Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Overvågning celle til celle Transmission af Prion-lignende Protein aggregater i Drosophila Melanogaster

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56906
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences

Summary

Akkumulere beviser støtter tanken om, at patogene protein aggregater tilknyttet neurodegenerative sygdomme spredes mellem celler med prion-lignende egenskaber. Her, beskriver vi en metode, der giver mulighed for visualisering af celle til celle spredning af prion-lignende aggregater i model organisme, Drosophila melanogaster.

Abstract

Protein sammenlægning er et centralt element i de fleste neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntington's chorea (HD) og Amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Protein aggregater er tæt forbundet med neuropatologiske i disse sygdomme, selv om de nøjagtige mekanisme som afvigende protein sammenlægning forstyrrer normal cellulære homeostase ikke er kendt. Nye data yde stærk støtte til hypotesen at patogene aggregater i Annoncen, PD, HD, og ALS har mange ligheder med prioner, som er kun protein-smitstoffer ansvarlig for transmissible spongiforme encephalopatier. Prioner replikere selvstændige ved templating omdannelse af naturlig foldet versioner af den samme protein, forårsager spredning af sammenlægning fænotype. Hvordan prioner og prion-lignende proteiner i Annoncen, PD, HD og ALS flytte fra én celle til en anden er i øjeblikket et område med intens efterforskning. Her, er en Drosophila melanogaster model, der tillader overvågning af prion-lignende, celle til celle transmission af mutant huntingtin (Htt) aggregater forbundet med HD beskrevet. Denne model tager fordel af kraftfulde værktøjer til at manipulere transgen udtryk i mange forskellige Drosophila væv og udnytter en fluorescently markeret cytoplasmatiske protein til direkte rapport prion-lignende overførsel af mutante Htt aggregater. Vigtigere, kan den tilgang, vi beskriver her bruges til at identificere nye gener og veje, der mægle spredning af protein aggregater mellem forskellige celle typer in vivo. Oplysninger fra disse undersøgelser vil udvide den begrænsede forståelse af de patogene mekanismer, der ligger til grund for neurodegenerative sygdomme og afsløre nye muligheder for terapeutisk intervention.

Introduction

Prion hypotese, at smitstof ansvarlig for transmissible spongiforme encephalopatier (fx, Creutzfeldt - Jakobs sygdom hos mennesker, scrapie hos får, kronisk spilde sygdomme hos hjorte og elg og "kogalskab" i kvæg ) er udelukkende sammensat af protein og blottet for nukleinsyrer1. I prionsygdomme forudsætter den cellulære prionprotein (PrPC) en uoriginal, stabil fold (PrPSc), der er yderst beta ark-rige og kan selv overføre ved konvertering og rekruttere monomere PrPC molekyler til stabil amyloid aggregater. PrPSc aggregater bruge denne selvkopierende mekanisme til at sprede mellem forskellige celler i en organisme og endda mellem individuelle organismer2.

Protein misfoldning og sammenlægning er også et centralt element i de fleste neurodegenerative sygdomme (Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntington's chorea (HD) og Amyotrofisk lateral sklerose (ALS))3. Dannelsen af samhandelen eller ekstra cellular aggregerede protein forsamlinger i disse sygdomme er tæt forbundet med cytotoksicitet4 og skrider frem langs stærkt reproducerbare og sygdoms-specifikke stier gennem hjernen over tid5, 6. disse mønstre for spredning tyder på, at patogene aggregater forbundet med disse forstyrrelser har prion-lignende egenskaber. Stærk støtte findes nu for prion-lignende transmission af aggregater tilknyttet annonce, PD, HD og ALS - de sprede sig fra celle til celle og skabelon en konformationel ændring af monomere former af de samme protein i tidligere upåvirket celler7, 8.

Fleste studier undersøger prion-lignende spredning af protein aggregater til dato har været udført med pattedyr celle kultur modeller, hvor aggregater transfer i cytoplasma af naive celler fra det ekstracellulære rum eller fra en anden celle cytoplasmaet9,10,11,12,13,14,15, eller ved at indsprøjte aggregat-holdige materiale i mus hjerner og overvågning samlede udseende uden for indsprøjtning arbejdsplads16,17,18,19,20,21,22, 23. mere for nylig, transgene dyr har været brugt til at demonstrere, intracellulære aggregater bredte sig til andre celler i intakt hjerner24,25,26,27, 28,29,30. Her, beskriver vi en metode til direkte visualisering af samlet overførsel mellem individuelle celler i Drosophila melanogasterintakt hjernen. Drosophila modeller af HD/polyglutamin (polyQ) sygdomme blev først udviklet næsten to årtier siden31,32 og har givet mange uvurderlig indsigt i de patogene mekanismer, der ligger bag disse lidelser 33. HD er en arvelig neurodegenerative lidelse forårsaget af en autosomal dominerende mutation i genet, der koder for proteiner huntingtin (Htt)34. Denne mutation medfører ekspansion af en polyQ strækning nær Htt's N-terminus ud over en patogene tærskel på ~ 37 glutaminer, forårsager protein misfold og samlede35,36. Wild-type Htt proteiner der indeholder < 37 glutaminer i denne strækning opnå deres oprindelige fold, men kan være fremkaldt til samlede ved direkte fysisk kontakt med en Htt samlede "frø"12,27,37. Vi udnytte denne Homotypiske, nukleeret sammenlægning af vildtype Htt som en udlæsning til prion-lignende overførsel og cytoplasmatisk indtastning af mutante Htt aggregater med oprindelse i andre celler.

Bestemmelse af mekanismerne af hvilke prion-lignende aggregater kan rejse mellem celler føre til identifikation af nye terapeutiske mål for uhelbredelige neurodegenerative sygdomme. Vi tage fordel af den hurtige livscyklus, brugervenlighed og genetiske sporbarhed af Drosophila melanogaster at definere molekylære mekanismer for celle til celle spredning af mutante Htt aggregater. Vores eksperimentelle strategi beskæftiger to binære udtryk systemer tilgængelige i Drosophila, den veletablerede Gal4-specifikke opstrøms aktiverende sekvens (Gal4-UAS) system38 og den nyligt udviklede QF-QUAS system39. Kobling disse to uafhængige systemer kan begrænse udtryk for mutant og vildtype Htt transgener til forskellige cellepopulationer inden for den samme flyve40. Brug denne fremgangsmåde, undersøge vi prion-lignende spredning af mutant Htt ved at overvåge omfordeling af cytoplasmatisk vildtype Htt fra sin normalt diffuse, opløseligt tilstand til en samlet stat, en direkte konsekvens af fysisk kontakt med en pre-dannet mutant Htt samlede "frø". Konvertering af vildtype Htt af mutant Htt kan bekræftes ved hjælp af biokemiske eller Biofysisk teknikker, der rapporterer protein-protein interaktioner, såsom fluorescens resonans energi overføre (FRET)9,27,41 .

Vigtigere er, kan vi også få adgang til et stort antal af genetiske værktøjer i Drosophila at identificere gener og/eller veje, der mægle prion-lignende spredning af protein aggregater. Vi har for nylig brugt denne fremgangsmåde til at afsløre en nøglerolle for celle overflade skyllevæske receptor, Draper42,43, i at overføre mutante Htt aggregater fra neuronal axoner til nærliggende fagocyterende glia i Drosophila centrale nervesystem (CNS)27. Således, den genetiske og imaging-baserede tilgang, som vi beskriver her kan afsløre vigtige grundlæggende biologiske oplysninger om en sygdom-relevante fænomen i simpel hen til hjælp men kraftfulde model organisme, Drosophila.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kobling Gal4 - og QF-medieret Htt transgen udtryk i Drosophila

  1. Indsamle og/eller generere transgene Drosophila melanogaster linjer, der indeholder væv-specifikke Gal4 eller QF "drivers", samt linjer, der indeholder wild-type eller mutante Htt transgener nedstrøms Gal4-UAS38 eller QF-QUAS39. Sikre, at de proteiner, der udtrykkes fra disse transgener er sammenvokset til fluorescerende proteiner eller epitop markeret at give mulighed for differentiering af mutant og vildtype Htt transgene produkter i den samme fly. Se figur 1.
    Bemærk: Vi bruger typisk exon 1 fragmenter af den menneskelige Htt-genet27. Transgene fluer kan dog i stedet genereres for at udtrykke længere Htt fragmenter eller andre gener, hvis det ønskes.
  2. Planlægge den genetiske strategi, således at mutant og vildtype Htt transgener udtrykkes i særskilt, ikke-overlappende cellepopulationer.
    1. Hvis nogen udtryk overlapning opstår, vil mutant og vildtype Htt proteiner syntetiseret i de samme celler Co samlede og forhindre påvisning af prion-lignende begivenheder. For at undgå dette, brug Gal4 og QF specifikke repressors, Gal80 og QS40, henholdsvis (figur 1). At vælge udviklingshæmmede-kontrollerede Gal4 og/eller QF drivere kan bidrage til at begrænse udtryk for mutant Htt til post mitotiske celler, at fjerne muligheden for at celledeling kan bidrage til celle til celle samlede spredning.
  3. Bruger dyrkningsbaserede standardbetingelser, mate fluer for at frembringe afkom, der udtrykker mutante Htt via QF (eller Gal4) i en "donor" celle befolkning og vildtype Htt via Gal4 (eller QF) i en "modtager" celle befolkning. Se figur 1 for en skematisk viser en mulig genetiske kombination.
    Bemærk: De QF og Gal4 drivere, der blev brugt til at generere data vist i tallene 1-4 og i vores tidligere publikation27 omfatter DA1 olfaktoriske receptor neuron (ORN) driver, Or67d-QF, og pan-glial driver, repo-Gal4.
  4. Generere kontrol fluer i parallel, der udtrykker vildtype Htt i begge QF - og Gal4-mærket cellepopulationer.
  5. Indsamle afkom af den ønskede genotype og alder dyr som passende.

Figure 1
Figur 1 . Genetiske tilgang til koblede udtryk for mutant og vildtype Htt transgener ved hjælp af QF-QUAS og Gal4-UAS binære udtryk systemer. "Celle A," er en mCherry-tagged mutante Htt protein indeholdende en patogen-længde polyQ strækning (Q91) udtrykt ved hjælp af en QF driver ligger neden for en væv-specifikke promotor en (PA"). I "celle B," er en YFP-mærket wild-type Htt indeholder en normal polyQ strækning (Q25) udtrykt via en Gal4 driver kontrolleret af væv-specifikke promotor B ("SørenB"). I tallene 2-4, Or67d-QF blev brugt til at drive QUAS-HttQ91-mCherry udtryk i DA1 ORNs og repo-Gal4 blev brugt til at udtrykke UAS-HttQ25-YFP i alle glia27. Vigtigere, er HttQ91-mCherry kun udtrykt i QF-udtrykker celler i kraft af QUAS sekvensen placeret opstrøms af transgenet. Ligeledes, HttQ25-YFP er kun udtrykt via Gal4, som udtrykkeligt anerkender UAS. Hvis nogen overlapning i væv fordelingen af QF og Gal4 driverne er fundet, kan transgener kodning QS i at udtrykke Gal4 celler og Gal80 i QF-udtrykker celler indføres. Tilføjende fluorescerende proteiner mærker på wild-type og mutant Htt giver mulighed for differentiering af de to proteiner under billedbehandling og evnen til at måle FRET mellem passende donor/acceptor par (f.eks.fælles fiskeripolitik/YFP eller YFP/mCherry). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. mikro-dissektion og fiksering af voksen Drosophila hjerner

Bemærk: Denne dissektion procedure er blevet ændret fra en tidligere publikation44, og kan bruges til at forberede imaging direkte fluorescens signal fra Htt-fluorescerende protein fusioner hjerner. Ændringer i den procedure, der kan gøres for immunfarvning hjerner er diskuteret i næste afsnit.

  1. Indsamle de følgende materialer og Anbring på is: fosfatbufferet saltopløsning med 0,03% Triton X-100 (PBS/T); microcentrifuge-rør indeholdende 970 µL af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) Fikseringsvæske opløsning fremstillet ved at tilføje 200 µL 20% PFA til 770 µL PBS/T; en klar glasskål indeholdende godt; en engangs overførsel afpipetteres; to dissekere pincet (én no. 3 og én nr. 5).
  2. Bedøver de voksne fluer ved hjælp af CO2 og overføre dem til et godt glasfad på is.
  3. Ved hjælp af en overførsel pipette, tilføje en lille mængde (~ 500 µL) af kolde PBS/T til de godt indeholdende fluer samt om en tom godt. Undgå at indføre for mange bobler, da de kan forstyrre dissektion.
  4. Placer glasfad på en flad overflade under et dissekere mikroskop og justere forstørrelsen, indtil den flyve krop fylder synsfeltet og er i fokus.
  5. Placer et par af svanehals lyskilder, så lyset er lysende begge sider af glasfad. Forankre en foldet lab væv under glasfad til at skille krop dele/kutikula under dissektion.
  6. Overføre ved hjælp af no. 3 pincet i den ikke-dominerende hånd, en enkelt flue ind i den godt indeholdende PBS/T. immobilisere flue ved at snuppe fat i sin mave med den ventrale side opad.
  7. At holde fluen fuldt neddykket i PBS/T, fjerne den flyve hoved med no. 5 pincet i den dominerende hånd. Indsæt en spids af denne pincet under hårstrået i det lille rum støder op til Snabel på den ene side af flyve hovedet. Sikre greb på hovedet ved at klemme pincet til at gribe fat i øjet fra begge sider.
  8. Fjern flyve hovedet fra sin krop ved at trække de to pincet apart. Bortskaffe flyve kroppen på en lab væv placeret i nærheden. Opretholde presset på den dominerende hånd pincet, så at flyve hovedet ikke er tabt.
  9. Position ét spidsen af no. 3 pincet i den ikke-dominerende hånd i den samme lille rum under neglebånd på anden siden af Snabel. Når placeret, knivspids pincet til at greb øjnene i det samme sted på begge sider af hovedet.
  10. Når greb på neglebånd er sikker, forsigtigt trække pincet fra hinanden ved 180°. Denne handling vil bryde apart hoved neglebånd uden at beskadige hjernen. Kassér neglebånd rester på en lab væv.
    1. Selvom ideelt, kan hoved neglebånd ikke fjernes fuldt ud i ét trin. I dette tilfælde fjerne neglebånd stykke for stykke før hjernen er fuldt eksponeret. Passe på ikke for at skade hjernen ved at undgå direkte kontakt med pincet.
  11. Fjerne dissekeret hjernen fra PBS/T, enten ved sensationsprægede fat i en vedhæftet luftrøret, eller ved sugning hjernen ind i rummet mellem pincet tips af kapillaritet.
    Bemærk: Luftrøret fjernelse er valgfri, da det har en tendens til ikke tilsløre de antennal lapper på den forreste overflade af hjernen, hvor vi typisk billede. Men hvis luftrøret forstyrre imaging, fjerne dem omhyggeligt så hjernen ikke er beskadiget af denne manipulation.
  12. Overføre flyve hjernen ind i en af microcentrifuge-rør indeholdende Fikseringsvæske løsning på is. Sikre, at hjernen frigøres fra pincet og er neddykket i opløsningen Fikseringsvæske.
  13. Når alle hjerner har været dissekeret, underkaste dem til en "short-fix" ved at placere de lukkede rør på et nutator for ~ 5 min ved stuetemperatur i mørke.
    Bemærk: Dette kort fiksering trin sikrer, at hjerner er lettere at håndtere i efterfølgende trin og ikke overholder siderne af microcentrifuge rør.
  14. Fjerne fleste af de Fikseringsvæske løsning med P1000 pipette og kassér den.
    1. Undgå sugning hjerner fra røret under dette og eventuelle efterfølgende vask trin. Indstille P1000 til en lavere lydstyrke (fx, 650 µL) og Fjern supernatanten i to trin. Desuden holde microcentrifuge-rør i overensstemmelse med en lyskilde (fx overhead lys) mens sugning for at bedre visualisere hjerner.
  15. Der tilsættes 1 mL af frisk PBS/T til hjernen. Vaskes hurtigt (< 1 min) i mørke, Aspirér supernatanten fra hjernen, og kassér.
  16. Gentag vask med PBS/T i mørke ved stuetemperatur efter følgende skema: 2 hurtig (< 1 min) vasker, 1 X 5 min., 3 X 20 min. og 1 X 1 h vask. Sikre toppe på microcentrifuge rør og placere rør på en nutator i mellem vasker.
    1. Hvis DAPI farvning ønskes, efterfulgt erstatte den endelige 1 h vask med 1 X 30 min. inkubering med 250 ng/mL DAPI fortyndes i PBS/T, af 2 X hurtig og 1 X 20 min. vasker.
  17. Efter den sidste vask, fjerne de fleste af wash buffer supernatanten, pas på ikke for at forstyrre hjerne, og tilføje 30 µL af glycerol-baserede antifade reagens til hjernen. Der inkuberes ved 4 ° C i mørke uden bevægelse i mindst 1 time og op til 24 timer.

3. ændringer til sektion 2 for immunfarvning voksen hjerne

Bemærk: Bruge denne protokol til imaging ikke-fluorescerende proteiner eller fluorescerende protein fusioner med svag fluorescens.

  1. Øge koncentrationen af Triton X-100 i PBS/T af 10-fold (PBS + 0,3% Triton X-100) for hvert skridt. Dette sikrer, at nok vaskemiddel er til stede permeabilize cellemembraner og tillade antistoffer til at få adgang til intracellulære rum.
  2. Fix hjerner i 4% PFA i PBS/T i 20 min. ved stuetemperatur.
  3. Efter udførelsen af alle vasker, inkuberes hjerner i frisklavede blokerende buffer (PBS/T + 5% normal ged serum (NGS)) i 30 min. ved stuetemperatur i mørke.
  4. Fjern og kassér den blokerende buffer. Der tilsættes 0,5 mL af primære antistof løsning pr tube udarbejdet som en master mix ved at fortynde primære antistoffer som passende i frisk blokerende buffer (Se Tabel af materialer til almindeligt anvendte antistoffer og fortyndinger). Inkuber hjerner i primære antistoffer på en nutator i mindst 24 timer ved 4 ° C i mørke.
  5. Fjerne den primære antistof løsning fra hjerner ved hjælp af en P1000 og reserve i en frisk tube. Der tilsættes 1 mL PBS/t at vaske hjerner.
    Bemærk: Den reserverede primære antistof løsning kan opbevares ved 4 ° C i op til fire uger. Vi har med succes genanvendt primære antistoffer op til to gange i efterfølgende forsøg.
  6. Vaske hjerner hurtigt (< 1 min) i PBS/T, Aspirér supernatanten fra hjerner, og kassér. Gentag denne hurtig vask en gang mere.
  7. Fortsætte vask med 1 mL PBS/T ved stuetemperatur efter følgende skema: 1 X 5 min., 3 X 20 min. og 1 X 1 h vask. Sikre toppe på microcentrifuge rør og placere rør på en nutator under vasker.
  8. Efter den sidste vask, fjerne hovedparten af PBS/T supernatanten og der tilsættes 0,5 mL sekundær antistof løsning udarbejdet som en master mix ved at fortynde antistoffer som passende i frisk blokerende buffer (Se Tabel af materialer til almindeligt anvendte antistoffer og fortyndinger). Inkuber hjerner i sekundære antistoffer i 24 timer ved 4 ° C i mørke.
  9. Gentag vask trin i trin 3.5, 3.6 og 3.7 efter inkubation med sekundære antistoffer.
  10. Efter den sidste vask, fjerne hovedparten af wash buffer og sørg for, at alle hjerner er placeret i bunden af røret. Tilføje 30 µL antifade reagens til hjernen. Der inkuberes ved 4 ° C i mørke uden bevægelse i 16-24 timer.

4. hele hjernen montering

  1. Placere et glas objektglas under et dissekere mikroskop og en etiket med id-oplysninger.
    Bemærk: Alternativt hjerner kan monteres direkte på et cover glas til at få adgang til begge sider af hjernen under imaging. En protokol, der beskriver denne montering procedure har været tidligere udgivne45.
  2. Fjerne hjerner fra hver microcentrifuge rør ved hjælp af en afrundede afpipetteres tip (tilberedt med et barberblad fjerne bunden ~ 1 cm fra en 1-200 µL spids) og overføre dem ind i midten af diaset. Overføre som lille antifade reagens med hjerner som muligt.
  3. Brug pincet til at placere hjerner i den ønskede retning (fx, dorsale peger mod toppen af dias og anteriore overflade vender opad for imaging den antennal lap). Når orientere hjerner, overveje mikroskop bruges til imaging dem lys sti.
  4. Fjern overskydende antifade reagens fra dias ved hjælp af de spidse hjørne af et foldet lab væv uden at forstyrre hjerne. Lod den glide sidde ~ 5-10 min. i mørke til at tillade hjerner til at overholde diasset.
  5. Omgiv de flyve hjerner med fire små stykker af cover glasskår placeret på hver side af hjernen til at danne et kvadrat, der er ~ 19 mm x 19 mm. Placer kanten af en 22 mm x 22 mm No. 1,5 cover glas lige uden for en af disse små stykker af glas , og sænk forsigtigt coverslip over hjerner til at fuldføre bro-mount.
  6. Langsomt dispensere friske antifade reagens for at fylde overfladen under coverslip, være omhyggelig med ikke at forstyrre coverslip eller hjerne. Aftørre eventuelle overskydende antifade ved hjælp af de spidse hjørne af et foldet lab væv uden direkte at kontakte coverslip.
  7. Tilføj en dråbe af klare og quick-tørring neglelak til hver af de fire hjørner af coverslip. Tillad for at tørre ~ 10 min. Derefter forsegle de fire kanter af coverslip med neglelak til helt omslutte hjerner.
  8. Billede hjerner umiddelbart, eller opbevares ved 4 ° C indtil klar.
    1. Hvis imaging iboende fluorescens fra Htt-fluorescerende protein fusioner, image hjerner inden for 24 timer efter det bedste signal.

5. imaging og kvantificere Prion-lignende Transmission af aggregater

  1. Billede monteret hjerner ved hjælp af en Konfokal mikroskop udstyret med en 40 X eller 60/63 X olie mål at indsamle z-skive billeder gennem regionen af hjernen, hvor de valgte Gal4 og QF drivere er udtrykt (figur 2A, B).
    1. Excite fluorescerende protein fusioner eller immunolabeled proteiner ved hjælp af passende lasere (f.eks.488 nm for normal god landbrugspraksis/YFP/FITC eller 552 nm for mCherry/Cy3). Indstille påvisning windows at fange maksimale fluorescerende signal samtidig fjerne kanal pulsoverførsel ved hjælp af enten en spektral detection system eller band/lang pass emission filtre specifikke for hver fluorophore.
      Bemærk: Være opmærksomme, når imaging protein aggregater. Det er let for pixel i midten af hver aggregat til blive mættet, især i større aggregater. Forsøg at minimere mætning i billedet, men være opmærksom på risikoen for at miste signal fra mindre aggregerede arter (figur 2B, C, D). For meget farvemætning vil øge billede baggrund, hvilket gør det sværere at identificere isolerede puncta. Teste forskellige indstillinger til at optimere før du tager de endelige billeder i hvert sæt.
  2. Analysere data af kvantificere individuelle puncta enten manuelt ved at flytte gennem individuelle z-skiver (f.eks. figur 2C og figur 4A) eller efter rendering Konfokal skiver i 3 dimensioner (figur 3 A, B).
    Bemærk: Dette kan gøres i billedet J eller andre billedbehandling software.
    1. Hvis aggregater er godt adskilt, og der er minimal baggrund fluorescens, bruge billede analyse software til systematisk at identificere, kvantificere og analysere aggregater som adskilte "objekter" eller "overflader" i en 3D rekonstruktion af Konfokal stack ( Figur 3 B).
      Bemærk: Software handlinger beskrevet er specifik for instrumentet og software, der bruges her (Se Tabel af materialer).
      1. Visualisere en Konfokal z-serie i 3D-visning. Brug guiden "Analyse" til at identificere enkelte steder i en valgte kanal (f.eks. den røde kanal for HttQ91-mCherry aggregater i figur 3). Justere tærskel og filtre til præcist repræsenterer alle uensartet størrelse aggregater som individuelle objekter i billedet.
      2. Aktiver "Split objekter" under "Binær forarbejdning forfilter" til at adskille tæt forbundet aggregeringer, der flettes anderledes af programmel algoritmen. Bemærk, at det samlede antal objekter og deres tilhørende målinger er indberettet under "Målinger."
        Bemærk: Denne metode til kvantificering mutante Htt aggregater er ikke modtagelig immunfarvning protokollen, fordi midten af amyloid aggregater, er uigennemtrængelig for antistoffer. Som et resultat, aggregater vises på mikroskopet som ring-lignende strukturer, og billedet analyse software er i stand til præcist at identificere og skelne disse individuelle "steder".
    2. Kvantificere vildtype Htt aggregater af manuelt flytte gennem z-stakken og scoring vildtype Htt aggregater, og sørg for, ingen aggregater er dobbelt-scorede hvis de optræder i mere end én Skive (figur 4A).
      Bemærk: Denne manuel kvantificering tilgang kan bruges, når antallet af aggregater i hver Konfokal stak er rimelige (f.eks.20-50). Det er også nyttigt, når billedet analyse software ikke kan skelne enkelte puncta fra omkringliggende signal i den samme kanal (fxsignal fra diffuse vildtype Htt i nærliggende celler) (figur 2B, C og figur 4 A). kvantificering vildtype Htt aggregater kan også være udfordrende fordi mange normale strukturer i hjernen vises punktformet (f.eks.celle processer og synapser). Co lokalisering af wild-type og mutante Htt signaler kan bruges som et udvælgelseskriterium; Det er imidlertid muligt, at nogle mutante Htt "frø" falde til under påvisningsgrænsen for den Konfokal. Et protein end Htt, der ikke samlet i de modtagende celler (f.eks.normal god landbrugspraksis) kan bruges til at mærke uafhængige punktformet strukturer i hjernen.
  3. Brug billede analyse software til at udføre yderligere karakterisering af individuelle aggregater. For eksempel bestemme størrelse distribution af aggregater (figur 3C), procent Co lokalisering mellem mutant og vildtype Htt proteiner (figur 4A), eller direkte måle protein-protein interaktioner ved hjælp af FRET ( Figur 4 B).
    1. Fastlægge størrelsen fordelingen af individuelle puncta ved hjælp af en plet eller overflade opdagelse algoritme, der præcist identificerer alle synlige aggregater i en bestemt kanal. Brug billede analyse software til at tage relevante målinger af pletter eller overflader, f.eks opnå samlede diameter (Fig. 3 C), 'bind' eller 'intensitet' oplysninger fra 'Målinger' i guiden software "Analyse" beskrevet taktfast 5.2.1.
      Bemærk: I figur 3C, vi rapportere fordelingen af diametre for alle HttQ91-mCherry puncta identificeret i en enkelt DA1 glomerulus.
    2. Bestemme den procentvise Co lokalisering mellem HttQ25-YFP og HttQ91-mCherry aggregater af manuelt flytte udsnit af skive gennem en Konfokal z-stak (mest præcise metode). Imidlertid passe på ikke for at tælle alle aggregater to gange. For at forhindre dette, Tæl kun aggregater i en bestemt z-skive hvis flyet af fokus er gennem midten af samlet (figur 4A).
    3. Beregne FRET effektivitet for induceret HttQ25-YFP aggregater med colocalized HttQ91-mCherry signal ved hjælp af metoden acceptor photobleaching.
      1. Først, eliminere potentielle cross-talk mellem YFP og mCherry kanaler ved at indføre registrering af windows for kun mCherry- og YFP-kun signaler, der producerer ingen signal i anden kanalen. Brug disse indstillinger, tage en 'før billede' af enkelte HttQ25-YFP puncta og deres tilknyttede HttQ91-mCherry signal ( fig. 4B).
      2. Derefter, photobleach mCherry signal ved at justere den røde laser (f.eks.552 nm) til 100% intensitet og scanne indtil signalet er væk. Vende tilbage til de indstillinger, der bruges for "før billedet', og tage en"efter billede"af den samme puncta (fig. 4B).
      3. Beregne fluorescens intensitet målinger for hver punctum, før og efter photobleaching ved hjælp af billede analyse software.
      4. Beregne FRET effektivitet ved at fratrække YFP donor fluorescens målt i den 'før billede' (YFPindledende) fra YFP donor fluorescens i den efter image (YFPsidste). Divider denne værdi af YFPendelige, og ganger med 100.
        Bemærk: FRET effektivitet kan beregnes, pixel for pixel eller samlet for hver HttQ25-YFP samlede (fig. 4B). Acceptor photobleaching er en specielt nyttig teknik til beregning af FRET effektivitet, når det mCherry signal tilknyttet hver HttQ25-YFP punctum er tilstrækkelig høj til at producere påviselig YFP dequenching efter mCherry photobleaching.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De metoder, der beskrives her producerer robuste data viser prion-lignende overførsel af Htt protein aggregater fra én celle befolkning til en anden i den intakte flyve CNS. Konvertering af vildtype Htt fra diffuse til punktformet er observeret ved direkte fluorescens af denne YFP fusion protein i modtagerens glia som følge af HttQ91-mCherry udtryk i donor ORNs (figur 2A-C og figur 4A, B). Nøjagtig indberetning af prion-lignende overførsel begivenheder mellem disse to cellepopulationer kræver omhyggelig udvælgelse af transgene fluer og Gal4/QF drivere til at producere stærke udtryk niveauer af mutant og vildtype Htt transgener uden nogen overlapning i løbet udvikling eller i voksenalderen. Gennemtænkt design af fluorescerende proteiner-Htt fusion transgener kan desuden aktivere kraftfulde downstream analyser. For eksempel, mutant og vildtype Htt aggregater kan være kvantificeret som punktformet objekter enten manuelt (figur 2C og figur 4A) eller ved hjælp af billede analyse software (fig. 3A, B) kan måles og karakteriseret som samlede populationer (figur 3C), kan vurderes for Co lokalisering mellem mutant og wild-type proteiner (figur 4A), og kan analyseres for FRET27 (figur 4 B). Disse analyser kræver fusion af mutant og vildtype Htt til fluorescerende proteiner tags med tilstrækkeligt adskilt fluorescens egenskaber, men med nok spektrale overlapning aktivere FRET mellem donor og acceptor par (f.eks., fælles fiskeripolitik/YFP9 eller YFP/mCherry27).

Figure 2
Figur 2 . Konfokal billeder af prion-lignende konvertering af glial HttQ25-YFP af neuronal HttQ91-mCherry aggregater. (A) maksimal intensitet projektion af ~ 30 µm Konfokal udsnit viser en antennal lap fra en mandlig flue udtryk for HttQ91-mCherry (rød) i DA1 ORN axoner ved hjælp af Or67d-QF og HttQ25-YFP (grøn) i glia ved hjælp af repo-Gal4. De omtrentlige grænserne for antennal lap og DA1 glomerulus, hvor DA1 ORN axoner opsige, er angivet med solid og stiplede linjer henholdsvis. (B) maksimal intensitet fremskrivning fra ~ 20 µm Konfokal udsnit viser et forstørret billede af regionen DA1 glomerulær fra A. (C) A enkelt 0,35 µm Konfokal skive viser en enkelt HttQ25-YFP puncta og dens tilhørende HttQ91-mCherry signal ( angivet med pilen i hver kanal). Signal i den røde kanal blev udvidet til at visualisere Co lokalisering mellem HttQ25-YFP og HttQ91-mCherry signaler. Alle billeder blev erhvervet ved hjælp af en 40 X 1.4NA olie mål. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Tre-dimensionelle analyse af HttQ91-mCherry aggregater i DA1 ORN axoner. (A) en 3D skildring af HttQ91-mCherry aggregater udtrykt i DA1 glomerulus via Or67d-QF ved hjælp af de samme data vist i figur 2B. (B) en screenshot viser individuelle objekter eller "pletter" identificeret fra de rå data i (A) ved hjælp af et billede analyse softwarepakke. Softwaren identificeret 56 objekter af forskellig størrelse i denne kanal/billede. Stedet angivet ved pilespidsen i (B) blev målt til at have en diameter på ~ 1,2 µm. pilene peger på steder hvor to objekter er unøjagtigt flettet ind ét sted af den software, sandsynligvis på grund af nærhed af de enkelte puncta. For at overvinde dette, afprøves forskellige tærskel indstillinger i softwaren og/eller flettede steder bør være adskilt manuelt hvis det er muligt. Skalere barer = 10 µm. (C) histogrammet viser fordelingen af diametre måles af software til HttQ91-mCherry "steder" vist i (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Co lokalisering og FRET analyse af induceret HttQ25-YFP aggregater. (A) A montage af 4 individuelle 0,35 µm Konfokal z-skiver fra en mandlig flyve hjernen at udtrykke HttQ91-mCherry i DA1 ORNs ved hjælp af Or67d-QF og HttQ25-YFP i glia ved hjælp af repo-Gal4. Signalerne blev justeret således, at selv små HttQ91-mCherry aggregater er synlige og induceret HttQ25-YFP aggregater skiller sig ud fra de omkringliggende diffuse signal. Skiverne er vist er hver adskilt af ~ 1,0 µm (Skive antallet anført i nederste højre hjørne af flettede billeder) så at flere aggregater kan observeres. Pilene angiver HttQ25-YFP puncta, der var fast besluttet på at være i eller i nærheden af fokus i denne særlige z-skive af manuelt flytte gennem z-stakken. Af de syv HttQ25-YFP puncta angivet her, har seks detectably knyttet HttQ91-mCherry signal (dvs.86% af HttQ25-YFP aggregaterne Co lokalisere med HttQ91-mCherry). Bemærk at mCherry signal i forbindelse med HttQ25-YFP puncta er ofte svagere end fleste af mCherry-positive puncta i DA1 glomerulus. Skalalinjen = 5 µm. (B) A HttQ25 YFP/HttQ91-mCherry-co-lokaliseret punctum før (venstre paneler) og efter (højre paneler) mCherry (acceptor) photobleaching. Den deraf følgende stigning i YFP (donor) Fluorescens blev brugt til at producere en pixel for pixel FRET effektivitet (FRETeff) billedet ved hjælp af AccPbFRET plug-in for ImageJ46. Dette særlige aggregat har en samlet FRETeff på 61%. Skalalinjen = 1 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som antallet af patienter, der lider af neurodegenerative sygdomme fortsætter med at stige, er der et presserende behov for at øge forståelsen for de molekylære patogenese af disse sygdomme, så bedre behandlingsformer kan udvikles. Her, beskriver vi metoder, der giver mulighed for overvågning af prion-lignende transmission af patogene protein aggregater mellem forskellige celletyper i model organisme, Drosophila melanogaster. Vi har for nylig brugt denne metode til at påvise prion-lignende transmission af mutante Htt aggregater i vivo og identificere en fagocyterende receptor, der medierer spredning af disse aggregater fra neuroner til glia27. Vores tilgang udnytter flere fordele ved at bruge Drosophila for at studere genetiske sygdom hos mennesker: dens korte livscyklus og store genetiske værktøjssæt, som kan fremskynde opdagelsen af grundlæggende biologiske oplysninger, der er terapeutisk relevant.

De metoder vi beskrive her tilbyder to store fordele i forhold til andre eksisterende dyr og celle kultur modeller for prion-lignende transmission: (1) det samle agens (fxmutant Htt) er produceret i en celle, der er bosat i en intakt væv, og (2) udtryk for den normalt foldet version af den samme protein (fxvildtype Htt) i en separat celle population giver en lettilgængelig "journalist" for prion-lignende begivenheder. Vi har opnået udtryk for mutant og vildtype Htt proteiner i ikke-overlappende cellepopulationer inden for den samme organisme ved hjælp af avancerede genetiske værktøjer, der er veletableret i Drosophila40. Fordi mange forskellige væv-specifikke Gal4 og QF drivere er let tilgængelige, er undersøge prion-lignende overførsel mellem hovedsagelig nogen forskellige celletyper i flyve kroppen muligt.

Et afgørende element i metoden er at opnå segregeret udtryk for mutant og vildtype Htt proteiner i forskellige cellepopulationer inden for samme dyr. Ethvert udtryk overlapning skal fjernes, således at vildtype Htt sammenlægning i modtagerens celler rapporterer cytoplasmatisk penetration af prion-lignende aggregater med oprindelse i donor celler9,12,27, 41. Dette kan opnås ved at indføre yderligere genetiske værktøjer (f.eks., Gal80 og QS repressors40) til at afhjælpe dette problem. Når den ideelle genotype er designet og valgt, skal en systematisk metode til kvantificering af puncta etableres. Dette vil i høj grad afhænge af antallet af celler, der er mærket, antallet af aggregeringer, der vises, og signal-støj-forholdet af prøven. Kriterier såsom Co lokalisering og/eller positive FRET kan bruges til at analysere dataene, som vi har beskrevet her i figur 4. Imidlertid kan begrænser udvalg af vildtype Htt aggregater baseret på disse funktioner føre til undervurdering af prion-lignende overførsel begivenheder, da nogle mutante Htt samlede frø kan falde til under påvisningsgrænsen af Konfokal mikroskop.

I vivo fremgangsmåde beskrevet her, er ikke eksklusivt for prion-lignende opførsel af aggregater forbundet med HD eller selv andre polyQ lidelser. Transgene fluer kan udvikles for at undersøge prion-lignende spredning af alfa-synuclein i PD, tau i Annoncen, og SOD1 eller TDP-43 i ALS ved hjælp af den samme eksperimentelle paradigme. For hver af disse proteiner, bør en sammenlægning-tilbøjelige mutant udtrykkes i donor celler og en opløselig version af den samme protein at kun aggregater når nukleeret bør udtrykkes i modtagerens celler. Denne eksperimentelle paradigme kan også være nyttig for at undersøge den nye idé at patogene proteiner forbundet med forskellige sygdomme kan interagere via en cross-seeding mekanisme47. Endelig, de utallige tilgængelige i Drosophila genetiske værktøjer kan anvendes til at undersøge og identificere molekylære mekanismer bag cytoplasma til cytoplasma spredning af patogene protein aggregater forbundet med disse dødelige sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takke medlemmerne af Kopito, Luo og Pearce labs for mange nyttige diskussioner under udviklingen af disse metoder. Vi takker også Brian Temsamrit for kritisk læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af midler fra University of the Sciences og WW Smith Charitable Trusts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 ThermoFisher Scientific AM9625 Dilute to 1X
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-1L
Kimwipes Thomas Scientific 2904F24
20% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filtered Lampire Biological Laboratories 7332500 Aliquot and freeze upon receipt
Chicken anti-GFP Aves Labs GFP-1020 Use at 1:500 dilution
Rabbit anti-DsRed Clontech 632496 Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Mouse anti-Bruchpilot Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain
FITC anti-chicken ThermoFisher Scientific SA1-7200 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 568 anti-rabbit Life Technologies A11011 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody Life Technologies A21235 Use at 1:250 dilution
Slowfade Gold Antifade Reagent Life Technologies S36936
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisher Scientific 12-550-143
Cover Glass (22 x 22 mm) Globe Scientific 1404-15
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 Ted Pella 503 use in non-dominant hand
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 Ted Pella 505 use in dominant hand
LAS X image analysis software Leica
Imaris image analysis software Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
  2. Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).
  3. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting Proteostasis for Disease Intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  4. Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease. Front Neurosci. 11, 64 (2017).
  5. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  6. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  7. Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases. Lancet Neurol. 16 (4), 323-332 (2017).
  8. Walker, L. C., Jucker, M. Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept. Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).
  9. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 3138-3147 (2013).
  10. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  11. Nonaka, T., et al. Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  12. Ren, P. H., et al. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat Cell Biol. 11 (2), 219-225 (2009).
  13. Trevino, R. S., et al. Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface. J Biol Chem. 287 (35), 29722-29728 (2012).
  14. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
  15. Zeineddine, R., et al. SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation. Mol Neurodegener. 10, 57 (2015).
  16. Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O'Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways. Acta Neuropathol. 131 (1), 103-114 (2016).
  17. Clavaguera, F., et al. Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (23), 9535-9540 (2013).
  18. de Calignon, A., et al. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  19. Eisele, Y. S., et al. Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12926-12931 (2009).
  20. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  21. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  22. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
  23. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  24. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (39), 5427-5433 (2015).
  25. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
  26. Liu, L., et al. Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo. PLoS One. 7 (2), 31302 (2012).
  27. Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nat Commun. 6, 6768 (2015).
  28. Pearce, M. M. Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease. Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).
  29. Pecho-Vrieseling, E., et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons. Nat Neurosci. 17 (8), 1064-1072 (2014).
  30. Wu, J. W., et al. Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo. Nat Neurosci. 19 (8), 1085-1092 (2016).
  31. Jackson, G. R., et al. Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons. Neuron. 21 (3), 633-642 (1998).
  32. Warrick, J. M., et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93 (6), 939-949 (1998).
  33. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  34. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  35. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15005 (2015).
  36. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  37. Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity. J Mol Biol. 311 (1), 173-182 (2001).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. Riabinina, O., Potter, C. J. The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila. Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).
  41. Costanzo, M., et al. Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes. J Cell Sci. 126 (16), 3678-3685 (2013).
  42. Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function. Neuron. 38 (4), 567-580 (2003).
  43. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
  44. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  45. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  46. Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images. BMC Bioinformatics. 9, 346 (2008).
  47. Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases. Acta Neuropathol. 134 (2), 187-205 (2017).

Tags

Neurovidenskab sag 133 neurodegenerativ sygdom protein aggregat protein misfoldning prion-lignende transmission samlede spredning Drosophila neuron glia hjernen
Overvågning celle til celle Transmission af Prion-lignende Protein aggregater i <em>Drosophila Melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P.… More

Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P. Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (133), e56906, doi:10.3791/56906 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter