Akkumulere beviser støtter tanken om, at patogene protein aggregater tilknyttet neurodegenerative sygdomme spredes mellem celler med prion-lignende egenskaber. Her, beskriver vi en metode, der giver mulighed for visualisering af celle til celle spredning af prion-lignende aggregater i model organisme, Drosophila melanogaster.
Protein sammenlægning er et centralt element i de fleste neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntington’s chorea (HD) og Amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Protein aggregater er tæt forbundet med neuropatologiske i disse sygdomme, selv om de nøjagtige mekanisme som afvigende protein sammenlægning forstyrrer normal cellulære homeostase ikke er kendt. Nye data yde stærk støtte til hypotesen at patogene aggregater i Annoncen, PD, HD, og ALS har mange ligheder med prioner, som er kun protein-smitstoffer ansvarlig for transmissible spongiforme encephalopatier. Prioner replikere selvstændige ved templating omdannelse af naturlig foldet versioner af den samme protein, forårsager spredning af sammenlægning fænotype. Hvordan prioner og prion-lignende proteiner i Annoncen, PD, HD og ALS flytte fra én celle til en anden er i øjeblikket et område med intens efterforskning. Her, er en Drosophila melanogaster model, der tillader overvågning af prion-lignende, celle til celle transmission af mutant huntingtin (Htt) aggregater forbundet med HD beskrevet. Denne model tager fordel af kraftfulde værktøjer til at manipulere transgen udtryk i mange forskellige Drosophila væv og udnytter en fluorescently markeret cytoplasmatiske protein til direkte rapport prion-lignende overførsel af mutante Htt aggregater. Vigtigere, kan den tilgang, vi beskriver her bruges til at identificere nye gener og veje, der mægle spredning af protein aggregater mellem forskellige celle typer in vivo. Oplysninger fra disse undersøgelser vil udvide den begrænsede forståelse af de patogene mekanismer, der ligger til grund for neurodegenerative sygdomme og afsløre nye muligheder for terapeutisk intervention.
Prion hypotese, at smitstof ansvarlig for transmissible spongiforme encephalopatier (fx, Creutzfeldt – Jakobs sygdom hos mennesker, scrapie hos får, kronisk spilde sygdomme hos hjorte og elg og “kogalskab” i kvæg ) er udelukkende sammensat af protein og blottet for nukleinsyrer1. I prionsygdomme forudsætter den cellulære prionprotein (PrPC) en uoriginal, stabil fold (PrPSc), der er yderst beta ark-rige og kan selv overføre ved konvertering og rekruttere monomere PrPC molekyler til stabil amyloid aggregater. PrPSc aggregater bruge denne selvkopierende mekanisme til at sprede mellem forskellige celler i en organisme og endda mellem individuelle organismer2.
Protein misfoldning og sammenlægning er også et centralt element i de fleste neurodegenerative sygdomme (Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntington’s chorea (HD) og Amyotrofisk lateral sklerose (ALS))3. Dannelsen af samhandelen eller ekstra cellular aggregerede protein forsamlinger i disse sygdomme er tæt forbundet med cytotoksicitet4 og skrider frem langs stærkt reproducerbare og sygdoms-specifikke stier gennem hjernen over tid5, 6. disse mønstre for spredning tyder på, at patogene aggregater forbundet med disse forstyrrelser har prion-lignende egenskaber. Stærk støtte findes nu for prion-lignende transmission af aggregater tilknyttet annonce, PD, HD og ALS – de sprede sig fra celle til celle og skabelon en konformationel ændring af monomere former af de samme protein i tidligere upåvirket celler7, 8.
Fleste studier undersøger prion-lignende spredning af protein aggregater til dato har været udført med pattedyr celle kultur modeller, hvor aggregater transfer i cytoplasma af naive celler fra det ekstracellulære rum eller fra en anden celle cytoplasmaet9,10,11,12,13,14,15, eller ved at indsprøjte aggregat-holdige materiale i mus hjerner og overvågning samlede udseende uden for indsprøjtning arbejdsplads16,17,18,19,20,21,22, 23. mere for nylig, transgene dyr har været brugt til at demonstrere, intracellulære aggregater bredte sig til andre celler i intakt hjerner24,25,26,27, 28,29,30. Her, beskriver vi en metode til direkte visualisering af samlet overførsel mellem individuelle celler i Drosophila melanogasterintakt hjernen. Drosophila modeller af HD/polyglutamin (polyQ) sygdomme blev først udviklet næsten to årtier siden31,32 og har givet mange uvurderlig indsigt i de patogene mekanismer, der ligger bag disse lidelser 33. HD er en arvelig neurodegenerative lidelse forårsaget af en autosomal dominerende mutation i genet, der koder for proteiner huntingtin (Htt)34. Denne mutation medfører ekspansion af en polyQ strækning nær Htt’s N-terminus ud over en patogene tærskel på ~ 37 glutaminer, forårsager protein misfold og samlede35,36. Wild-type Htt proteiner der indeholder < 37 glutaminer i denne strækning opnå deres oprindelige fold, men kan være fremkaldt til samlede ved direkte fysisk kontakt med en Htt samlede "frø"12,27,37. Vi udnytte denne Homotypiske, nukleeret sammenlægning af vildtype Htt som en udlæsning til prion-lignende overførsel og cytoplasmatisk indtastning af mutante Htt aggregater med oprindelse i andre celler.
Bestemmelse af mekanismerne af hvilke prion-lignende aggregater kan rejse mellem celler føre til identifikation af nye terapeutiske mål for uhelbredelige neurodegenerative sygdomme. Vi tage fordel af den hurtige livscyklus, brugervenlighed og genetiske sporbarhed af Drosophila melanogaster at definere molekylære mekanismer for celle til celle spredning af mutante Htt aggregater. Vores eksperimentelle strategi beskæftiger to binære udtryk systemer tilgængelige i Drosophila, den veletablerede Gal4-specifikke opstrøms aktiverende sekvens (Gal4-UAS) system38 og den nyligt udviklede QF-QUAS system39. Kobling disse to uafhængige systemer kan begrænse udtryk for mutant og vildtype Htt transgener til forskellige cellepopulationer inden for den samme flyve40. Brug denne fremgangsmåde, undersøge vi prion-lignende spredning af mutant Htt ved at overvåge omfordeling af cytoplasmatisk vildtype Htt fra sin normalt diffuse, opløseligt tilstand til en samlet stat, en direkte konsekvens af fysisk kontakt med en pre-dannet mutant Htt samlede “frø”. Konvertering af vildtype Htt af mutant Htt kan bekræftes ved hjælp af biokemiske eller Biofysisk teknikker, der rapporterer protein-protein interaktioner, såsom fluorescens resonans energi overføre (FRET)9,27,41 .
Vigtigere er, kan vi også få adgang til et stort antal af genetiske værktøjer i Drosophila at identificere gener og/eller veje, der mægle prion-lignende spredning af protein aggregater. Vi har for nylig brugt denne fremgangsmåde til at afsløre en nøglerolle for celle overflade skyllevæske receptor, Draper42,43, i at overføre mutante Htt aggregater fra neuronal axoner til nærliggende fagocyterende glia i Drosophila centrale nervesystem (CNS)27. Således, den genetiske og imaging-baserede tilgang, som vi beskriver her kan afsløre vigtige grundlæggende biologiske oplysninger om en sygdom-relevante fænomen i simpel hen til hjælp men kraftfulde model organisme, Drosophila.
Som antallet af patienter, der lider af neurodegenerative sygdomme fortsætter med at stige, er der et presserende behov for at øge forståelsen for de molekylære patogenese af disse sygdomme, så bedre behandlingsformer kan udvikles. Her, beskriver vi metoder, der giver mulighed for overvågning af prion-lignende transmission af patogene protein aggregater mellem forskellige celletyper i model organisme, Drosophila melanogaster. Vi har for nylig brugt denne metode til at påvise prion-lignende transmission af…
The authors have nothing to disclose.
Vi takke medlemmerne af Kopito, Luo og Pearce labs for mange nyttige diskussioner under udviklingen af disse metoder. Vi takker også Brian Temsamrit for kritisk læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af midler fra University of the Sciences og WW Smith Charitable Trusts.
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
LAS X image analysis software | Leica | ||
Imaris image analysis software | Bitplane |