Summary
Hier stellen wir Ihnen Techniken, um die Verformbarkeit der Erythrozyten und zelluläre Heterogenität von Ektacytometry zu messen. Diese Techniken sind für allgemeine Untersuchungen von Erythrozyten Verformbarkeit und spezifische Untersuchungen von Erkrankungen des Blutes gekennzeichnet durch das Vorhandensein von starren und verformbare Erythrozyten im Umlauf, wie Sichelzellanämie.
Abstract
Verminderten Erythrozyten Verformbarkeit ist charakteristisch für mehrere Erkrankungen. In einigen Fällen kann das Ausmaß der mangelhafte Verformbarkeit Vorhersagen, schwere der Erkrankung oder Auftreten von schwerwiegenden Komplikationen. Ektacytometry nutzt laser Beugung Viscometry um die Verformbarkeit der roten Blutkörperchen unter zunehmender Schubspannung oder einen osmotischen Gradienten auf einem konstanten Wert der angewandten Scherbeanspruchung zu messen. Direkte Verformbarkeit Messungen sind jedoch schwierig zu interpretieren, wenn heterogene Blut zu messen, die durch die Anwesenheit von starren und verformbare roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist. Dies ist aufgrund der Unfähigkeit der starren Zellen als Reaktion auf Scherbeanspruchung und Ergebnisse in einem verzerrten Beugungsmuster gekennzeichnet durch eine übertriebene Abnahme der scheinbaren Verformbarkeit richtig ausrichten. Die Messung für den Grad der Verzerrung liefert einen Indikator für die Heterogenität der Erythrozyten im Blut. Sichelzell-Anämie ist dies korreliert mit den Prozentsatz der starren Zellen widerspiegelt die Hämoglobin-Konzentration und Zusammensetzung Hämoglobin der Erythrozyten. Neben der Messung Verformbarkeit, informiert osmotischen Gradienten Ektacytometry über die osmotische Fragilität und Flüssigkeitszufuhr Status der Erythrozyten. Dieser Parameter spiegelt sich auch die Zusammensetzung der Hämoglobin der roten Blutkörperchen von Sichelzelle Patienten. Ektacytometry misst Verformbarkeit in Populationen von Erythrozyten und liefert keine, daher Informationen über die Verformbarkeit oder mechanischen Eigenschaften der einzelnen Erythrozyten. Unabhängig davon ist das Ziel der hier beschriebenen Techniken ermöglichen eine bequeme und zuverlässige Methode zur Messung der Verformbarkeit und zelluläre Heterogenität des Blutes. Diese Techniken können für die Überwachung der zeitlichen Veränderungen und Fortschreiten der Krankheit sowie Reaktion auf therapeutische Intervention in mehreren Erkrankungen nützlich sein. Sichelzellenanämie ist eine gut charakterisierte Beispiel. Andere möglichen Störungen, wo Messungen der Verformbarkeit der Erythrozyten und/oder Heterogenität von Interesse sind, gehören Blut Lagerung, Diabetes, Plasmodium Infektion, Eisenmangel und hämolytische Anämien aufgrund von defekten Membran.
Introduction
Ektacytometry bietet ein bequem Maß für die Verformbarkeit der Erythrozyten als Reaktion auf Veränderungen der Schubspannung (gemessen in Pascal (Pa)) oder mittlere Osmolalität auszusetzen. Relevante Parameter der Verformbarkeit der Erythrozyten enthalten die maximale Dehnung Index (EI-Max), ein Maß für die maximale Verformbarkeit der Erythrozyten als Reaktion auf zunehmende Schubspannung und Schubspannung ½ (SS ½), der Schubspannung erforderlich, um die Hälfte Maximal zu erreichen Verformbarkeit. 1 osmotischen Gradienten Ektacytometry hat mehrere informative Parameter. Dazu gehören die Dehnung Index mindestens (EI Min), ein Maß für die Oberflächen-Volumen-Verhältnis und der Osmolalität, zu dem er auftritt (O Min), das ist ein Maß für die osmotische Fragilität. EI-Max und der Osmolalität, zu der er auftritt (O (EI-Max)) geben Auskunft über Flexibilität und Zelle Membranfläche. Halbe maximale Dehnung im Studienarm mit hypertonen des osmotischen Gradienten wird durch EI hyper dargestellt. EI hyper und der Osmolalität, zu der er auftritt, O hyper, geben Aufschluss über die intrazelluläre Viskosität der roten Zelle bestimmt durch Hämoglobin-Konzentration. 2 , 3 Messung Verformbarkeit im heterogenen Blut wird durch die Tatsache erschwert, die starre Zellen, wie Sichelzellen Erythrozyten nicht richtig mit der Richtung der Strömung wie verformbaren Zellen in Reaktion auf die steigende Schubspannung ausrichten. Anstatt eine charakteristischen elliptischen Beugung Bild, produzieren starre Zellen eine sphärische Muster führt zu einem rautenförmigen Beugungsmuster wenn überlagert auf der Ellipse von verformbaren Zellen produziert. 4 , 5 , 6 das kugelförmige Muster nachweislich irreversibel Sichelzellen Zellen entsprechen, indem die Ektacytometry auf isolierte Bruchteile von Zellen nach Dichte Zentrifugation. 6 die Dehnung Indexberechnung umfasst Maßnahmen der langen und kurzen Achse der Ellipse. eine Rautenform produziert also eine scheinbare Abnahme der Dehnung durch Erhöhung der Breite der kurzen Achse. 7 es hat bisher gezeigt, dass der Grad der Beugung Muster Verzerrung mit der Prozentsatz der Sichel Hämoglobin (HbS) und der Anteil der Sichelzellen Zellen im Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie korreliert ist. 5 der Grad der Beugung Muster Verzerrung erhalten Sie durch komplexe mathematische Analysen. 8 es kann auch erreicht werden durch Anpassung der Öffnung der Kamera Blende auf die Ektacytometer oder die graue Ebene der Anpass-Software um die Beugung Muster Höhe ändern. 5 allerdings Einzelheiten darüber, wie man den grauen Pegel sind nicht klar definiert und die Blende der Kamera ist nicht leicht zugänglich auf der neuesten Generation der im Handel erhältlichen Ektacytometer. Um diese Probleme zu umgehen, kann leicht zugängliche Kameraverstärkung zur Beugung Muster Höhen einstellen. 9 mit dieser Methode, um zelluläre Heterogenität zu schätzen, kann der Grad der Beugung Muster Verzerrung mit dem Prozentsatz des fetalen Hämoglobins im Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie korreliert werden. 10 verschiedene osmotischen Gradienten Ektacytometry Parameter sind ebenso korreliert mit der Anteil der fetalen oder Sichel Hämoglobin im Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie. Beugung Muster Verzerrung Korrelationen wahrscheinlich spiegeln den Beitrag der Hämoglobin-Zusammensetzung auf den Prozentsatz der starren, nicht verformbaren Zellen. Weitere Sehenswürdigkeiten erfährt das gesamte osmotischen Gradienten Ektacytometry Profil biphasische Änderungen, die den Prozentsatz der dichten Zellen im Umlauf während Sichelzelle Krise entsprechen. 11
Ektacytometry ist ebenso nützlich in der Studie von einigen anderen Störungen. Osmotischen Gradienten Ektacytometry ist diagnostisch für geerbte Erythrozyten Membran Erkrankungen, wie z. B. erbliche Spherocytosis, erbliche Elliptocytosis und erbliche Pyropoikilocytosis. 3 , 12 , 13 , 14 erniedrigter Verformbarkeit tritt in einem Eisenmangel. 15 Charakterisierung der "Lagerung Läsion" des Blutes beschäftigt Ektacytometry und Zukunftsforschung untersucht sowohl die Art der Läsion und Interventionen zur Verhinderung der Bildung bei der Lagerung von Blutkonserven werden voraussichtlich in den Genuss der hier vorgestellten Techniken. 16 erniedrigter Erythrozyten Verformbarkeit hat auch mit mikrovaskuläre Erkrankungen bei Diabetes korreliert. 17 Studien Verknüpfung Hyperglykämie, schlage Erythrozyten Ascorbat Konzentrationen und osmotische Fragilität dieser Faktoren in der Entwicklung von mikrovaskuläre Erkrankungen wichtig sein können. 18 Ektacytometry Studien sind derzeit im Gange, diese Hypothese zu untersuchen (Parrow und Levine, unveröffentlichte Daten). Blut-Bühne-Malaria-Infektion ist eine weitere interessante Möglichkeit Erythrozyten Verformbarkeit Untersuchungen. Zelluläre Verformbarkeit von Plasmodium Falciparum infizierten roten Blutkörperchen sinkt drastisch während der 48 Stunden der intrazellulären Reifung des Parasiten von Ring Bühne Schizont Bühne. Deutet darauf hin, dass diese geringere Verformbarkeit bei der Reifung des Parasiten umgekehrt wird. Die Auflösung fällt mit Freisetzung von infizierten Erythrozyten in den Blutkreislauf. Geringere Verformbarkeit wird gedacht, um durch Plasmodium Proteine vermittelt, die Sequestrierung der roten Zelle fördern. 19 diese Studien stellen eine kleine Auswahl von klinisch relevanten Bedingungen wo Mess Verformbarkeit der Erythrozyten und osmotischen Gradienten Parameter relevant sind. Mehrere weitere Studienbereiche vorhanden sein.
Alternative Verfahren zur Messung der Verformbarkeit der Erythrozyten gehören optische Pinzette (auch bekannt als Laser-fallen), die die physikalischen Eigenschaften von Photonen verwenden, um einzelne Erythrozyten in eine oder mehrere Richtungen zu dehnen. 20 diese Technik hat den Vorteil, die Verformbarkeit der einzelnen Erythrozyten zu messen aber einige Unsicherheiten bei der Kraft-Kalibrierung hat beträchtliche Variabilität über Studien 21 produziert und Datenanalyse arbeitsintensiv sein kann, wenn automatisiert. 22 Mikropipette Aspiration, die Unterdruck verwendet, um eine Erythrozyten in einer Mikropipette Aspirieren, wurde auch eingesetzt, um Verformbarkeit der Erythrozyten zu messen. 7 , 23 mehrere Messungen, wie der Druck erforderlich, um die rote Zelle Aspirieren sind möglich mit jeder Maßnahme, die verschiedenen Merkmale der roten Zelle definieren. 23 Rasterkraftmikroskopie ist eine hohe Auflösung-Technik, die Steifigkeit der Membran misst durch Quantifizierung der Laserstrahl Durchbiegung als Indikator der Freischwinger Auslenkung entlang der Oberfläche einer Zelle rot. 24 diese Techniken bieten Informationen über die einzelnen Erythrozyten, sind nicht leicht angepasst, um Veränderungen in Populationen von Erythrozyten zu messen, und im Allgemeinen erfordern erhebliche technische Expertise.
Der Wunsch, individuelle und Populationen von Zellen gleichzeitig probieren hat zu Fortschritten in der Automation und der Entwicklung der Mikrofluidik und Array-basierte Methoden geführt. Wie Ektacytometry Rheoscopy misst Verformbarkeit als Funktion der Schubspannung, sondern Bilder direkt per Mikroskop erworben werden. 25 für höheren Durchsatz Analysen wurde automatisierte Zelle Bildgebung eingesetzt, um Verformbarkeit Verteilungen durch die Rheoscope zu produzieren. 26 zellulären Heterogenität kann mit dieser Methode quantifiziert werden, wenn Daten bei einer gesunden Person zur Verfügung stehen. 27 Mikrofluidik Techniken erlauben auch für hohen Durchsatz Analysen einzelner Zellen; mehrere Designs mit Anpassungen der Filtration,28 Zelle Transit Analysatoren,29 , den Zeitaufwand für eine Erythrozyten-Strömung durch eine Zusammenarbeit misst, und Alternativen, die den Druck für Erythrozyten Transit eher messen als Zeit 30 entstanden sind. Eine weitere Plattform für hohen Durchsatz-Analyse einzelner Zellen ist die einzelne Zelle Microchamber Array Chip, hat den zusätzlichen Vorteil, dass für nachgeschaltete Fluoreszenz basierende Charakterisierung der Zellen. 31 Obwohl jede dieser Techniken ist potenziell nützlich und kann für bestimmte Anwendungen überlegen, die komparativen Vorteile der Ektacytometry umfasst Empfindlichkeit, einfache Handhabung und Präzision. Besitzen Sie 32 die neueste Generation von im Handel erhältlichen Ektacytometers auch große Vielseitigkeit in der Anzahl der Tests, die durchgeführt werden können.
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Protocol
Alle Themen in dieser Studie gab schriftliche Einwilligungserklärung gemäß der Deklaration von Helsinki und den nationalen Instituten der Gesundheit Institutional Review Board genehmigt-Protokollen.
1. Einschalten der ektacytometer
- Verbinden Sie den Schlauch aus der Reinigungslösung in den niedrigen und hohen Osmolar Polyvinylpyrrolidon (PVP) Lösungen. Achten Sie darauf, die hohe Osmolar Lösung die 0 Osmolar der niedrigen Osmolar Lösung und 500 Osmolar Rohr herstellen.
Hinweis: Die niedrige Osmolar PvP-Lösung hätte eine Osmolalität zwischen 35 und 55 Milliosmoles pro Kilogramm (mOsm/kg), ein pH-Wert von 7,25-7.45 bei 25 ° C und eine Viskosität zwischen 27,0 und 33,0 Centipoise (cP) bei 37,0 ± 0,5 ° C. Die hohe Osmolar PvP-Lösung hätte eine Osmolalität zwischen 764 und 804 mOsm/kg, einen pH Wert von 7,25-7.45 bei 25 ° C und eine Viskosität von 27,0 33,0 cP bei 37,0 ° 0,5 ° C. - Sicherstellen Sie, dass die Bob in die Tasse vollständig abgesenkt wird. Starten Sie die Software und das Gerät entlüften (Hardware überprüfen | Instrument IO). Lassen Sie das Instrument den Priming-Zyklus abgeschlossen. Sobald der Zyklus abgeschlossen ist, heben Sie die Bob aus dem Becher und trocknen Sie vollständig der Bob und den Pokal mit einem niedrigen Flusen Reinigung Gewebe.
Hinweis: Restwasser wird Erythrozyten, Herstellung von Störungen aufzulösen.
2. Messung Verformbarkeit als Funktion der Erhöhung der Schubspannung
- Blut (weniger als 1 mL ist ausreichend, um diese Techniken mit repliziert) in Fläschchen mit einem geeigneten Antikoagulans zu erhalten.
Hinweis: EDTA wird über Heparin bevorzugt, weil es weniger Einfluss auf die Hemorheological Parameter hat. 33 halten bei Raumtemperatur, wenn Messungen, innerhalb von 6 Stunden Blut durchgeführt werden Blutabnahme. - Mischen Sie vorsichtig Vollblut Probe vor der Prüfung durch Umdrehen der Flasche mehrmals. 5 mL Iso Osmolar PvP-Lösung 25 µL Vollblut hinzufügen, indem pipettieren, Kappe das Fläschchen und durch invertieren mehrmals vorsichtig mischen. Die Iso Osmolar PvP-Lösung hätte eine Osmolalität zwischen 284 und 304 mOsm/kg, einen pH-Wert von 7,3-7,4 bei 25 ° C und einer Viskosität von 27,0 33,0 cP bei 37,0 ± 0,5 ° C.
- Wählen Sie auf der Software die Verformbarkeit aus dem Hauptmenü. Erstellen Sie eine neue Analyse und experimentelle Details hinzufügen (Verformbarkeit | Fügen Sie gewünschte Details | Okay).
- Deckel, Ektacytometer, stellen Sie sicher, dass die Bob vollständig in Tasse abgesenkt wird und die Tasse drehen.
- Fügen Sie 1 mL PVP Blut-Lösung in den Raum zwischen den Pokal und Bob durch pipettieren.
- Heben Sie den Bob leicht, um Proben zu senken. Warten Sie, bis alle Luftblasen aus der Lösung bewegt haben, dann schließen Sie den Deckel auf die Ektacytometer. Drücken Sie ggf. die Aspiration-Taste, um Luftblasen zu entfernen helfen.
- Den Gewinn auf 200 durch Verschieben des Pfeils entlang der Scroll-Leiste auf die Software anpassen (siehe Hinweis). Wenn die Temperatur stabil bei 37 ° C und die Beugung Bild ist stabil, start (Start) drücken.
Hinweis: Für viele Studien erhalten Sie eine gute Beugung Bild von gesundes Blut (Hämoglobin Konzentration > 12,0 g / dL, mittlere korpuskuläre Volumen von 80-96 fL und mittlere korpuskuläre Hämoglobin-Konzentration von 33-36 g/dL) mit der Kamera-Gewinn auf 200 gesetzt. Für Untersuchungen des Blutes von Sichelzell-Anämie ist Anpassung der Kameraverstärkung um ein 4,5 cm Beugung Bild zu erzeugen als die Standardeinstellung um einen Vergleich der Ergebnisse über Studien und Labors vorgeschlagen worden. 9 - Beugungsmuster als Daten Erwerb fortschreitet, um sicherzustellen, dass sie, kreisförmigen, elliptischen bleiben oder rautenförmige zu beobachten. Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, speichern oder drucken Sie den Bericht (Datei | Speichern oder Datei | Print). EI-Max und SS ½ Werte automatisch gemeldet werden, zusammen mit Dehnung Indizes entspricht benutzerspezifische oder Standard Scheren betont. Daten werden auch automatisch durch die Software gespeichert werden.
- Drücken Sie am Ende die saubere Option im Dialogfeld auf dem Computermonitor (Clean). Nachdem die Probe abgesaugt ist, spülen Sie den Abstand zwischen den Pokal und Bob durch Spritzen deionisiertes Wasser in den Raum, während das Instrument in der Reinigungszyklus bleibt. Sobald der Reinigungszyklus abgeschlossen ist, heben Sie die Bob aus dem Becher und vollständig trocknen der Bob und den Pokal mit einem niedrigen Flusen Reinigung Gewebe (kritisch: Restwasser wird Erythrozyten, Herstellung von Störungen aufzulösen).
- Klicken Sie auf das Hauptmenü auf die Software, um auf die Hauptseite (Main Menu) zurück.
3. Messung der zellulären Heterogenität
- Mischen Sie vorsichtig Vollblut Probe vor der Prüfung durch Umdrehen der Flasche mehrmals. Pipettieren 25 µL Vollblut zu einem neuen 5 mL Fläschchen der Iso Osmolar PvP-Lösung, das Fläschchen Kappe und vorsichtig mischen, durch umdrehen, bis die Mischung homogen ist.
- Wählen Sie die Verformbarkeit aus dem Hauptmenü. Erstellen Sie eine neue Analyse und experimentelle Details hinzufügen (Verformbarkeit | Fügen Sie gewünschte Details | Okay).
- Deckel, Ektacytometer, stellen Sie sicher, dass die Bob vollständig in Tasse abgesenkt wird und die Tasse drehen.
- Pipettieren 1 mL der Lösung PVP Blut in den Raum zwischen den Pokal und Bob.
- Warten Sie, bis alle Luftblasen aus der Lösung bewegt haben, dann schließen Sie den Deckel auf die Ektacytometer.
- Stellen Sie sicher, dass eine stabile Beugung Bild auf dem Bildschirm vorhanden ist. Stellen Sie die Kameraverstärkung durch den Pfeil entlang der Bildlaufleiste auf die Software verschieben, bis es eine Höhe von 3,8 cm Beugung erzeugt. Verwenden Sie ein Lineal, um die Höhe des Bildes auf dem Bildschirm zu überprüfen.
- Wenn die Temperatur stabil bei 37 ° C und die Beugung Bild ist stabil, start (Start) drücken.
- Beobachten Sie Beugungsmuster als Daten Erwerb fortschreitet, um sicherzustellen, dass sie kreisförmigen, elliptischen oder rautenförmige bleiben. Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, speichern oder drucken Sie den Bericht (Datei | Speichern Sie oder -Datei | Print).
- Drücken Sie am Ende die saubere Option im Dialogfeld auf dem Computermonitor (Clean). Nach die Probe abgesaugt ist, spülen Sie den Abstand zwischen den Pokal und Bob durch Spritzen deionisiertes Wasser aus einer Spritzflasche hinein, während das Instrument in der Reinigungszyklus bleibt. Sobald der Reinigungszyklus abgeschlossen ist, heben Sie die Bob aus dem Becher und vollständig trocknen der Bob und den Pokal mit einem niedrigen Flusen Reinigung Gewebe (kritisch: Restwasser wird Erythrozyten, Herstellung von Störungen aufzulösen).
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5 und passen Sie die Kameraverstärkung um eine Beugung Muster Höhe 4,5 cm (Schritt 2.2) zu erhalten.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5 und passen Sie die Kameraverstärkung um eine Beugung Muster Höhe 5,4 cm (Schritt 2.2) zu erhalten.
- Am Ende klicken Sie auf die Schaltfläche "Hauptmenü" zurück zur Hauptseite der Software (Hauptmenü).
- Um den Grad der Beugung Muster Verzerrung basierend auf EI-Max als Prozentsatz festzulegen, verwenden Sie die folgende Gleichung (derselben Gleichung kann mit den Daten aus der Höhe 4,5 cm Beugung Muster durchgeführt werden, falls gewünscht):
- In ähnlicher Weise auf der Grundlage um festzustellen, den Grad der Beugung Muster Verzerrung SS1/2 Nutzung derselben Gleichung mit den gemeldeten Wert SS1/2:
4. osmotischer gradient ektacytometry
- Probe zu erhalten, wie unter 1.1 beschrieben. Mischen Sie vorsichtig Vollblut Probe vor der Prüfung durch invertieren mehrmals. 5 mL Iso Osmolar PvP-Fläschchen 250 µL Vollblut hinzufügen, indem pipettieren, Kappe das Fläschchen und vorsichtig mischen, durch umdrehen, bis die Mischung homogen ist.
- Wählen Sie Osmoscan aus dem Hauptmenü (Osmoscan). Legen Sie die Fläschchen mit dem Blut PvP-Lösung unter die Nadel auf der linken Seite der Maschine. Senken Sie die Nadel, bis es den Boden des Röhrchens berührt. Sicherstellen Sie, dass die Schläuche zu den niedrigen und hohen Osmolar Lösungen für gradient Produktion ordnungsgemäß angeschlossen ist. Schließen Sie den Deckel auf die Ektacytometer und öffnen Sie die Tür auf der unteren Hälfte, so dass Sie die Schläuche geben Sie Blut sehen können.
- Drücken Sie neue Analyse- und Typ in experimentellen Details (Osmoscan | Neue Analyse | Geben Sie die gewünschten Details | Okay). Einstellen des Kamera-Gewinn auf 200 durch verschieben den Pfeil auf der Software Steuern und lassen Sie die Maschine laufen, bis Blut zu sehen ist die Tasse aus der Schlauch unter dem Instrument in.
- Sobald das Blut hat den Pokal und eine stabile Beugung Muster Bild auf dem Computerbildschirm ist, beginnen Sie Datenerfassung durch Drücken der Start jetzt Schaltfläche im Dialogfeld (jetzt starten).
- Erlauben Sie die Ektacytometer Daten bis zu etwa 500 mOsm/kg zu erwerben, dann stoppen Sie das Instrument. Speichern oder drucken Bericht (Datei | Speichern oder Datei | Print). Daten werden auch automatisch gespeichert.
- Entfernen Sie die alten PVP-Blut-Phiole. Ersetzen Sie es mit einem sauberen Fläschchen mit entionisiertem Wasser. Legen sie unter die Nadel, bringen Sie die Nadel nach unten, so dass er den Boden des Röhrchens berührt und drücken Sie die Taste spülen im Dialogfeld, das gradient-System (spülen) zu spülen.
- Sobald die Spülung abgeschlossen ist, drücken Sie die saubere Option im Dialogfeld auf dem Computermonitor (Clean). Sobald der Reinigungszyklus abgeschlossen ist, heben Sie die Bob aus dem Becher und vollständig trocknen der Bob und den Pokal mit einem niedrigen Flusen Reinigung Gewebe (kritisch: Restwasser wird Erythrozyten, Herstellung von Störungen aufzulösen).
Hinweis: Der Osmoscan Bericht stellt Dehnung Indizes in den osmotischen Gradienten. EI Min, O (EI Min), EI-Max, O (EI-Max), EI hyper und O hyper werden automatisch generiert und in den Bericht aufgenommen. Die Palette der osmotische gradient Ektacytometry Parameter von 9 gesunden Probanden Blut entnommen ist: EI Min 0,12-0.196 willkürliche Einheiten (AE); O Min 117-144 mOsm/kg; EI-Max 0.551-0.573 a.u; O (EI-Max) 272-312 mOsm/kg; EI hyper 0.278-0.286; O Hyper 454-505 mOsm/kg.
(5) ausschalten die ektacytometer
- Reinigen Sie das Gerät ordnungsgemäß, bevor es geschlossen wird.
- Um dies zu tun, verbinden Sie die Schläuche von den niedrigen und hohen Osmolar Lösungen an den y-Adapter führt zu die Reinigungslösung. Legen Sie ein Fläschchen mit Reinigungslösung unter die Nadel auf der linken Seite der Maschine und senken Sie die Nadel, bis es den Boden des Röhrchens berührt. Sicherstellen Sie, dass die Bob in die Tasse vollständig abgesenkt wird.
- In der Nähe der Software, und drücken Sie am Ende des Tages sauber Dialogfeld auf dem Bildschirm des Computers starten (in der Nähe | Starten Sie). Lassen Sie das Gerät zur Reinigung komplett durchlaufen.
- Trennen Sie den Schlauch auf die Abfallflasche und entfernen Sie das Instrument, um Abfälle zu entsorgen. Lassen Sie die Bob vollständig trocknen. Schalten Sie die Maschine aus.
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Representative Results
Ektacytometry Ergebnisse in dieser Handschrift beschrieben lässt sich die Verformbarkeit der Erythrozyten in jedem Zustand zu messen. Eine schematische Darstellung der allgemeine Aufbau eines Ektacytometer ist in Abbildung 1dargestellt. Homogene Bevölkerung der Erythrozyten erzeugt einen elliptischen Beugungsmuster in Reaktion auf die steigende Schubspannung, die zur Berechnung der Dehnung Index wie in Abbildung 2dargestellt. Beugung Muster Verzerrung tritt in heterogenen Blutproben, weil starre Erythrozyten nicht richtig mit verformbaren Zellen ausrichten und eine sphärische Muster produzieren, dass Überlagerungen die Ellipse, wodurch ein Diamant Beugungsmuster geprägt. Dieses verzerrte Muster ist immer nachweisbar, da die Kameraverstärkung angepasst wird, um größere Beugung Muster Größen wie in Abbildung 3dargestellt zu generieren. Homogene Blut Populationen, wie Sie in gesunden Probanden, produzieren keine verschiedenen Verformbarkeit Kurven, wenn unterschiedliche Beugung Größen gemessen werden (Abb. 4A). Im Gegensatz dazu zeigen heterogenen Blut Bevölkerungen, wie Blut von Patienten mit Sichelzellanämie, signifikante Abnahme der Verformbarkeit Maßnahmen als Funktion der Beugung Mustergröße (Abbildung 4). Sichel im Blut wenn der Grad der Beugung Muster Verzerrung als Funktion der EI-Max gemessen wird, ist es mit HbS (Abb. 5A) und die Erwachsenen Hämoglobin-Variante, HbA2 (Abbildung 5) korreliert. Transfusion korrigiert die Verzerrung, wie durch die inverse Beziehung mit dem Prozentsatz der normalen Erwachsenen Hämoglobin (HbA) im Blut (Abbildung 5). Ob der Grad der Beugung Muster Verzerrung als Funktion der Schubspannung ½ (Abb. 5 b) oder als Funktion der EI-Max (Abb. 5E) gemessen wird, ist es mit fetalen Hämoglobins korreliert. Die Beziehung ist jedoch stärker in der ehemaligen als letztere. Wichtigsten osmotischen Gradienten Ektacytometry Parameter, wie O (EI-Max), EI Min und O Min liefern zusätzliche Informationen über die zelluläre Hydratation, Oberflächen-Volumen-Verhältnis und osmotische Fragilität, beziehungsweise. Osmotische Gradienten Kurven Sichel Blut entnommen sind charakteristisch links verschoben mit merklichen in Verformbarkeit, die zunehmend in der hypertonen Region ausgesprochen werden, wie in Abbildung 6dargestellt.
Abbildung 1 . Schematische Ektacytometer Set-up. Eine äußere Schale dreht sich um eine stationäre Bob erzeugt Schubspannung auf Blut Nukleinsäuretablette in einer PVP-Lösung von definierter Viskosität, die zwischen ihnen befindet. Ein Beugungsmuster entsteht durch einen Laser, der die Lösung durchläuft und die Beugungsmuster auf einer Projektionsfläche angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Allgemeine Übersicht über die Beziehung zwischen Diffraction Muster und Dehnung Index. Beugungsmuster gewonnenen gesundes Blut als Reaktion auf Stress Scheren zeigt das erwartete elliptische Muster. Dehnung Index (EI) wird berechnet unter Verwendung der Gleichung 7angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Zelluläre Heterogenität produziert Beugung Muster Verzerrungen. Beugungsmuster aus Blut von einem Sichelzell-Anämie-Patienten gewonnen, wenn die Kameraverstärkung eingestellt wird, produzieren A) ein Beugungsmuster 3,8 cm B) ein Beugungsmuster 4,5 cm und (C) ein Beugungsmuster 5,4 cm. Verformbarkeit Kurven zeigen eine progressive Abnahme der scheinbaren Verformbarkeit und eine entsprechende Erhöhung in scheinbare Schubspannung ½, gekennzeichnet durch die Linien aus dem gleichen Blut wenn Kameraverstärkung angepasst wird, um zu produzieren D) die Beugung von 3,8 cm Muster, E) die Beugungsmuster 4,5 cm und F) der 5,4 cm Beugungsmuster. [Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Parrow Et Al. 10]. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Beugung Muster Verzerrungen produzieren eine scheinbare Abnahme der Verformbarkeit in einem Spektrum von Schubspannungen im Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie. Vergleich der Verformbarkeit Kurven erzeugt aus A) Blut von gesunden Probanden und (B) Blut von Patienten mit Sichelzellanämie durch Anpassen der Kameraverstärkung, eine 3,8 cm, 4,5 cm und 5,4 cm Beugung Mustergröße zu generieren. Verformbarkeit Kurven erzeugt mit Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie, aber nicht von gesunden Probanden zeigen progressive und signifikanten Rückgang der scheinbaren Verformbarkeit in Reaktion auf so wenig wie 5 Pa Schubspannung als Funktion der Beugung Größe des Musters. [Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Renoux Et Al. 9]. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Der Grad der Beugung Muster Verzerrung ist korreliert mit Hämoglobin-Zusammensetzung im Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie. Lineare Regressionsanalysen zeigen den Zusammenhang zwischen (A) die EI-Max-basierte Verzerrung in Verformbarkeit und der Prozentsatz der HbS, (B) SS 1/2-basierte Verzerrung in Verformbarkeit und der Anteil der fetalen Hämoglobins (HbF), (C) die EI-Max-basierte Verzerrung in Verformbarkeit und der Prozentsatz der HbA2, D) die EI-Max-basierte Verzerrung in Verformbarkeit und der Prozentsatz der HbA und E) für die Zwecke der direkten Vergleich, die EI-Max-basierte Verzerrung im Verformbarkeit und der Prozentsatz der HbF im Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie. Pearson Produkt-Moment-Korrelationskoeffizient Rund entsprechenden p-Wert angegeben. [Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Parrow Et Al.10]. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Blut eines Patienten mit Sichelzellanämie zeigt eine charakteristische Linksverschiebung mit geringere Verformbarkeit im Vergleich zu Blut von gesunden Freiwilliger beim osmotischen Gradienten Ektacytometry analysiert. Blut aus einem gesunden Freiwilligen (-) zeigt eine repräsentative osmotischen Gradienten Ektacytometry Kurve mit der Lage der wichtigen Parameter angegeben. Osmotischen Gradienten Werte von gesunden Freiwilligen sind 0,143 a.u EI min, 146.3 mOsm/kg O min 0,576 a.u für EI-Max und 473 mOsm/kg für O hyper. Eine repräsentative osmotischen Gradienten Ektacytometry Kurve mit Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie generiert wird (-) überlagert. Osmotischen Gradienten Werte aus dem Blut der Sichel-Zelle sind 0,237 a.u EI min, 110,3 mOsm/kg O min 0,429 a.u für EI-Max und 406 mOsm/kg für O hyper. [Adaptiert mit Erlaubnis von Parrow Et Al. 10]. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Ektacytometry beschriebenen Techniken sind einfach und gut automatisiert, valide und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Dennoch gibt es einige wichtige Schritte. Richtige Temperaturkontrolle des Blutes ist wichtig. Lagerung bei Raumtemperatur für mehr als acht Stunden beeinträchtigen SS ½ Werte. 34 die Gewährleistung, dass die Temperatur der Maschine stabil bei 37 ° C ist auch wichtig, wie Viskosität des Mediums Aussetzung temperaturabhängig ist. Blut sollte voll Sauerstoff sein, um geringere Verformbarkeit aus nicht Sauerstoff oder teilweise sauerstoffreiches Proben zu vermeiden, es sei denn, diese experimentellen Parameter von Interesse sind. 35 aus Sicht der Instrumentierung ist ordnungsgemäße Reinigung des Gerätes wichtig um sicherzustellen, dass es kein PVP blieb in den Schlauch oder den Einstiegspunkt des Bobs wie es bei der Trocknung und Block Flüssigkeitsströmung durch das Instrument verhärten wird. Diese Details beachten, fördert die genaue Ergebnisse und lassen Sie das Gerät in gutem Betriebszustand.
Quantifizierung der zellulären Heterogenität kann Änderung verlangen. Die 3,8 cm Beugungsmuster können einige Proben einen steilen Rückgang in der Dehnung-Index, an der höchsten Schubspannungen angezeigt. Dies kann gelegentlich durch Wiederholung der Messung mit einer frischen Probe überwunden werden. Andernfalls der Grad der Beugung Muster Verzerrung gemessen werden, mit einer Dehnung-Index-Wert von einer geringeren Scherbeanspruchung oder das Beugungsmuster 4,5 cm eingesetzt werden. 9 es kann auch schwierig sein, ein 3,8 cm Beugungsmuster von gesundes Blut zu erhalten, weil die lange Achse der Ellipse zu lange auch bei der niedrigsten Kameraverstärkung ist. Wiederum können 4,5 cm Beugung Musterdaten verwendet werden, um dieses Problem zu umgehen. Der Wert, der gewählt wird sollte natürlich über das Experiment konstant gehalten werden, wie Vergleiche nur aus Daten mit dem gleichen Punkt und Beugung Muster Datengröße berechnet werden. Da die zellulären Heterogenität Maßnahmen abhängig vom Instrument eingerichtet sind, interne Validierung erhalten Sie durch die Messung der Beugung Muster Verzerrungen auf isolierten Zelle Brüche oder Mischungen von Brüchen, folgende Dichte genau definiert Zentrifugation wie oben beschrieben. 6
Es ist wichtig zu beachten, dass viele Ektacytometry Parameter Patientenmerkmalen empfindlich sind. Beispiele in Sichelzell-Anämie sind alpha-Globin-Status,36 MCV 37 und Transfusion. 10 daher klinische Studien müssen sorgfältig geplant werden und diese Beziehungen bei der Interpretation Ektacytometry Daten berücksichtigt werden.
Eine weitere wichtige Einschränkung ist, dass es keine direkte allgemeine Beziehung zwischen reduzierten Ektacytometry Maßnahmen und Verringerung der roten Zelle überleben. Asymptomatische Bedingungen mit stark verminderten Verformbarkeit, z. B. südostasiatischen Ovalocytosis vorhanden sein. 38 Verformbarkeit Messungen durch jede Technik sind jedoch komplex und abhängig von der Zelle Oberfläche zu Volumen-Verhältnis (Sphärizität), zytoplasmatischen Viskosität (zelluläre Hämoglobin-Konzentration) und Membran Steifigkeit. Erythrozyten Rheologie ist ebenso komplex, und es gibt keine Technik zur Verfügung, die die Komplexität der physiologischen Durchblutung in verschiedenen vaskulären Betten reproduzieren kann. Ektacytometry bietet dennoch wichtige Einblicke in veränderten Erythrozyten Verformbarkeit und Rheologie.
Die größte Einschränkung des Ektacytometry ist die Unfähigkeit, Verformbarkeit in einzelnen Zellen zu messen. So, in Sichelzell-Anämie gibt es keine Möglichkeit, den Beitrag des fetalen Hämoglobins, zu bestimmen, welche eine Heterocellular Verteilung auf die Verformbarkeit der besonderen Erythrozyten hat. 10 ebenso in einer Blutlache Plasmodien infiziert von einem Patienten gibt es keine Möglichkeit, den Einfluss der Parasit Reife innerhalb einer bestimmten roten Blutzelle. 19 Zukunftsstudien zum Vergleich Ektacytometery Ergebnisse mit denen, die mit Methoden geeignet für einzelne Zellen wertvoll wäre. Ungeachtet dieser Einschränkung bietet Ektacytometry eine bequeme und sensible Maßnahme der rheologischen Eigenschaften der Erythrozyten und der Heterogenität der Bevölkerung Blut. Diese Daten sind wichtig bei der Untersuchung von mehreren Erkrankungen und häufig von klinischer Relevanz sind.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den intramuralen Research Program des National Institute of Diabetes, Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen und der National Heart, Lung and Blood Institute der National Institutes of Health unterstützt. Die hier geäußerten Meinungen liegen in der alleinigen Verantwortung der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
References
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