâmetro agregado' (Fig. 3, C), 'volume' ou 'intensidade' informação de 'Medidas' no assistente de "Análise" do software descrita na etapa 5.2.1.
Nota: Na Figura 3C, nós relatamos a distribuição de diâmetros para todos os HttQ91-mCherry partitura identificado em um único glomérulo DA1. - Determine a localização de co por cento entre YFP-HttQ25 e HttQ91-mCherry agregados movendo manualmente pedaço por pedaço, através de uma pilha-z confocal (método mais preciso). No entanto, tome cuidado para não contar qualquer agregados duas vezes. Para evitar isso, só conte agregados em uma determinada fatia-z se o plano de foco é através do centro do agregado(Figura 4).
- Calcule a eficiência FRET para agregados de HttQ25-YFP induzidas com sinal de HttQ91-mCherry colocalized usando o método de fotobranqueamento aceitador.
- Em primeiro lugar, elimine potenciais-conversas cruzadas entre canais YFP e mCherry, estabelecendo-se janelas de deteção para sinais YFP-somente e somente mCherry que não produzem nenhum sinal em outro canal. Usando essas configurações, tomar um 'antes de imagem' de individuais HttQ25-YFP partitura e seu associado HttQ91-mCherry de sinal ( Figura 4B).
- Em seguida, photobleach o mCherry sinal ajustando o laser vermelho (por exemplo, 552 nm) para 100% de intensidade e digitalização até o sinal desapareceu. Reverta para as configurações usadas para o 'antes de imagem' e levar uma imagem' depois' da mesma partitura (Figura 4B).
- Calcule as medidas de intensidade de fluorescência para cada punctum antes e depois de fotobranqueamento usando software de análise de imagem.
- Calcular a eficiência do FRET subtraindo fluorescência de doador YFP medida na 'antes de imagem' (YFPinicial) de fluorescência do doador YFP na imagem do' depois' (YFPfinal). Dividir esse valor por YFPfinale multiplique por 100.
Nota: FRET eficiência pode ser calculada, pixel por pixel ou global para cada agregado de HttQ25-YFP (Figura 4B). Aceitador fotobranqueamento é uma técnica particularmente útil para calcular o FRET eficiência quando o sinal de mCherry associado com cada HttQ25-YFP punctum é suficientemente alto para produzir detectável YFP dequenching após mCherry fotobranqueamento.
- Determine a distribuição de tamanho de partitura individual usando um algoritmo de deteção de superfície ou ponto que identifica com precisão todos os agregados visíveis em um determinado canal. Usar o software de análise de imagem para tomar medidas pertinentes das manchas ou superfícies, por exemplo obter 'diâmetro agregado' (Fig. 3, C), 'volume' ou 'intensidade' informação de 'Medidas' no assistente de "Análise" do software descrita na etapa 5.2.1.
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Representative Results
Os métodos descritos aqui produzem dados robustos, demonstrando o prião, como transferência de agregados de proteína de Htt da população de uma célula para outra na mosca da intacta CNS. Conversão de tipo selvagem Htt de difusa para punctate é observado por fluorescência direta desta proteína de fusão YFP na glia destinatário como resultado da expressão de HttQ91-mCherry em ORNs doador (Figura 2A C e a Figura 4A, B). Relatórios precisos de eventos de prião, como transferência entre essas populações de dois célula exige cuidadosa seleção de moscas transgênicas e Gal4/QF drivers para produzir níveis de expressão forte de mutantes e selvagem-tipo Htt transgenes sem qualquer sobreposição durante desenvolvimento ou na idade adulta. Além disso, projeto pensativo de transgenes de fusão a proteína fluorescente-Htt pode habilitar poderosas análises a jusante. Por exemplo, mutantes e selvagem-tipo Htt agregados podem ser quantificado como objetos punctate também manualmente (Figura 2C e Figura 4) ou usando o software de análise de imagem (Figura 3A, B), pode ser medido e caracteriza-se ainda mais como populações agregadas (Figura 3C), pode ser avaliado para localização co entre mutantes e selvagem-tipo proteínas (Figura 4A) e pode ser analisado para FRET27 (Figura 4 B). Essas análises exigem a fusão de mutante e selvagem-tipo Htt para etiquetas de proteína fluorescente com propriedades de fluorescência suficientemente separados, mas com suficiente sobreposição espectral para habilitar FRET entre doador e aceptor pares (por exemplo, PCP/YFP9 ou YFP/mCherry27).
Figura 2 . Imagens confocal de prião, como conversão de HttQ25-YFP glia por neuronais agregados de HttQ91-mCherry. Máximo (A) projeção de intensidade de ~ 30 µm de fatias confocal mostrando um lóbulo da antena de uma mosca masculina expressando HttQ91-mCherry (vermelho) em axônios DA1 ORN usando Or67d-QF e HttQ25-YFP (verde) na glia usando repo-Gal4. Os limites aproximados do lóbulo da antena e glomérulo DA1, onde axônios DA1 ORN terminar, são indicados pelas linhas pontilhadas e sólidas, respectivamente. (B) máxima projeção de intensidade de ~ 20 µm de fatias confocal, mostrando uma visão ampliada da região glomerular DA1 da. (C) A única 0,35 µm confocal fatia mostrando uma única partitura HttQ25-YFP e seus associados (de sinal de HttQ91-mCherry indicado pela seta em cada canal). O sinal no canal vermelho foi aprimorado para visualizar localização co entre HttQ25-YFP e sinais de HttQ91-mCherry. Todas as imagens foram adquiridas utilizando um objectivo de óleo 40 X 1.4NA. Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Análise tridimensional de agregados de HttQ91-mCherry em axônios DA1 ORN. (A), um 3D representação dos agregados de HttQ91-mCherry expressado no glomérulo através de Or67d-QF usando os mesmos dados mostrados na Figura 2BDA1. (B) uma screenshot mostrando objetos individuais ou "pontos", identificados a partir dos dados brutos em (A) usando um pacote de software de análise de imagem. O software identificou 56 objetos de tamanhos variados nesta imagem/canal. O local indicado pela seta em (B) foi medido para ter um diâmetro de ~ 1,2 µm. setas apontam para locais onde dois objetos são imprecisamente mesclados em um ponto pelo software, provavelmente devido à proximidade da partitura individual. Para superar isso, configurações de limiarização diferentes devem ser testadas no software e/ou manchas mescladas devem ser separadas manualmente se possível. Barras de escala = 10 µm. histograma (C) mostrando a distribuição de diâmetros medidos pelo software para o HttQ91-mCherry "manchas", mostradas em (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Co-localização e análise de traste de induzido agregados YFP-HttQ25. (A), A montagem de 4 0,35 µm confocal z-fatias individuais de um cérebro masculino de mosca expressando em DA1 ORNs usando Or67d-QF e HttQ25-YFP na glia usando repo-Gal4 HttQ91-mCherry. Os sinais foram ajustados para que mesmo pequenos agregados de HttQ91-mCherry são visíveis e induzida HttQ25-YFP agregados destacam-se em torno de sinal difuso. As fatias mostradas são cada um separado por ~ 1,0 µm (fatia número indicado no canto inferior direito das imagens mescladas) para que os vários agregados podem ser observados. As setas indicam HttQ25-YFP partitura que estavam determinados a ser em ou perto de foco em que z-fatia particular movendo manualmente através da z-pilha. Dos sete HttQ25-YFP partitura indicado aqui, seis têm associado um sinal de HttQ91-mCherry (ou seja, 86% dos agregados HttQ25-YFP co localizar com HttQ91-mCherry). Note que o sinal de mCherry associado com HttQ25-YFP partitura é muitas vezes mais fraco do que a maioria dos mCherry-positivo partitura no glomérulo DA1. Barra de escala = 5 µm. (B) A HttQ25-YFP/HttQ91-mCherry-co-localizados punctum antes (painéis à esquerda) e depois (direita painéis) mCherry (aceitador) fotobranqueamento. O resultante aumento na fluorescência YFP (doador) foi usado para produzir uma imagem de eficiência (FRETFEP) FRET pixel por pixel usando o AccPbFRET plug-in para ImageJ46. Este agregado particular tem um total FRETFEP de 61%. Barra de escala = 1 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como o número de pacientes que sofrem de doenças neurodegenerativas continua a aumentar, há uma necessidade urgente de aumentar a compreensão da patogênese molecular dessas doenças para que melhor terapias podem ser desenvolvidas. Aqui, descrevemos os métodos que permitem a monitorização do prião, como transmissão de agregados de proteínas patogênicas entre diferentes tipos de células no organismo modelo, Drosophila melanogaster. Recentemente usamos esta metodologia para demonstrar prião, como transmissão de mutante Htt agregados na vivo e identificar um receptor fagocítica que medeia a propagação destes agregados de neurônios, glia27. Nossa abordagem explora diversas vantagens do uso de drosófila para estudar doenças genéticas humanas: seu ciclo de vida curto e vasta toolset genética, que pode acelerar a descoberta de informações biológicas básicas terapeuticamente relevante.
Os métodos que descrevemos aqui oferecem duas grandes vantagens sobre outros animais existentes e celular modelos de cultura para a transmissão de príons, como: (1) o agente causador agregação (por exemplo, mutant Htt) é produzido em uma célula que residem em um tecido intacto e (2) expressão da versão normalmente dobrado da mesma proteína (por exemplo, selvagem-tipo Htt) em uma população de células separadas prevê príon como eventos prontamente acessível "repórter". Conseguimos fazer expressão de mutante e proteínas de Htt selvagem-tipo de não-sobreposição de populações de células dentro do mesmo organismo usando ferramentas sofisticadas de genéticas que estão bem estabelecidas em Drosophila40. Porque muitos diferentes tecido-específica Gal4 QF drivers e estão prontamente disponíveis, examinar o prião, como transferência entre essencialmente qualquer tipos distintos de células no corpo da mosca é viável.
Um componente crítico da abordagem é alcançar expressão segregado de mutante e proteínas de Htt selvagem-tipo em populações de células diferentes dentro do mesmo animal. Qualquer sobreposição de expressão precisa ser eliminado para que a agregação de Htt selvagem-tipo nas células destinatários com precisão relatórios citoplasmática penetração de príon como agregados originários de doadores células9,12,,27, 41. Isso pode ser feito através da introdução de ferramentas genéticas adicionais (por exemplo, Gal80 e QS repressores40) para aliviar esse problema. Uma vez que o genótipo ideal é projetado e selecionado, deve ser estabelecido um método sistemático para quantificar a partitura. Isto dependerá em grande medida o número de células que são rotulados, o número de agregados que aparecem e a relação sinal-ruído da amostra. Critérios como localização co e/ou FRET positiva podem ser usados para analisar os dados, como descrevemos aqui na Figura 4. No entanto, restringindo a seleção do selvagem-tipo Htt agregados baseados estas características podem levar a subestimação dos eventos de prião, como transferência, desde que algumas sementes de agregação Htt mutantes podem cair abaixo do limite de detecção do microscópio confocal.
A abordagem na vivo aqui descrita não é exclusiva para o comportamento de prião de agregados associados com HD ou até mesmo outros transtornos polyQ. Moscas transgênicas podem ser desenvolvidas para examinar o prião, como propagação de alfa-synuclein em PD, tau na AD e SOD1 ou TDP-43 em ALS utilizando o mesmo paradigma experimental. Para cada uma destas proteínas, um mutante propensas a agregação deve ser expresso em células do doador e uma versão solúvel da mesma proteína que agregados apenas quando nucleated devem ser expressos em células do destinatários. Este paradigma experimental também pode ser útil para investigar a ideia emergente que patogénicos proteínas associadas com doenças diferentes podem interagir através de um mecanismo de cruz-semeadura47. Finalmente, as inumeráveis ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila podem ser aplicadas para investigar e identificar o mecanismo (s) molecular subjacente citoplasma-para-citoplasma espalhamento de agregados de proteínas patogénicos associados a estas doenças fatais.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a membros dos laboratórios Kopito, Luo e Pearce para muitas discussões útil durante o desenvolvimento desses métodos. Agradecemos também o Brian Temsamrit pela leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi financiado por fundos da Universidade das Ciências e as confianças Charitable W.W. Smith.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
| Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
| 20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
| Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
| Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
| FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
| Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
| Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
| Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
| LAS X image analysis software | Leica | ||
| Imaris image analysis software | Bitplane |
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