Ackumulerande bevis stöder tanken att patogena protein aggregat i samband med neurodegenerativa sjukdomar sprids mellan celler med prion-liknande egenskaper. Här beskriver vi en metod som möjliggör visualisering av cell-till-cell spridning av prion-liknande aggregat i modell organismen, Drosophila melanogaster.
Protein är ett centralt inslag i de flesta neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD) och amyotrofisk lateralskleros (ALS). Protein aggregat är nära förknippade med neuropatologi i dessa sjukdomar, även om den exakta mekanismen genom vilken avvikande protein aggregering stör normala cellulära homeostas inte är känt. Framväxande data ger starkt stöd för hypotesen att patogena aggregat i AD, PD, HD, och ALS har många likheter med prioner, som är endast protein-smittämnen ansvarar för de transmissibel spongiform encefalopati. Prioner replikerar själv mallhantering omvandlingen av inföding-viks versioner av samma protein, orsakar spridning av aggregation fenotypen. Hur prioner och prion-liknande proteiner i AD, PD, HD och ALS flytta från en cell till en annan är för närvarande ett område med intensiv utredning. Här beskrivs en Drosophila melanogaster -modell som tillåter övervakning av prion-liknande, cell-till-cell överföring av muterade huntingtin (Htt) aggregat är associerad med HD. Denna modell tar fördel av kraftfulla verktyg för att manipulera transgenens uttryck i många olika Drosophila vävnader och utnyttjar en fluorescently-taggade cytoplasmatiska protein direkt rapport prion-liknande överföring av muterade Htt aggregat. Ännu viktigare, kan den metod som vi beskriver här används för att identifiera nya gener och vägar som förmedlar spridning av protein aggregat mellan olika cell typer i vivo. Information som erhålls från dessa studier kommer att expandera den begränsade förståelsen av de patogena mekanismer som ligger bakom neurodegenerativa sjukdomar och avslöja nya möjligheter för terapeutisk intervention.
Prion hypotesen anges att smittämnet ansvarar för de transmissibel spongiform encefalopati (t.ex., Creutzfeldt – Jakobs sjukdom hos människor, skrapie hos får, kroniskt avmagrade sjukdom i hjort och älg och ”galna kosjukan” hos nötkreatur ) endast består av protein och saknar nukleinsyror1. I prionsjukdomar, cellulära prionproteinet (PrPC) utgår från en främmande, stabil vik (PrPSc) som är mycket beta ark-rika och kan själv propagera genom att konvertera och rekrytera monomer PrPC molekyler till stabil amyloid aggregat. PrPSc aggregat använder denna självreplikerande mekanism för att sprida sig mellan olika celler i en organism och även mellan enskilda organismer2.
Protein Skellefteåsjukan och aggregering är också ett centralt inslag i de flesta neurodegenerativa sjukdomar (Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD) och amyotrofisk lateralskleros (ALS))3. Bildandet av intra – eller extra – celler aggregerade protein församlingar i dessa sjukdomar är nära förknippad med cytotoxicitet4 och fortskrider mycket reproducerbara och sjukdomsspecifika vägar genom hjärnan över tid5, 6. dessa mönster sprids föreslår att patogena aggregat samband med dessa sjukdomar har prion-liknande egenskaper. Nu finns starka stöd för prion-liknande överföring av aggregat associerade med AD, PD, HD och ALS – de sprida sig från cell till cell och mall conformationaländring monomer former av samma protein i tidigare opåverkade celler7, 8.
Majoriteten av studier som undersöker prion-liknande spridningen av protein aggregat hittills har utförts med däggdjursceller kultur modeller, där aggregat transfer i cytoplasman i naiva celler från extracellulära eller från en annan cell cytoplasman9,10,11,12,13,14,15, eller genom att injicera aggregat-innehållande material i mus hjärnor och övervakning aggregera utseende utanför injektion webbplats16,17,18,19,20,21,22, 23. mer nyligen, transgena djur har använts för att demonstrera att intracellulära aggregat sprids till andra celler inom intakt hjärnor24,25,26,27, 28,29,30. Här, beskriver vi en metod för direkt visualisering av aggregerade överföring mellan enskilda celler i intakt hjärnan på Drosophila melanogaster. Drosophila modeller av HD/polyglutamine (polyQ) sjukdomar utvecklades först nästan två decennier sedan31,32 och har gett många ovärderliga insikter i de patogena mekanismerna som ligger bakom dessa sjukdomar 33. HD är en ärftlig neurodegenerativ sjukdom orsakas av en autosomal dominerande mutationen i genen som kodar för proteinet huntingtin (Htt)34. Denna mutation resulterar i expansion av en polyQ sträcka nära Htt’s N-terminalen över en patogena tröskel av ~ 37 glutaminer, orsakar proteinet till misfold och samlade35,36. Vildtyp Htt proteiner som innehåller < 37 glutaminer i denna sträcka uppnå sina infödda vika, men kan förmås att aggregera vid direkt fysisk kontakt med en Htt sammanlagda ”frö”12,27,37. Vi utnyttjar denna homotypic, kärnförsedda sammanläggning av vildtyp Htt som en avläsning för prion-liknande överföring och cytoplasmiska tillträdeet av muterade Htt aggregat med ursprung i andra celler.
Att bestämma mekanismerna genom vilka prion-liknande aggregat kan resor mellan celler leda till identifiering av nya terapeutiska mål för obotliga neurodegenerativa sjukdomar. Vi tar fördel av snabba livscykel, användarvänlighet, och genetiska tractability av Drosophila melanogaster att definiera molekylära mekanismer för cell till cell spridning av muterade Htt aggregat. Vår experimentella strategi sysselsätter två system för binärt uttryck i Drosophila, den väletablerade Gal4-specifika uppströms aktiverande sekvens (Gal4-UAS) system38 och den nyligen utvecklade QF-QUAS system39. Dessa två oberoende kopplingssystem kan begränsa uttrycket av muterade och vildtyp Htt transgener till distinkta cellpopulationer inom samma flyga40. Använder denna metod kan undersöka vi prion-liknande fördelning av mutant Htt genom att övervaka omfördelning av cytoplasmisk vildtyp Htt från normalt diffusa, lösligt tillstånd till en aggregerad stat, en direkt följd av fysisk kontakt med en förformad mutant Htt sammanlagda ”frö”. Konvertering av vildtyp Htt av mutant Htt kan bekräftas använder biokemisk eller biofysiska tekniker som rapportera protein-protein interaktioner, såsom fluorescens resonans energi överföring (bandet)9,27,41 .
Ännu viktigare, vi kan också komma åt ett stort antal genetiska verktyg i Drosophila att identifiera gener och/eller vägar som förmedlar prion-liknande spridningen av protein aggregat. Vi har nyligen använt denna metod för att avslöja en nyckelroll för cell surface gatsopare receptorn, Draper42,43i överföra muterat Htt aggregat från nervcellernas axoner till närliggande fagocytos glia i Drosophila centrala nervsystemet (CNS)27. Således kan den genetiska – och imaging-baserade strategi som vi beskriver här avslöja viktig grundläggande biologisk information om en sjukdom-relevanta fenomen i den enkel att använda men kraftfull modellorganism, Drosophila.
Eftersom antalet patienter med neurodegenerativa sjukdomar fortsätter att öka, finns det ett brådskande behov av att öka förståelsen för molekylär patogenes av dessa sjukdomar så att bättre behandlingar kan utvecklas. Här, beskriver vi metoder som möjliggör övervakning prion-liknande överföring av patogena protein aggregat mellan olika celltyper i modell organismen, Drosophila melanogaster. Vi har nyligen använt denna metod att påvisa prion-liknande överföring av muterade Htt aggregat i v…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar av de Kopito, Luo och Pearce laboratorier för många bra diskussioner under utvecklingen av dessa metoder. Vi tackar också Brian Temsamrit för kritisk läsning av detta manuskript. Detta arbete stöds av medel från University of vetenskaperna och de WW Smith Charitable trusterna.
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
LAS X image analysis software | Leica | ||
Imaris image analysis software | Bitplane |