Summary
כאן אנו מציגים טכניקות כדי למדוד ודפורמביליות תא אדום והטרוגניות התאית על ידי ektacytometry. טכניקות אלה חלים כללי חקירות תא אדום ודפורמביליות וחקירת ספציפי מחלות הדם מאופיין על ידי הנוכחות של כדוריות אדומות הנוקשה deformable במחזור, כגון האנמיה החרמשית.
Abstract
ודפורמביליות תא אדום ירד הוא מאפיין של מספר הפרעות. במקרים מסוימים, מידת ודפורמביליות פגום יכול לחזות חומרת המחלה או מופע של סיבוכים חמורים. שימושים Ektacytometry לייזר viscometry עקיפה כדי למדוד את ודפורמביליות של כדוריות דם אדומות או הגדלת גזירה או של הדרגה osmotic-ערך קבוע של גזירה יישומית. עם זאת, מדידות ודפורמביליות ישירה קשים לפרש כאשר מודדים את הדם heterogenous, אשר מאופיין על ידי הנוכחות של כדוריות אדומות הנוקשה deformable. זאת בשל חוסר היכולת של תאים נוקשה כדי ליישר כהלכה בתגובה גזירה ותוצאות תבנית עקיפה מעוותת בסימן ירידה מוגזמת ודפורמביליות נראית לעין. מדידה של מידת העיוות מספק חיווי הטרוגניות של אריתרוציטים בדם. ב האנמיה החרמשית, זה הוא מתואם עם האחוז של תאים נוקשה, אשר משקף את ריכוז המוגלובין והרכב המוגלובין אריתרוציטים. בנוסף מדידה ודפורמביליות, ektacytometry הדרגתיות osmotic מספק מידע אודות השבריריות osmotic ואת המצב הידרציה של אריתרוציטים. פרמטרים אלה משקפים גם את ההרכב המוגלובין של כדוריות דם אדומות מחולים חרמשית. Ektacytometry מודד ודפורמביליות בקרב אוכלוסיות של תאי דם אדומים, לא, לכן, לספק מידע על ודפורמביליות או תכונות מכניות של אריתרוציטים בודדים. בכל מקרה, המטרה אחת מהטכניקות שתוארו במסמך זה היא כדי לספק שיטה נוח ואמין למדידת ודפורמביליות והטרוגניות הסלולר של דם. טכניקות אלה עשוי להיות שימושי עבור ניטור שינויים הטמפורלי, כמו גם התקדמות המחלה והתגובה התערבות טיפולית בהפרעות מספר. האנמיה החרמשית הוא דוגמה אחת מאופיין היטב. הפרעות אפשריות אחרות איפה מדידות ודפורמביליות תא אדום ו/או הטרוגניות עניין כוללים אחסון הדם, סוכרת, הפלזמודיום זיהום, מחסור בברזל, את anemias המוליטית עקב פגמים ממברנה.
Introduction
Ektacytometry מספק מידה נוח של ודפורמביליות תא אדום בתגובה שינויים גזירה (נמדד בפסקל ומתגבר (פי אי)) או השעיית osmolality בינוני. הפרמטרים הרלוונטי של תא אדום ודפורמביליות כוללים מדד אלונגציה מרבית (EI מקסימום), מידת ודפורמביליות מקסימלית של תא אדום בתגובה הגדלת גזירה, גזירה ½ (הה ½), את מאמץ גזירה הדרוש להשגת מקסימלי חצי ודפורמביליות. 1 osmotic ektacytometry מעבר צבע יש מספר פרמטרים אינפורמטיבי. אלה כוללים האינדקס התארכות מינימלי (EI דקות), מידת השטח לבנפח יחס את osmolality שבו היא מתרחשת (O דקות), אשר היא מידת השבריריות osmotic. EI ומקס את osmolality שבו היא מתרחשת (O (מקסימום EI)) לספק מידע על קרום התא וגמישות פני השטח. התארכות מקסימלי חצי בזרוע hypertonic של המילוי ההדרגתי osmotic מיוצג על ידי EI hyper. EI hyper osmolality שבו היא מתרחשת, O היפר, מספקים מידע על צמיגות תאיים של התא האדום הנקבע על-ידי ריכוז המוגלובין. 2 , 3 מדידה ודפורמביליות בדם heterogenous, זה מורכב על ידי העובדה כי תאים נוקשה, כמו במגל כדוריות דם אדומות, לא ליישר כהלכה עם הכיוון של זרימה כגון תאים deformable בתגובה הגדלת גזירה. במקום לייצר תמונת דיפרקציה אליפטית אופיינית, לייצר תאים נוקשה דפוס כדורית, כשהתוצאה היא תבנית עקיפה בצורת יהלום כאשר המצופים באליפסה המיוצר על ידי תאי deformable. 4 , 5 , 6 . התבנית כדורית הוכח כדי שיתאימו בלתי הפיך במגל תאים על-ידי ביצוע ektacytometry בשברים מבודד של תאים בעקבות צפיפות צנטריפוגה. 6 בחישוב מדד התארכות כוללת מדדים של שני הציר קצרים וארוכים של האליפסה; מעויין מייצרת ולכן ירידה ניכרת של התארכות על ידי הגדלת הרוחב של הציר קצר. 7 בעבר הוכח כי מידת העיוות תבנית עקיפה הוא מתואם עם האחוז של המוגלובין מגל (HbS) והן את אחוז במגל בתאי דם מחולים עם האנמיה החרמשית. 5 מידת העיוות תבנית עקיפה ניתן להשיג על ידי ניתוחים מתמטיים מורכבים. 8 זה ניתן להשיג על-ידי התאמת פתיחת הצמצם במצלמה-ektacytometer או את רמת האפור של התוכנה התאמה לשנות את גובה תבנית עקיפה. 5 . אולם, פרטים לגבי כיצד להתאים את רמת האפור אינם מוגדרים היטב ואינו הצמצם במצלמה נגיש על הדור האחרון של ektacytometer זמינים מסחרית. כדי לעקוף בעיות אלה, לרווח המצלמה נגיש בקלות יכול לשמש כדי להתאים תבנית עקיפה לגבהים. 9 בשיטה זו כדי להעריך הטרוגניות הסלולר, מידת העיוות תבנית עקיפה ישויך עם האחוז של עוברית המוגלובין בדם של חולים עם אנמיה מגל התא. 10 מספר פרמטרים osmotic ektacytometry הדרגתיות הן באופן דומה בקורלציה עם האחוז של העובר או אנמיה המוגלובין בדם מחולים עם האנמיה החרמשית. תבנית עקיפה עיוות מתאמים סביר משקפים את התרומה של המוגלובין הרכב אל אחוז נוקשה, שאינם deformable תאים. עניין נוסף, הפרופיל כולה osmotic ektacytometry הדרגתיות עובר שינויים biphasic התואמים אחוז תאים צפופים במחזור במהלך משברים חרמשית. 11
Ektacytometry שימושית גם במחקר של מספר הפרעות אחרות. Osmotic ektacytometry הדרגתיות היא אבחון לטיפול בהפרעות קרום תא אדום בירושה, כמו ספרוציטוזיס תורשתי, elliptocytosis תורשתי pyropoikilocytosis תורשתי. 3 , 12 , 13 , 14 Decreased ודפורמביליות מתרחשת מחסור בברזל. 15 אפיון "הנגע אחסון" של דם העסיקה ektacytometry ומחקרים עתידיים חוקרים גם את טיב הנגע, התערבויות למניעת הקמתו במהלך האחסון של דם שהופקד וסביר להניח תועלת טכניקות המוצג כאן. 16 Decreased תא אדום ודפורמביליות יש גם היה בקורלציה עם מחלת microvascular בחולי סוכרת. 17 מחקרים שנעשו לאחרונה קישור היפרגליקמיה, ריכוזים ascorbate תא אדום ואת השבריריות osmotic מראים שגורמים אלה עשוי להיות חשוב בהתפתחות של מחלות microvascular. 18 Ektacytometry מחקרים נערכים כעת לחקור את השערה זו (Parrow ועל לוין, שלא פורסמו נתונים). דם הבמה מלריה זיהום הוא שדרת מעניין אחר של חקירות ודפורמביליות תא אדום. הסלולר ודפורמביליות של הפלזמודיום falciparum נגוע כדוריות דם אדומות יורדת באופן דרמטי במהלך 48 השעות של התבגרות תאיים של הטפיל משלב טבעת לשלב schizont. הראיות מראות כי זה ודפורמביליות ירד מתהפך על התבגרות של הטפיל. ההיפוך עולה בקנה אחד עם שחרורו של כדוריות אדומות נגוע למחזור. ירידה ודפורמביליות נחשב להיות מתווך על ידי חלבונים הפלזמודיום לקדם פחמיות של התא האדום. 19 מחקרים אלה מייצגים מדגם קטן של תנאים חשובים קלינית היכן ודפורמביליות כדוריות דם אדומות מדידה ופרמטרים הדרגתיות osmotic הרלוונטיים. קיימים מספר תחומי מחקר נוספים.
טכניקות חלופיות למדידת תא אדום ודפורמביליות כוללים מלקחיים אופטיים (ידוע גם בשם מלכודות לייזר) אשר השתמש המאפיינים הפיזיים של פוטונים כדי למתוח כדוריות אדומות בודד אחד או יותר. 20 טכניקה זו יש את היתרון של מדידה את ודפורמביליות של אריתרוציטים יחיד, אבל קצת אי-ודאות בכיול כוח הפיק השתנות ניכר על פני לימודי 21 וניתן לניתוח נתונים עתירי עבודה אלא אם כן אוטומטי. 22 micropipette, אשר משתמשת לחץ שלילי האחות של כדוריות דם אדומות לתוך micropipette, שאיפה גם שימש כדי למדוד את ודפורמביליות של כדוריות אדומות. 7 , 23 מדידות מרובות, כגון הלחץ הנדרש לרוקן את התא האדום, אפשריות עם כל מדד הגדרת מאפיינים שונים של התא האדום. 23 מיקרוסקופ כוח אטומי הוא טכניקה ברזולוציה גבוהה המודד ממברנה נוקשות על ידי לכימות סטיה קרן לייזר כמחוון הטיה זיז לאורך פני השטח של תא אדום. 24 טכניקות אלה מספקים מידע אודות אריתרוציטים בודדים, לא להתאים בקלות למדוד שינויים באוכלוסיות של כדוריות דם אדומות, ו, באופן כללי, דורשים מומחיות טכנית ניכר.
הרצון לטעום הפרט והן על אוכלוסיות של תאים בו זמנית הוביל ההתקדמות אוטומציה, התפתחות מיקרופלואידיקה ושיטות מבוסס על מערך. כמו ektacytometry, rheoscopy מודד ודפורמביליות כפונקציה של גזירה אבל תמונות נרכשים ישירות באמצעות מיקרוסקופ. 25 עבור ניתוחים דרך-הניח גבוה יותר, הדמיה תא אוטומטיות כבר מועסקים לייצר הפצות ודפורמביליות באמצעות rheoscope. 26 הטרוגניות הסלולר ניתן לכמת בשיטה זו אם הנתונים מנושא בקרה בריאים זמינים. 27 מיקרופלואידיקה טכניקות מאפשרים גם עבור ניתוחים דרך-הניח גבוהה של תאים בודדים; עיצובים מרובים באמצעות עיבודים של סינון,28 תא המעבר מאבחנים,29 אשר מודד את הזמן הנדרש עבור תזרים כדוריות דם אדומות דרך micropore חלופות למדוד את הלחץ הנדרש להובלה כדוריות דם אדומות למדי מאשר זמן 30 פותחו. פלטפורמה אחרת לניתוח דרך-הניח גבוהה של תאים בודדים הוא השבב מערך microchamber תא בודד, אשר יש יתרון נוסף של התרת במורד הזרם מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית אפיון של התאים. 31 למרות כל אחת מהטכניקות הללו שעשוי להיות שימושי, וייתכן שהוא מעולה עבור יישומים מסוימים, היתרונות השוואתית של ektacytometry כולל רגישות, קלות שימוש, דיוק. 32 הדור האחרון של ektacytometers זמינים מסחרית גם מחזיקים צדדיות ניכר במספר של מבחני שניתן לבצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנבדקים במחקר זה נתן הסכמה בכתב בהתאם את הצהרת הלסינקי והפרוטוקולים מוסדות של בריאות מוסדיים סקירה ההנהלה הארצית אישרה.
1. הפעלת את ektacytometer
- לחבר את הצנרור מהפתרון ניקוי הפתרונות פוליוינילפירולידון (PVP) osmolar נמוך וגבוה. להיות זהירים כדי לחבר את הצינור osmolar 0 לפתרון osmolar נמוך ולתחנת רכבת התחתית בקווינסוואי osmolar 500 הפתרון osmolar גבוהה.
הערה: הפתרון PVP osmolar נמוך צריך osmolality של בין 35 ו- 55 milliosmoles לקילוגרם (mOsm/kg), ה-pH של 7.25-7.45 25 ° c ו צמיגות בין 27.0 ו 33.0 centipoise (cP)-37.0 ± 0.5 מעלות צלזיוס. הפתרון PVP osmolar גבוהה צריך של osmolality בין mOsm/kg 764, 804, pH של 7.25-7.45 25 ° c, מדד צמיגות 27.0-33.0 cP-37.0 ° 0.5 מעלות צלזיוס. - ודא כי הבוב הוא הוריד לחלוטין לתוך הכוס. להפעיל את התוכנה ואת ראש המכונה (חומרה לבדוק | כלי נגינה IO). לאפשר את המכשיר להשלים את מחזור לקרקע. לאחר המחזור יושלם, הרם את הבוב מהספל, יבש לחלוטין את הבוב, בגביע עם מוך נמוך ניקוי רקמות.
הערה: שאריות מים lyse כדוריות אדומות, לייצר הפרעה.
2. מדידת ודפורמביליות כפונקציה של הגדלת מאמץ גזירה
- להשיג דם (פחות מ 1 מ"ל מספיקה לבצע את הטכניקות האלו עם משכפל) בבקבוקון המכיל נוגדת קרישה המתאים.
הערה: EDTA היא עדיפה על הפארין בגלל זה יש פחות השפעה על פרמטרים hemorheological. 33 דם לשמור בטמפרטורת החדר אם מדידות מבוצעות בתוך 6 שעות של דם לצייר. - מערבבים בעדינות דגימת דם לפני בדיקה על-ידי היפוך המבחנה מספר פעמים. להוסיף 25 µL של דם מלא 5 מ של iso-osmolar PVP פתרון על-ידי pipetting, וחוץ את המבחנה ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך מספר פעמים. הפתרון PVP iso-osmolar צריך להיות osmolality בין 284, 304 mOsm/kg, pH של 7.3-7.4 25 ° c צמיגות 27.0-33.0 cP-37.0 ± 0.5 מעלות צלזיוס.
- על התוכנה לבחור ודפורמביליות מהתפריט הראשי. יצירת ניתוח חדש והוספת פרטים ניסיוני (ודפורמביליות | להוסיף פרטים הרצוי | טוב).
- להרים את המכסה כדי ektacytometer, לוודא הבוב הוא הוריד באופן מלא לתוך כוס בגביע הוא מסתובב.
- להוסיף 1 מ"ל של דם PVP פתרון לחלל שבין גביע של בוב על-ידי pipetting.
- הרם את בוב מעט כדי להפיל את הדגימות. המתן עד כל הבועות עזבו הפתרון, ולאחר מכן סגור את המכסה כדי ektacytometer. במידת הצורך, לחץ על לחצן השאיפה כדי לסייע להסיר את הבועות.
- להתאים את הרווח ל-200 על-ידי הזזת החץ לאורך פס הגלילה על התוכנה (ראה הערה). כאשר הטמפרטורה יציב ב 37 מעלות צלזיוס תמונת דיפרקציה יציב, לחץ להתחיל (התחלה).
הערה: למחקרים רבים, ניתן להשיג תמונת דיפרקציה טוב עם רווח המצלמה מוגדר כ- 200 מהדם בריא (המוגלובין ריכוז > 12.0 g / dL, רשע corpuscular בנפח 80-96 פל ובתמצית אומר המוגלובין corpuscular של 33-36 g/dL). ללימודים של דם מאנמיה חרמשית, התאמת הרווח את המצלמה כדי ליצור תמונת דיפרקציה 4.5 ס מ הוצע כהגדרת ברירת המחדל כדי לאפשר השוואה של תוצאות מחקרים, מעבדות. 9 - להתבונן עקיפה תבניות נתונים מתקדמת רכישת כדי להבטיח שהם יישארו עגול, אליפטיים או בצורת יהלום. עם השלמת רכישת נתונים, לשמור או להדפיס את הדוח (קובץ | לשמור או קובץ | הדפסה). היי מקס ו- SS ½ ערכים ידווחו באופן אוטומטי, יחד עם התארכות מדדי המתאים על-ידי המשתמש או ברירת מחדל להטות לחצים. הנתונים יישמרו גם באופן אוטומטי על ידי התוכנה.
- בסוף, לחץ על האפשרות נקי בתיבת הדו-שיח על צג המחשב (נקי). לאחר המדגם הוא aspirated, לשטוף את החלל בין גביע בוב על ידי מתיז מים יונים לחלל בעוד המכשיר נשאר במחזור נקי. לאחר סיום מחזור נקי, הרם את הבוב מהספל, יבש לחלוטין את הבוב, בגביע עם מוך נמוך ניקוי רקמות (קריטי: שאריות מים lyse כדוריות אדומות, לייצר הפרעה).
- לחץ על לחצן התפריט הראשי על התוכנה כדי לחזור לדף הראשי (Main Menu).
3. מדידת הטרוגניות הסלולר
- מערבבים בעדינות דגימת דם לפני בדיקה על-ידי היפוך המבחנה מספר פעמים. Pipet 25 µL של דם מלא לקח 5 mL החדש של פתרון של PVP iso-osmolar, וחוץ את המבחנה ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך עד לתערובת הומוגנית.
- בחר ודפורמביליות מהתפריט הראשי. יצירת ניתוח חדש והוספת פרטים ניסיוני (ודפורמביליות | להוסיף פרטים הרצוי | טוב).
- להרים את המכסה כדי ektacytometer, לוודא הבוב הוא הוריד באופן מלא לתוך כוס בגביע הוא מסתובב.
- Pipet 1 מ"ל של הפתרון דם PVP לחלל בין גביע לבין בוב.
- המתן עד כל הבועות עזבו הפתרון, ולאחר מכן סגור את המכסה כדי ektacytometer.
- ודא תמונת דיפרקציה יציב להציג על המסך. להתאים את המצלמה רווח על ידי הזזת החץ לאורך הגלילה על התוכנה עד שהיא מייצרת לגובה עקיפה 3.8 ס מ. להשתמש בסרגל כדי לוודא את הגובה של התמונה על מסך המחשב.
- כאשר הטמפרטורה יציב ב 37 מעלות צלזיוס תמונת דיפרקציה יציב, לחץ להתחיל (התחלה).
- להתבונן תבניות עקיפה התקדמות רכישת נתונים כדי להבטיח שהם יישארו עגול, אליפטיים או בצורת יהלום. עם השלמת רכישת נתונים, לשמור או להדפיס את הדוח (קובץ | להציל את או קובץ | הדפסה).
- בסוף, לחץ על האפשרות נקי בתיבת הדו-שיח על צג המחשב (נקי). לאחר המדגם הוא aspirated, לשטוף את החלל בין גביע בוב על ידי מתיז מים יונים מבקבוק שפריץ לתוך זה בעוד המכשיר נשאר במחזור נקי. לאחר סיום מחזור נקי, הרם את הבוב מהספל, יבש לחלוטין את הבוב, בגביע עם מוך נמוך ניקוי רקמות (קריטי: שאריות מים lyse כדוריות אדומות, לייצר הפרעה).
- חזור על שלבים 2.1-2.5 ולהתאים את המצלמה רווח כדי לקבל גובה תבנית עקיפה של 4.5 ס מ (שלב 2.2).
- חזור על שלבים 2.1-2.5 ולהתאים את המצלמה רווח כדי לקבל גובה תבנית עקיפה של 5.4 ס מ (שלב 2.2).
- לבסוף, לחץ על לחצן התפריט הראשי כדי לחזור לדף הראשי של התוכנה (תפריט ראשי).
- כדי לקבוע את מידת העיוות תבנית עקיפה המבוססת על מקס EI כאחוז, השתמש במשוואה הבאה (מאותה משוואה ניתן לבצע עם הנתונים מגובה תבנית עקיפה 4.5 ס מ במקרה הצורך):
- באופן דומה, כדי לקבוע את מידת עקיפה דפוס עיוות המבוסס על שימוש SS1/2 מאותה משוואה עם הערך שדווח SS1/2:
4. osmotic ektacytometry מעבר צבע
- להשיג דגימה כמתואר ב- 1.1. מערבבים בעדינות דגימת דם לפני בדיקת על-ידי היפוך מספר פעמים. להוסיף 250 µL של דם מלא 5 מ ל iso-osmolar PVP המבחנה על-ידי pipetting, וחוץ את המבחנה ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך עד לתערובת הומוגנית.
- בחר osmoscan מתוך התפריט הראשי (Osmoscan). במקום בקבוקון המכיל את הדם פתרון של PVP מתחת המחט, בצד שמאל של המכונה. להנמיך את המחט עד שהוא נוגע בתחתית המבחנה. ודא אבובים מחובר כהלכה הפתרונות osmolar נמוך וגבוה לייצור צבע. סגור את המכסה כדי ektacytometer ופתח את הדלת על החצי התחתון כך אתה יכול לצפות את הדם להזין את הצנרור.
- הקש על ניתוח חדש וסוג בפרטים ניסיוני (Osmoscan | ניתוח חדש | הזן פרטים הרצוי | טוב). להתאים את המצלמה רווח ל-200 על-ידי הזזת החץ שולט בזה על התוכנה ולאפשר את המכונה לרוץ עד דם נתפסת הזנת בגביע של הצנרת מתחת לכלי.
- לאחר הדם נכנס בגביע והוא תמונת תבנית עקיפה יציב על מסך המחשב, להתחיל רכישת נתונים על ידי לחיצה על התחל עכשיו לחצן בתיבת הדו-שיח (להתחיל עכשיו).
- לאפשר את ektacytometer לרכוש נתונים עד כ-500 mOsm/kg, אז לעצור את המכשיר. לשמור או להדפיס את הדוח (קובץ | לשמור או קובץ | הדפסה). הנתונים גם לחסוך באופן אוטומטי.
- הסר את המבחנה PVP-דם ישן. החלף את זה בקבוקון נקי המכיל מים יונים. להניחה מתחת המחט, להפיל את המחט כך שייגע לתחתית המבחנה ולחץ על לחצן שטיפה בתיבת הדו-שיח לשטוף את המערכת מעבר צבע (שטיפה).
- לאחר שטיפה תושלם, לחץ על האפשרות נקי בתיבת הדו-שיח על צג המחשב (נקי). לאחר סיום מחזור נקי, הרם את הבוב מהספל, יבש לחלוטין את הבוב, בגביע עם מוך נמוך ניקוי רקמות (קריטי: שאריות מים lyse כדוריות אדומות, לייצר הפרעה).
הערה: ח osmoscan מספק מדדים התארכות לאורך מעבר הצבע osmotic. EI Min, O (EI דקות), מקס. היי, O (EI מקסימום), EI hyper ו O hyper נוצר אוטומטית הינם כלולים בדוח. מגוון פרמטרים osmotic ektacytometry מעבר הצבע המתקבל דם 9 מתנדבים בריאים הוא: EI Min 0.12 0.196 יחידות שרירותי (א"א); O מין 117-144 mOsm/ק ג; EI א"א מקס 0.551-0.573; O (מקסימום EI) 272-312 mOsm/ק ג; EI 0.278 היפר-0.286; Hyper 454-505 mOsm/kg.
5. מכבה את ektacytometer
- לנקות את המכשיר כראוי לפני שהיא נסגרת.
- כדי לעשות זאת, להתחבר הצנרת מן הפתרונות osmolar נמוך וגבוה המתאם-y מובילה לפתרון ניקוי. מקום בקבוקון המכיל בתמיסת ניקוי מתחת המחט, בצד שמאל של המכונה, להנמיך את המחט עד שהוא נוגע בתחתית המבחנה. ודא כי הבוב הוא הוריד לחלוטין לתוך הכוס.
- קרוב להתחיל התוכנה ולאחר מכן לחץ על הקצה של תיבת הדו-שיח נקייה היום על צג המחשב (קרוב | תתחיל). לאפשר את המכשיר לעבור ניקוי לחלוטין.
- נתק את הצנרת של הבקבוק פסולת ולהסירו מכל כלי להשליך פסולת. יבש לחלוטין את הבוב. . כבה את המכונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הממצאים ektacytometry המתוארים בכתב יד זה יכול לשמש כדי למדוד תא אדום ודפורמביליות בכל מצב. תיאור סכמטי של הגדרת כללי של ektacytometer מוצג באיור1. אוכלוסיות הומוגניות של אריתרוציטים תיצור תבנית עקיפה אליפטית בתגובה הגדלת גזירה יכול לשמש כדי לחשב מדד התארכות כמוצג באיור2. עיוות תבנית עקיפה מתרחשת דגימות דם heterogenous כיוון כדוריות אדומות נוקשה אינן ליישר כהלכה עם תאים deformable לייצר תבנית כדורית שכבות-על האליפסה וכתוצאה מכך יהלום בצורת תבנית עקיפה. תבנית מעוותת זו הוא יותר ויותר לזיהוי רווח המצלמה מותאם ליצירת בגודל תבנית עקיפה גדול יותר כפי שמוצג באיור3. אוכלוסיות הומוגניות דם, כפי שנמצאו מתנדבים בריאים, אינם מייצרים עקומות ודפורמביליות שונים כאשר עקיפה שונים גדלים נמדדים (איור 4A). לעומת זאת, דם heterogenous אוכלוסיות, כגון דם מחולים עם האנמיה החרמשית, להראות יתקצר משמעותית במדדי ודפורמביליות כפונקציה של גודל תבנית עקיפה (איור 4). בדם מגל, כאשר מידת העיוות תבנית עקיפה נמדד כפונקציה של מקס. היי, זה הוא מתואם עם HbS (איור 5A), הגרסה למבוגרים המוגלובין, מארח (hba)2 (איור 5C). עירוי מתקנת את העיוות, כמצוין על-ידי שלו הופכי בין עם האחוז של המוגלובין למבוגרים נורמלי (HbA) בדם (איור 5D). אם מידת העיוות תבנית עקיפה נמדד כפונקציה של גזירה ½ (איור 5B) או כפונקציה של EI מקס (איור 5E), זה הוא מתואם עם המוגלובין עוברית. אולם, מערכת היחסים היא חזקה יותר לשעבר מאשר לאחרון. מפתח osmotic ektacytometry הדרגתיות פרמטרים, כגון O (EI מקסימום), EI Min ו- O מין לספק מידע נוסף אודות הידרציה הסלולר, יחסי גודל השטח-כדי-נפח ואת השבריריות osmotic, בהתאמה. Osmotic עקומות מעבר הצבע המתקבל מגל דם הם האביזרים שמאלה-העביר עם ירידות ודפורמביליות מסומן כך הופכים יותר ויותר משמעותי באזור hypertonic כפי שמוצג באיור 6.
איור 1 . סכמטי של הגדרת ektacytometer. גביע החיצוני סיבוב מסביב בוב נייח יוצר גזירה על דם resuspended בפתרון PVP של צמיגות מוגדרת הממוקמים ביניהן. תבנית עקיפה נוצרת על ידי לייזר העובר דרך הפתרון ומוצגת התבנית עקיפה על מסך ההקרנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . סקירה כללית של מערכת היחסים בין תבנית עקיפה ואינדקס התארכות. תבנית עקיפה המתקבל בדם בריא בתגובה להטיה מתח מראה אליפטית הדפוס הצפוי. התארכות אינדקס (EI) מחושבת באמצעות המשוואה המצוין 7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . הטרוגניות הסלולר יוצרת עיוותים תבנית עקיפה. תבניות עקיפה המתקבל דם מחולה האנמיה החרמשית כאשר רווח המצלמה מותאמת כדי לייצר א) תבנית עקיפה 3.8 ס מ, B) תבנית עקיפה 4.5 ס מ ו ג) תבנית עקיפה 5.4 ס מ. עקומות ודפורמביליות מראה ירידה פרוגרסיבית ודפורמביליות לכאורה, וגידול מקביל ניכר מאמץ גזירה ½, שמציינים קווי, מהדם אותו כאשר רווח המצלמה מותאמת כדי לייצר D) עקיפה 3.8 ס מ דפוס, E) תבנית עקיפה של 4.5 ס מ, F) תבנית עקיפה של 5.4 ס מ. [מתפרסם על ידי רשות מן Parrow et al. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . עיוותים תבנית עקיפה לייצר ירידה לעין של ודפורמביליות על פני מגוון של הטיה מדגיש בדם של חולים עם אנמיה מגל התא. השוואה של עקומות ודפורמביליות המופקים א) דם מתנדבים בריאים, B) דם מחולים עם האנמיה החרמשית על-ידי התאמת הרווח את המצלמה כדי ליצור גודל תבנית עקיפה של 3.8 ס מ, 4.5 ס מ ו- 5.4 ס מ. ודפורמביליות עקומות שנוצרו עם דם מחולים עם האנמיה החרמשית אך לא מתנדבים בריאים, להראות יתקצר משמעותית ומתקדמת ב ודפורמביליות לכאורה בתגובה 5 קטנה כמו גזירה הרשות הפלסטינית כפונקציה של עקיפה גודל התבנית. [מתפרסם על ידי רשות מן Renoux et al. 9]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . מידת העיוות תבנית עקיפה הוא מתואם עם הרכב המוגלובין בדם של חולים עם אנמיה מגל התא. ניתוחי רגרסיה ליניארית להציג את קשר הגומלין בין א) העיוות מבוסס-EI מקס ודפורמביליות, האחוז של HbS, B) העיוות מבוסס על 1/2 האס. אס ודפורמביליות, את אחוז ההמוגלובין עוברית (HbF), C) עיוות מבוסס-EI מקס ודפורמביליות, האחוז של מארח (hba)2, D) העיוות מבוסס-EI מקס ודפורמביליות, האחוז של מארח (hba) ו E) לצורך השוואה ישירה, העיוות מבוסס-EI מקס ב ודפורמביליות, את אחוז HbF דם מחולים עם האנמיה החרמשית. מקדם המתאם של מומנט המכפלות פירסון, r, והמקביל p-ערך מסומנים. [התפרסם בכתב מאת רשות מן Parrow et al.10]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . דם של חולה עם האנמיה החרמשית מראה משמרת השמאלי האופיינית בו-זמני עם ודפורמביליות ירד לעומת דם של מתנדבים בריאים כאשר נותחו על ידי osmotic ektacytometry מעבר. דם של מתנדבים בריאים (-) מציג עקומה נציג osmotic ektacytometry מעבר צבע עם המיקום של פרמטרים חשובים המצוין. ערכים הדרגתיות osmotic הם מתנדבים בריאים א"א 0.143 ' מזערי ' EI, 146.3 mOsm/kg במשך דקות O, א"א 0.576 בשביל מקס EI, 473 mOsm/kg במשך O hyper. עיקול נציג osmotic ektacytometry מעבר צבע שנוצר עם דם של חולה עם האנמיה החרמשית הוא בשכבות (-). ערכים הדרגתיות osmotic מהדם חרמשית הם א"א 0.237 EI דקות, 110.3 mOsm/kg במשך דקות O, א"א 0.429 בשביל מקס EI, 406 mOsm/kg במשך O hyper. [הותאם באישור Parrow et al. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקות ektacytometry המתוארים הם פשוטים ואוטומטיים טוב, המבטיח תוצאות חוקיים וגם לשחזור. למרות זאת, קיימים כמה צעדים קריטיים. בקרת טמפרטורה נאותה של הדם חשוב. אחסון בטמפרטורת החדר במשך יותר מ 8 שעות עשוי להשפיע על SS ½ ערכים. 34 Ensuring כי הטמפרטורה של המכונה הוא יציב ב 37 ° C חשוב גם, כמו צמיגות של המדיום suspending הוא תלוי בטמפרטורה. דם צריך להיות חמצן באופן מלא כדי למנוע ירידה ודפורמביליות הנובעות דגימות ללא חמצן או מחומצן חלקית, אלא אם כן אלו הם הפרמטרים ניסיוני של ריבית. 35 נקודת המבט של מכשור, ניקוי נאות של המכשיר היא קריטית כדי להבטיח שזה לא PVP שנותרו הצנרת או את נקודת הכניסה של הבוב כפי זה תחזק על זרימת נוזלים ייבוש של רחוב דרך הכלי. תשומת לב לפרטים אלה לקדם את תוצאות מדויקות ולשמור את המכשיר במצב פועל טוב.
כימות של הטרוגניות הסלולר עשויים לדרוש שינוי. בתבנית עקיפה 3.8 ס מ, דגימות עשוי להראות ירידה התלול במדד התארכות על הלחצים הטיה הגבוהה ביותר. זה ניתן לעתים להתגבר על ידי חזרה על המדידה עם מדגם טריים. אחרת, מידת העיוות תבנית עקיפה ניתן למדוד באמצעות ערך אינדקס התארכות של גזירה נמוכה יותר או תבנית עקיפה של 4.5 ס מ יכול לשמש. 9 . זה יכול להיות גם קשה להשיג תבנית עקיפה 3.8 ס מ מ בדם בריא בגלל לציר הארוך של האליפסה הוא גם זמן אפילו ב רווח הנמוך המצלמה. שוב, הנתונים תבנית עקיפה של 4.5 ס מ יכול לשמש כדי לעקוף בעיה זו. הערך הנבחר יש, כמובן, לשמור קבועים לאורך הניסוי כפי השוואות אפשריות רק נתונים מחושבים באמצעות נתוני הצבע ואת עקיפה תבנית בגודל זהה. כל האמצעים הטרוגניות הסלולר תלויים כלי להגדיר, אימות פנימית יכולה להיות מושגת על ידי מדידת עקיפה עיוותים דפוס בשברים תא מבודד, או דווקא מוגדרת תערובות של שברים, צפיפות הבאים צנטריפוגה כאמור תיאר. 6
חשוב לציין כי פרמטרים ektacytometry רבים רגישים מאפייני המטופל. דוגמאות האנמיה החרמשית כוללים מצב אלפא גלובין, MCV36 37 , עירוי. 10 . לפיכך, מחקרים קליניים צריך להיות מתוכנן בקפידה ו מערכות היחסים הללו צריכים להיות נוכחים בעת פירוש הנתונים ektacytometry.
הקונה חשוב נוסף הוא שאין קשר כללי ישיר בין אמצעים ektacytometry מופחתת וצמצום בהישרדות תא אדום. קיימים תנאים טובים אסימפטומטיים עם ודפורמביליות ירד קשות, כגון דרום־מזרח אסיה ovalocytosis. 38 . אולם, ודפורמביליות מדידות על ידי שום טכניקה הם מורכב ותלוי תא שטח הפנים יחס נפח (sphericity), cytoplasmic צמיגות (ריכוז המוגלובין הסלולר), קשיחות ממברנה. תא אדום rheology מורכבת באופן דומה, ויש לא זמין בטכניקה יכול לשכפל את המורכבות של זרימת הדם הפיזיולוגיות במיטות כלי דם שונים. Ektacytometry אף על פי כן מספק תובנות חשובות ודפורמביליות תא אדום מסולף, rheology.
המגבלה העיקרית של ektacytometry היא חוסר היכולת למדוד ודפורמביליות בתאים בודדים. לפיכך, האנמיה החרמשית, יש שום דרך לקבוע את התרומה של המוגלובין עוברית, אשר יש התפלגות heterocellular, ודפורמביליות של כדוריות דם אדומות מסוים. 10 . כמו כן, בבריכה של דם הפלזמודיום נגוע מחולה יש שום דרך לקבוע את ההשפעה של בגרות טפיל בתוך תא דם אדום ספציפית. 19 העתיד מחקרים שהשוו תוצאות ektacytometery עם אלה תוך שימוש בשיטות מתאים עבור תאים בודדים יהיה יקר. ללא קשר מגבלה זו, ektacytometry מספק מדד רגיש ונוח של מאפייני rheological של אריתרוציטים והטרוגניות של אוכלוסיות דם. נתונים אלה חשובים במחקר של מספר הפרעות והם לעיתים קרובות של הרלוונטיות הקלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מחקר מגזר מוסדות לאומיים של הסוכרת, העיכול, מחלות כליה הלאומי ללב, ריאות ואת מכון דם של מכוני הבריאות הלאומיים. הדעות שהובעו בזאת ואינן מייצגות בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים, הינם באחריות הבלעדית של המחברים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
References
- Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance. Blood. 61 (5), 899-910 (1983).
- Da Costa, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders: Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells Mol Dis. 56 (1), 9-22 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. J Clin Invest. 65 (1), 189-196 (1980).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Bessis, M., Mohandas, N. Laser Diffraction Patterns of Sickle Cells in Fluid Shear Fields. Blood Cells. 3, 229-239 (1977).
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Blood Cell - An Overview of Studies in Hematology. Moschandreou, T. E. , InTech. (2012).
- Streekstra, G. J., Dobbe, J. G., Hoekstra, A. G. Quantification of the fraction poorly deformable red blood cells using ektacytometry. Opt Express. 18 (13), 14173-14182 (2010).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization for the ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2 in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells Mol Dis. 65, 41-50 (2017).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Johnson, R. M., Ravindranath, Y. Osmotic scan ektacytometry in clinical diagnosis. J Pediatr Hematol Oncol. 18 (2), 122-129 (1996).
- Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S., Shohet, S. B. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest. 66 (3), 563-573 (1980).
- Lazarova, E., Gulbis, B., Oirschot, B. V., van Wijk, R. Next-generation osmotic gradient ektacytometry for the diagnosis of hereditary spherocytosis: interlaboratory method validation and experience. Clin Chem Lab Med. 55 (3), 394-402 (2017).
- Anderson, C., Aronson, I., Jacobs, P. Erythrocyte Deformability is Reduced and Fragility increased by Iron Deficiency. Hematology. 4 (5), 457-460 (1999).
- Reinhart, W. H., et al. Washing stored red blood cells in an albumin solution improves their morphologic and hemorheologic properties. Transfusion. 55 (8), 1872-1881 (2015).
- Shin, S., et al. Progressive impairment of erythrocyte deformability as indicator of microangiopathy in type 2 diabetes mellitus. Clin Hemorheol Microcirc. 36 (3), 253-261 (2007).
- Tu, H., et al. Low Red Blood Cell Vitamin C Concentrations Induce Red Blood Cell Fragility: A Link to Diabetes Via Glucose, Glucose Transporters, and Dehydroascorbic Acid. EBioMedicine. 2 (11), 1735-1750 (2015).
- Tiburcio, M., et al. A switch in infected erythrocyte deformability at the maturation and blood circulation of Plasmodium falciparum transmission stages. Blood. 119 (24), e172-e180 (2012).
- Henon, S., Lenormand, G., Richert, A., Gallet, F. A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers. Biophys J. 76 (2), 1145-1151 (1999).
- Mills, J. P., Qie, L., Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers. Mech Chem Biosyst. 1 (3), 169-180 (2004).
- Moura, D. S., et al. Automatic real time evaluation of red blood cell elasticity by optical tweezers. Rev Sci Instrum. 86 (5), 053702 (2015).
- Evans, E. A. New membrane concept applied to the analysis of fluid shear- and micropipette-deformed red blood cells. Biophys J. 13 (9), 941-954 (1973).
- Chen, X., Feng, L., Jin, H., Feng, S., Yu, Y. Quantification of the erythrocyte deformability using atomic force microscopy: correlation study of the erythrocyte deformability with atomic force microscopy and hemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (3), 243-251 (2009).
- Musielak, M. Red blood cell-deformability measurement: review of techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (1), 47-64 (2009).
- Dobbe, J. G., Streekstra, G. J., Hardeman, M. R., Ince, C., Grimbergen, C. A. Measurement of the distribution of red blood cell deformability using an automated rheoscope. Cytometry. 50 (6), 313-325 (2002).
- Dobbe, J. G., et al. Analyzing red blood cell-deformability distributions. Blood Cells Mol Dis. 28 (3), 373-384 (2002).
- Kikuchi, Y., Arai, T., Koyama, T. Improved filtration method for red cell deformability measurement. Med Biol Eng Comput. 21 (3), 270-276 (1983).
- Moessmer, G., Meiselman, H. J. A new micropore filtration approach to the analysis of white cell rheology. Biorheology. 27 (6), 829-848 (1990).
- Guo, Q., et al. Microfluidic analysis of red blood cell deformability. J Biomech. 47 (8), 1767-1776 (2014).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Appl Phys Lett. 100 (17), 173702-173703 (2012).
- Baskurt, O. K., et al. Comparison of three commercially available ektacytometers with different shearing geometries. Biorheology. 46 (3), 251-264 (2009).
- Baskurt, O. K., et al. New guidelines for hemorheological laboratory techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (2), 75-97 (2009).
- Uyuklu, M., et al. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (4), 269-278 (2009).
- Uyuklu, M., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effect of hemoglobin oxygenation level on red blood cell deformability and aggregation parameters. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (3), 179-188 (2009).
- Embury, S. H., Clark, M. R., Monroy, G., Mohandas, N. Concurrent sickle cell anemia and alpha-thalassemia. Effect on pathological properties of sickle erythrocytes. J Clin Invest. 73 (1), 116-123 (1984).
- von Tempelhoff, G. F., et al. Correlation between blood rheological properties and red blood cell indices(MCH, MCV, MCHC) in healthy women. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (1), 45-54 (2016).
- Da Costa, L., Galimand, J., Fenneteau, O., Mohandas, N. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Rev. 27 (4), 167-178 (2013).
