Summary
Hier presenteren we technieken voor het meten van de vervormbaarheid van de rode cel en cellulaire heterogeniteit door ektacytometry. Deze technieken zijn van toepassing op de algemene onderzoeken van rode cel vervormbaarheid en specifieke onderzoeken van bloed ziekten gekenmerkt door de aanwezigheid van zowel stijve als vervormbare erytrocyten in omloop, zoals sikkelcelanemie.
Abstract
Verminderde rode cel vervormbaarheid is kenmerkend voor verschillende stoornissen. In sommige gevallen kan de omvang van de defecte vervormbaarheid voorspellen ernst van ziekte of voorkomen van ernstige complicaties. Ektacytometry gebruik laser diffractie viscometrie voor het meten van de vervormbaarheid van de rode bloedcellen aan toenemende shear stress of een osmotische gradiënt op een constante waarde van toegepaste schuifspanning. Directe vervormbaarheid metingen zijn echter moeilijk te interpreteren bij het meten van heterogene bloed die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van zowel stijve als vervormbare rode bloedcellen. Dit is te wijten aan het onvermogen van stijve cellen naar behoren worden uitgelijnd in reactie op schuifspanning en resultaten in een patroon van de vervormde diffractie gekenmerkt door een overdreven afname van de schijnbare vervormbaarheid. Meting van de mate van vervorming biedt een indicatie voor de heterogeniteit van de erythrocyten in bloed. In sikkelcelanemie, is dit gecorreleerd met het percentage van stijve cellen, waarin de concentratie van hemoglobine en hemoglobine samenstelling van de erythrocyten. Naast het meten van vervormbaarheid, biedt osmotische gradiënt ektacytometry informatie over de osmotische fragiliteit en hydratatie status van erytrocyten. Deze parameters geven ook de samenstelling van de hemoglobine van de rode bloedcellen van sikkelcel patiënten. Ektacytometry meet vervormbaarheid bij populaties van rode bloedcellen en, daarom geeft informatie niet op de vervormbaarheid of mechanische eigenschappen van individuele erytrocyten. Hoe dan ook, is het doel van de technieken die hier beschreven bedoeld als een handige en betrouwbare methode voor het meten van de vervormbaarheid en cellulaire heterogeniteit van bloed. Deze technieken kunnen nuttig zijn voor toezicht op de temporele veranderingen, evenals de progressie van de ziekte en de reactie op therapeutische interventie in verschillende stoornissen. Sikkelcel anemie is een goed gekarakteriseerd voorbeeld. Andere mogelijke aandoeningen waar metingen van de vervormbaarheid van de rode cel en/of heterogeniteit van belang zijn zijn bloed opslag, diabetes, Plasmodium infectie, ijzertekort en het hemolytisch-anemias als gevolg van gebreken van het membraan.
Introduction
Ektacytometry biedt een handige maatstaf voor de vervormbaarheid van de rode cel in reactie op wijzigingen in de schuifspanning (gemeten in Pascal (Pa)) of op te schorten middellange osmolaliteit. Relevante parameters van de vervormbaarheid van de rode cel omvatten de maximale rek-index (EI Max), een maat voor de maximale vervormbaarheid van een rode cel in reactie op de toenemende schuifspanning en schuifspanning ½ (SS ½), de schuifspanning vereist om de helft van de maximale vervormbaarheid. 1 osmotische gradiënt ektacytometry heeft verschillende informatieve parameters. Deze omvatten de rek index minimale (EI Min), een maat voor oppervlakte-naar-volumeverhouding en de osmolaliteit waartegen het zich voordoet (O Min), die is een maatregel van osmotische fragiliteit. EI Max en de osmolaliteit waartegen het zich voordoet (O (EI Max)) bevatten informatie over membraan flexibiliteit en cel-oppervlakte. Helft van de maximale rek in de hypertonic arm van de osmotische gradiënt wordt vertegenwoordigd door EI hyper. EI hyper en de osmolaliteit waartegen deze optreedt, O hyper, geven informatie over de intracellulaire viscositeit van de rode cel die wordt bepaald door de concentratie van hemoglobine. 2 , 3 Measuring vervormbaarheid in heterogene bloed wordt bemoeilijkt door het feit dat stijve cellen, zoals sickled rode bloedcellen, doen niet goed is uitgelijnd met de richting van de stroom zoals vervormbare cellen in reactie op de verhoging van de schuifspanning. In plaats van een karakteristiek elliptische diffractie beeld produceren, produceren stijve cellen een sferische patroon dat in een diamant-vormige diffractie patroon resulteert als ze elkaar overlappen op de ellips geproduceerd door vervormbare cellen. 4 , 5 , 6 de sferische patroon is aangetoond dat correspondeert met onherroepelijk sickled cellen door het uitvoeren van ektacytometry op geïsoleerde breuken van cellen na centrifugeren van de dichtheid. 6 de berekening van de index van de rek opgenomen maatregelen voor zowel de lange en korte as van de ellips; vorm van een diamant produceert daarom een duidelijke afname van de rek doordat de breedte van de korte as. 7 het is eerder aangetoond dat de mate van diffractie patroon vervorming is gecorreleerd met zowel de percentage van sikkelcel-hemoglobine (HbS) en het percentage van sickled cellen in het bloed van patiënten met sikkelcel anemie. 5 de mate van diffractie patroon vervorming kan worden verkregen door complexe wiskundige analyses. 8 het kan ook worden verkregen door de opening van het diafragma van de camera op de ektacytometer of het grijs niveau van de software van de montage te wijzigen van de diffractie patroon hoogte aan te passen. 5 echter details met betrekking tot het aanpassen van de grijze niveau zijn niet goed gedefinieerd en het diafragma van de camera is niet toegankelijk op de nieuwste generatie van de verkrijgbare ektacytometer. Om te omzeilen deze problemen, kan de gemakkelijk toegankelijke camera winst worden gebruikt om aan te passen diffractie patroon hoogten. 9 gebruik deze methode voor de raming van de cellulaire heterogeniteit, kan de mate van diffractie patroon vervorming worden gecorreleerd met het percentage van fetal hemoglobine in het bloed van patiënten met sikkelcel anemie. 10 verschillende osmotische gradiënt ektacytometry parameters zijn eveneens gecorreleerd met het percentage van foetale of sikkelcelanemie hemoglobine in het bloed van patiënten met sikkelcel anemie. Diffractie patroon vervorming correlaties waarschijnlijk weerspiegelen de bijdrage van hemoglobine samenstelling aan het percentage van stijve, niet-vervormbare cellen. Van extra belang ondergaat het hele osmotische gradiënt ektacytometry profiel tweefase veranderingen die correspondeert met het percentage dichte cellen in omloop tijdens de crisis van de sikkelcel. 11
Ektacytometry is eveneens nuttig in de studie van verschillende andere stoornissen. Osmotische gradiënt ektacytometry is diagnostische voor de overgenomen rode cel membraan stoornissen, zoals erfelijke spherocytosis, erfelijke elliptocytosis en erfelijke pyropoikilocytosis. 3 , 12 , 13 , 14 verminderde vervormbaarheid treedt op in ijzertekort. 15 karakterisering van de "opslag laesie" van bloed heeft ektacytometry en toekomstige studies onderzoeken van zowel de aard van de laesie en interventies ter voorkoming van haar ontstaan tijdens de opslag van overhellende bloed zijn waarschijnlijk om te profiteren van de technieken die hier gepresenteerd. 16 verminderde rode cel vervormbaarheid heeft ook zijn gecorreleerd met microvasculaire ziekte in diabetes. 17 recente studies koppelen hyperglycemie, rode cel ascorbaat concentraties en osmotische fragiliteit suggereren dat deze factoren belangrijk zijn in de ontwikkeling van microvasculaire ziekte kunnen zijn. 18 Ektacytometry onderzoeken zijn momenteel aan de gang te onderzoeken van deze hypothese (Parrow en Levine, ongepubliceerde gegevens). Malaria infectie van het fase van Blood is een andere interessante laan van rode cel vervormbaarheid onderzoeken. Cellulaire vervormbaarheid van Plasmodium falciparum geïnfecteerd rode bloedcellen daalt dramatisch tijdens de 48 uren van intracellulaire rijping van de parasiet van ring fase naar fase van schizont. Blijkt dat deze verminderde vervormbaarheid wordt omgekeerd op de rijping van de parasiet. De omkering samenvalt met de release van de geïnfecteerde rode bloedcellen in de circulatie. Verminderde vervormbaarheid wordt gedacht te worden bemiddeld door Plasmodium eiwitten ter bevordering van de sekwestratie van de rode cel. 19 deze studies zijn een kleine steekproef van klinisch belangrijke voorwaarden waar meten erytrocyt vervormbaarheid en osmotische gradiënt parameters relevant zijn. Er bestaan verschillende extra gebieden van studie.
Alternatieve technieken voor het meten van de vervormbaarheid van de rode cel omvatten optisch pincet (ook bekend als laser vallen) die de fysische eigenschappen van fotonen te rekken één rode bloedcellen in een of meerdere richtingen te gebruiken. 20 deze techniek heeft het voordeel voor het meten van de vervormbaarheid van één erytrocyten, maar enige onzekerheid kalibratie van de kracht heeft aanzienlijke variabiliteit over studies 21 en data-analyse kan arbeidsintensief tenzij geautomatiseerd. 22 micropipet aspiratie, die gecombineerd een erytrocyt in een micropipet met behulp van negatieve druk, is ook gebruikt voor het meten van de vervormbaarheid van de rode bloedcellen. 7 , 23 meerdere metingen, zoals de druk moeten de rode cel, gecombineerd zijn mogelijk met elke maatregel bepaling van verschillende kenmerken van de rode cel. 23 atomic force microscopie is een hoge resolutie-techniek, die membraan stijfheid maatregelen door het kwantificeren van de laser beam doorbuiging als een indicator van de uitwijking van de ' Freischwinger ' langs het oppervlak van een rode cel. 24 deze technieken bieden informatie over individuele erytrocyten, niet gemakkelijk om te meten van de veranderingen in populaties van rode bloedcellen, en, in het algemeen, vereisen aanzienlijke technische expertise zijn aangepast.
De wens om te genieten van zowel de individuele als de populaties van cellen tegelijk heeft geleid tot vooruitgang in de automatisering en de ontwikkeling van microfluidics en matrix gebaseerde methoden. Zoals ektacytometry, rheoscopy meet vervormbaarheid als een functie van shear stress maar beelden direct via Microscoop zijn verworven. 25 voor hogere via-put analyses, geautomatiseerde cel imaging heeft gewerkt voor de productie van de vervormbaarheid distributies met behulp van de rheoscope. 26 cellulaire heterogeniteit kan worden gekwantificeerd door deze methode als gegevens van een gezonde controle onderwerp beschikbaar zijn. 27 Microfluidics technieken ook toestaan voor hoge via-put-analyses van afzonderlijke cellen; meerdere ontwerpen met behulp van aanpassingen van filtratie,28 cel transit analyzers,29 , die de tijd die nodig is voor een erytrocyt stroom door een schoon meet en alternatieven die meten van de druk die nodig zijn voor de erytrocyt transit eerder dan tijd 30 zijn ontwikkeld. Een ander platform voor hoge via-put analyse van afzonderlijke cellen is de eencellige microchamber matrix chip, die het extra voordeel heeft van het toestaan voor downstream fluorescentie gebaseerde karakterisering van de cellen. 31 Hoewel elk van deze technieken is potentieel nuttig en kan zijn superieur voor bepaalde toepassingen, inclusief de comparatieve voordelen van ektacytometry gevoeligheid, gebruiksgemak, en precisie. 32 de nieuwste generatie van commercieel verkrijgbare ektacytometers bezitten ook aanzienlijke veelzijdigheid in het aantal tests die kunnen worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle onderwerpen in deze studie gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming overeenkomstig de verklaring van Helsinki en de nationale instituten van gezondheid institutionele Review Board goedgekeurd-protocollen.
1. inschakelen de ektacytometer
- Sluit de slang van de reiniging oplossing aan de lage en hoge osmolar Polyvinylpyrrolidon (PVP) oplossingen. Wees voorzichtig om verbinding te maken met de 0 osmolar buis aan de lage osmolar-oplossing en de 500 osmolar buis aan de hoge osmolar-oplossing.
Opmerking: De lage osmolar PVP oplossing moet een osmolaliteit tussen 35 en 55 milliosmoles per kilogram (mOsm/kg), een pH van 7.25-7,45 bij 25 ° C en een viscositeit tussen 27.0 en 33.0 centipoise (cP) bij 37.0 ± 0,5 ° C. De hoge osmolar PVP oplossing moet een osmolaliteit tussen 764 en 804 mOsm/kg, een pH van 7.25-7,45 bij 25 ° C en een maatregel van de viscositeit van 27,0-33,0 cP 37.0 ° 0,5 ° C. - Zorg ervoor dat de bob volledig wordt verlaagd in de beker. Start de software en prime van de machine (Hardware controleren | Instrument IO). Het toestaan van het instrument om te voltooien de priming-cyclus. Zodra de cyclus voltooid is, de bob bevrijden van de cup en volledig droog de bob en de cup met een lage lint schoonmaken van weefsel.
Opmerking: Resterende water zal lyse erytrocyten, productie van interferentie.
2. meting van de vervormbaarheid als een functie van toenemende shear stress
- Het verkrijgen van bloed (minder dan 1 mL is voldoende voor het uitvoeren van deze technieken met repliceert) in flesje met een passende antistollingsmiddel.
Opmerking: EDTA verdient de voorkeur boven heparine omdat het heeft minder invloed op hemorheological parameters. 33 keep bloed bij kamertemperatuur als metingen worden uitgevoerd binnen 6 uur na bloed trekken. - Meng voorzichtig volbloed monster vóór de proef door het omkeren van de flacon meerdere malen. Voeg 25 µL van volbloed tot 5 mL van de iso-osmolar PVP oplossing door pipetteren, cap de flacon en meng zachtjes door het omkeren van meerdere malen. De iso-osmolar PVP oplossing moet een osmolaliteit tussen 284 en 304 mOsm/kg, een pH van 7.3-7.4 bij 25 ° C en een viscositeit van 27,0-33,0 cP bij 37.0 ± 0,5 ° C.
- Op de software door vervormbaarheid te kiezen in het hoofdmenu. Maak een nieuwe analyse en voeg toe experimentele details (vervormbaarheid | Toevoegen van de gewenste details | Oke).
- Open klep te ektacytometer, Controleer of de bob is volledig verlaagd in beker en de cup draait.
- Voeg 1 mL PVP bloed oplossing in de ruimte tussen de kop en bob door pipetteren.
- Til de bob iets om monsters neerhalen. Wacht totdat alle bubbels zijn verhuisd uit de oplossing, dan sluit het deksel aan de ektacytometer. Indien nodig, druk op de knop van de ambitie om te helpen verwijderen van de bubbels.
- De winst voor de 200 aanpassen door de pijl langs de schuifbalk te bewegen op de software (zie opmerking). Wanneer de temperatuur is stabiel bij 37 ° C en het diffractie-beeld is stabiel, pers start (starten).
Opmerking: Voor vele studies, kan een goede diffractie-beeld worden verkregen uit gezonde bloed (hemoglobine concentratie > 12,0 g / dL, mean corpuscular volume van 80-96 fL en mean corpuscular hemoglobine concentraties van 33-36 g/dL) met de winst van de camera ingesteld op 200. Voor studies met bloed van sikkelcelanemie is is de winst van de camera voor het genereren van een 4,5 cm diffractie beeld aan te passen voorgesteld als de standaardinstelling waarmee de vergelijking van resultaten over studies en laboratoria. 9 - Diffractie patronen als data acquisitie vordert om ervoor te zorgen dat ze circulaire, elliptische blijven of ruitvormige observeren. Wanneer data-acquisitie voltooid is, opslaan of afdrukken van het rapport (bestand | Opslaan of bestand | Print). EI Max en SS ½ waarden zal automatisch worden gemeld samen met rek indexcijfers overeenkomt met de gebruiker opgegeven of standaard schuintrekken benadrukt. Gegevens wordt ook automatisch door de software worden opgeslagen.
- Aan het eind, drukt u op de schone optie in het dialoogvenster op de monitor van de computer (Clean). Nadat het monster is aanzuiging, spoel de ruimte tussen de kop en bob door spuiten gedeïoniseerd water in de ruimte, terwijl het instrument in de schone cyclus blijft. Zodra de schone cyclus voltooid is, de bob bevrijden van de cup en volledig droog de bob en de cup met een lage lint schoonmaken van weefsel (kritische: resterende water zal lyse erytrocyten, productie van interferentie).
- Klik op de knop Hoofdmenu op de software terug te keren naar de hoofdpagina (Hoofdmenu).
3. meting van de cellulaire heterogeniteit
- Meng voorzichtig volbloed monster vóór de proef door het omkeren van de flacon meerdere malen. Pipetteer 25 µL van volbloed naar een nieuwe 5 mL flacon van iso-osmolar PVP oplossing, cap de flacon en meng zachtjes door tot het mengsel homogeen omkeren.
- Vervormbaarheid kiezen in het hoofdmenu. Maak een nieuwe analyse en voeg toe experimentele details (vervormbaarheid | Toevoegen van de gewenste details | Oke).
- Open klep te ektacytometer, Controleer of de bob is volledig verlaagd in beker en de cup draait.
- Pipet 1 mL van de PVP bloed oplossing in de ruimte tussen de kop en de bob.
- Wacht totdat alle bubbels zijn verhuisd uit de oplossing, dan sluit het deksel aan de ektacytometer.
- Zorg ervoor dat de afbeelding van een stabiele diffractie aanwezig op het scherm. De winst van de camera aanpassen door de pijl langs de schuifbalk te verplaatsen op de software totdat het produceert een 3.8 cm diffractie hoogte. Een liniaal gebruiken om te controleren of de hoogte van de afbeelding op het computerscherm.
- Wanneer de temperatuur is stabiel bij 37 ° C en het diffractie-beeld is stabiel, pers start (starten).
- Observeren diffractie patronen om ervoor te zorgen dat ze circulaire, elliptische of ruitvormige blijven gaandeweg data acquisitie. Wanneer data-acquisitie voltooid is, opslaan of afdrukken van het rapport (bestand | Opslaan of -bestand | Print).
- Aan het eind, drukt u op de schone optie in het dialoogvenster op de monitor van de computer (Clean). Nadat het monster is aanzuiging, spoel de ruimte tussen de kop en bob door gedeïoniseerd water uit een fles spuit erin spuiten maar blijft het instrument in de schone cyclus. Zodra de schone cyclus voltooid is, de bob bevrijden van de cup en volledig droog de bob en de cup met een lage lint schoonmaken van weefsel (kritische: resterende water zal lyse erytrocyten, productie van interferentie).
- Herhaal stap 2.1-2.5 en aanpassen van de winst van de camera om te verkrijgen van een 4,5 cm diffractie patroon hoogte (stap 2.2).
- Herhaal stap 2.1-2.5 en aanpassen van de winst van de camera om te verkrijgen van een 5,4 cm diffractie patroon hoogte (stap 2.2).
- Aan het eind, klik op de knop hoofdmenu terug te keren naar de hoofdpagina van de software (hoofdmenu).
- Met de volgende vergelijking (de dezelfde vergelijking kan worden uitgevoerd met de gegevens uit de hoogte 4,5 cm diffractie patroon indien gewenst) kunt u bepalen de mate van diffractie patroon vervorming op basis van EI Max als een percentage:
- Ook om te bepalen van de mate van diffractie vervorming van de patroon gebaseerd op SS1/2 gebruik de dezelfde vergelijking met het gerapporteerde SS1/2-waarde:
4. osmotische gradiënt ektacytometry
- Verkrijgen monster zoals beschreven in punt 1.1. Meng voorzichtig volbloed monster vóór de proef door het omkeren van meerdere malen. 250 µL van volbloed aan 5 mL iso-osmolar PVP flacon toevoegen door pipetteren, cap de flacon en meng zachtjes door tot het mengsel homogeen omkeren.
- Kies osmoscan in het hoofdmenu (Osmoscan). Plaats de ampul met het bloed PVP oplossing onder de naald op de linkerkant van de machine. De naald tot het raakt lager de onderkant van de flacon. Zorg ervoor dat de buis goed is aangesloten op de lage en hoge osmolar oplossingen voor de productie van de kleurovergang. Sluit het deksel aan de ektacytometer en de deur van de onderste helft te openen zodat u kunt kijken het bloed invoeren van de buis.
- Druk op de nieuwe analyse en typ in experimentele details (Osmoscan | Nieuwe analyse | Voer de gewenste details | Oke). De winst van de camera tot 200 aanpassen door het bewegen van de pijl onder controle op de software en laat de machine lopen tot bloed is gezien het invoeren van de cup van de buizen onder het instrument.
- Zodra het bloed de cup heeft ingevoerd en een stabiele diffractie patroon beeld op het computerscherm is, beginnen data-acquisitie door nu te drukken op de start knop in het dialoogvenster (nu starten).
- Toestaan dat de ektacytometer te verwerven van de gegevens tot en met ongeveer 500 mOsm/kg, dan stoppen van het instrument. Rapport opslaan of afdrukken (bestand | Opslaan of bestand | Print). Gegevens worden ook automatisch opgeslagen.
- Verwijder de oude PVP-bloed-flacon. Vervangen door een schoon flesje met gedeïoniseerd water. Plaats deze onder de naald, de naald omlaag te brengen zodat het raakt de bodem van de ampul en druk op de knop van de spoelen in het dialoogvenster te spoelen van de kleurovergang systeem (spoelen).
- Zodra de spoeling voltooid is, drukt u op de schone optie in het dialoogvenster op de monitor van de computer (Clean). Zodra de schone cyclus voltooid is, de bob bevrijden van de cup en volledig droog de bob en de cup met een lage lint schoonmaken van weefsel (kritische: resterende water zal lyse erytrocyten, productie van interferentie).
Opmerking: Het osmoscan-verslag biedt rek indexcijfers over de osmotische gradiënt. EI Min O (EI Min) EI Max, O (EI Max), EI hyper en O hyper worden automatisch gegenereerd en opgenomen in het verslag. Het bereik van de parameters van de osmotische gradiënt ektacytometry verkregen uit bloed uit 9 gezonde vrijwilligers is: EI Min 0.12-0.196 willekeurige eenheden (a.u.); O Min 117-144 mOsm/kg; EI Max 0.551-0.573 a.u.; O (EI Max) 272-312 mOsm/kg; EI hyper 0.278-0.286; O Hyper 454-505 mOsm/kg.
5. het uitschakelen van de ektacytometer
- Het instrument goed schoon voordat het wordt afgesloten.
- Om dit te doen, sluit de slang uit de lage en hoge osmolar oplossingen aan de y-adapter leidt tot de reinigingsoplossing. Plaats een flacon met reinigingsoplossing onder de naald op de linkerkant van de machine en de naald te verlagen totdat het raakt de bodem van de flacon. Zorg ervoor dat de bob volledig wordt verlaagd in de beker.
- Dicht de software, en druk op start op het einde van de dag schoon dialoogvenster op de computermonitor (Close | Start). Het toestaan van het instrument om te doorlopen volledig reinigen.
- Koppel de buis aan de afval fles en verwijder het uit het instrument te ontdoen van afvalstoffen. De bob volledig drogen. De machine uit te schakelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten van de ektacytometry die worden beschreven in dit manuscript kunnen worden gebruikt voor het meten van de vervormbaarheid van de rode cel in elke conditie. Een schematische voorstelling van de algemene set-up van een ektacytometer is afgebeeld in Figuur 1. Homogene populaties van erytrocyten zal produceren een elliptische diffractie patroon in reactie op de toenemende shear stress die kan worden gebruikt voor de berekening van de index van de rek zoals afgebeeld in Figuur 2. Diffractie patroon vervorming optreedt in heterogene bloedmonsters omdat rigide rode bloedcellen niet met vervormbare cellen uitlijnen en een sferische patroon produceren dat overlays de ellips resulterend in een diamant gevormd is diffractie patroon. Deze vervormde patroon is steeds aantoonbaar de winst van de camera is aangepast voor het genereren van grotere diffractie patroon maten zoals afgebeeld in Figuur 3. Homogene bloed populaties, zoals bij gezonde vrijwilligers, niet produceren verschillende vervormbaarheid curven wanneer verschillende diffractie maten worden gemeten (figuur 4A). In tegenstelling, Toon heterogene bloed populaties, zoals bloed van patiënten met sikkelcel anemie, significante dalingen in vervormbaarheid maatregelen als een functie van diffractie patroon grootte (Figuur 4). In de sikkel bloed, wanneer de mate van diffractie patroon vervorming wordt gemeten als een functie van EI Max, is gecorreleerd met HbS (figuur 5A) en de volwassen hemoglobine variant, HbA2 (figuur 5C). Transfusie corrigeert de vervorming, zoals aangegeven door een omgekeerde relatie met het percentage van de normale volwassen hemoglobine (HbA) in het bloed (figuur 5D). Of de mate van diffractie patroon vervorming wordt gemeten als functie van de schuifspanning ½ (figuur 5B) of als een functie van EI Max (figuur 5E), is het gecorreleerd met fetal hemoglobine. Echter, de relatie is sterker in de voormalige dan de laatste. Belangrijkste osmotische gradiënt ektacytometry parameters, zoals de O (EI Max), EI Min en Min O bevatten aanvullende informatie over de cellulaire hydratatie, oppervlakte-naar-volume verhoudingen en osmotische fragiliteit, respectievelijk. Osmotische gradiënt curven sikkel bloed verkregen zijn typisch links-verschoven met aanzienlijke afname in vervormbaarheid die zijn steeds duidelijker in de hypertonic regio zoals aangegeven in Figuur 6.
Figuur 1 . Schematische van ektacytometer set-up. Een buitenste cup draait rond een stationaire bob om genereert shear stress op bloed geresuspendeerde in een PVP-oplossing van gedefinieerde viscositeit die tussen hen is geplaatst. Een patroon van diffractie wordt gegenereerd door een laser die de oplossing passeert en de diffractie patroon wordt weergegeven op een projectiescherm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Algemeen overzicht van de relatie tussen diffractie patroon en rek index. Diffractie patroon verkregen uit gezonde bloed in reactie op de shear stress toont de verwachte elliptische patroon. Rek-index (EI) wordt berekend met behulp van de vergelijking 7aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Cellulaire heterogeniteit produceert diffractie patroon verstoringen. Diffractie patronen verkregen uit bloed van een patiënt met sikkelcel anemie, wanneer de camera winst wordt aangepast tot A) een 3.8 cm diffractie patroon, B) een patroon van 4,5 cm diffractie en C) een 5,4 cm diffractie patroon. Vervormbaarheid curven weergegeven: een geleidelijke afname van de schijnbare vervormbaarheid en een overeenkomstige toename in schijnbare schuifspanning ½, aangegeven door de regels uit het dezelfde bloed wanneer de camera winst wordt aangepast tot D) de 3.8 cm diffractie patroon, E) het patroon van 4,5 cm diffractie en F) het 5,4 cm diffractie patroon. [Herdrukt met toestemming van Parrow et al. 10]. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Diffractie patroon verstoringen produceren een duidelijke afname van de vervormbaarheid in een heel scala van schuifspanningen in bloed van patiënten met sikkelcel anemie. Vergelijking van de vervormbaarheid curven gegenereerd op basis van A) bloed van gezonde vrijwilligers en B) bloed van patiënten met sikkelcel anemie door de winst van de camera aan te passen voor het genereren van een 3.8 cm, 4,5 cm en 5,4 cm patroon grootte van diffractie. Vervormbaarheid krommen die zijn gegenereerd met het bloed van patiënten met sikkelcel anemie, maar niet van gezonde vrijwilligers, tonen geleidelijke en aanzienlijke dalingen in schijnbare vervormbaarheid naar aanleiding van zo weinig zoals 5 Pa shear stress als een functie van diffractie de grootte van het patroon. [Herdrukt met toestemming van Renoux et al. 9]. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . De mate van diffractie patroon vervorming is gecorreleerd met de samenstelling van de hemoglobine in het bloed van patiënten met sikkelcel anemie. Lineaire regressie-analyses laten de relatie zien tussen A) de EI Max gebaseerde vervorming in vervormbaarheid en het percentage van de HbS, B) de vervorming van de 1/2 gebaseerde van de SS in vervormbaarheid en het percentage van fetal hemoglobine (HbF), C) de EI Max gebaseerde vervorming in vervormbaarheid en het percentage van de HbA2, D) de EI Max gebaseerde vervorming in vervormbaarheid en het percentage van HbA en E) ten behoeve van directe vergelijking, de EI Max gebaseerde vervorming in vervormbaarheid en het percentage van de HbF in bloed van patiënten met sikkelcel anemie. Pearson-correlatiecoëfficiënt, ren bijbehorende p-waarde worden aangegeven. [Herdrukt met toestemming van Parrow et al.,10]. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Bloed van een patiënt met sikkelcel anemie toont een karakteristiek linker shift gelijktijdig met verminderde vervormbaarheid in vergelijking met bloed van een gezonde vrijwilliger wanneer geanalyseerd door osmotische gradiënt ektacytometry. Bloed van een gezonde vrijwilliger (-) toont een representatieve osmotische gradiënt ektacytometry curve met de locatie van belangrijke parameters aangegeven. Osmotische gradiënt waarden uit de gezonde vrijwilligers zijn 0.143 a.u. voor EI Min, 146,3 mOsm/kg voor O Min, 0.576 a.u. voor EI Max en 473 mOsm/kg voor O hyper. Een representatieve osmotische gradiënt ektacytometry curve gegenereerd met bloed van een patiënt met sikkelcel anemie wordt bedekt (-). Osmotische gradiënt waarden uit het bloed van de sikkelcel zijn 0.237 a.u. voor EI Min, 110.3 mOsm/kg voor O Min, 0.429 a.u. voor EI Max en 406 mOsm/kg voor O hyper. [Aangepast met toestemming van Parrow et al. 10]. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven technieken van de ektacytometry zijn eenvoudig en goed geautomatiseerde, geldig en reproduceerbare resultaten te waarborgen. Niettemin bestaan enkele kritische stappen. Juiste temperatuurcontrole van het bloed is belangrijk. Opslag bij kamertemperatuur gedurende meer dan acht uur van invloed kan zijn op de SS ½ waarden. 34 ervoor zorgen dat de temperatuur van de machine stabiel bij 37 ° C is is ook belangrijk, want de viscositeit van het opschorten medium is temperatuur afhankelijk. Bloed moet volledig worden zuurstof Voorkom verminderde vervormbaarheid die voortvloeien uit niet-zuurstof of gedeeltelijk zuurstofrijk monsters, tenzij dit experimentele parameters van belang zijn. 35 uit het oogpunt van instrumentatie, goede reiniging van het instrument is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er geen PVP resterende in de buis of het ingangspunt van de bob als het via het instrument na drogen en blok vloeistofstromen zal verharden. Aandacht aan deze details zal bevorderen van nauwkeurige resultaten en het instrument in goede lopende conditie houden.
Kwantificering van cellulaire heterogeniteit kan worden aangepast. In de 3.8 cm diffractie patroon, kunnen sommige monsters een steile daling in de rek-index bij de hoogste schuifspanningen weergeven. Dit kan soms worden verholpen door het herhalen van de meting met een vers monster. Anders, de mate van diffractie patroon vervorming kan worden gemeten met behulp van een indexwaarde rek van een lagere shear stress of de 4,5 cm diffractie patroon kan worden gebruikt. 9 het ook moeilijk kan zijn om een 3.8 cm diffractie patroon uit gezonde bloed omdat de lengteas van de ellips te lang zelfs bij de laagste versterking van de camera. Nogmaals, de 4,5 cm diffractie patroon gegevens kan worden gebruikt om dit probleem te omzeilen. De waarde die wordt gekozen moet natuurlijk worden constant gehouden over het experiment als vergelijkingen zijn alleen mogelijk van gegevens die zijn berekend op basis van dezelfde gegevens punt en diffractie patroon grootte. Aangezien de cellulaire heterogeniteit maatregelen afhankelijk van instrument ingesteld, interne validatie door het meten van diffractie patroon verstoringen op geïsoleerde cel breuken kan worden verkregen of mengsels van breuken, volgende dichtheid nauwkeurig te definiëren centrifugeren zoals hiervoor is beschreven. 6
Het is belangrijk op te merken dat vele ektacytometry parameters gevoelig voor kenmerken van de patiënt zijn. Voorbeelden in sikkelcelanemie zijn alpha-globine status,36 MCV 37 en transfusie. 10 daarom, klinische studies moeten zorgvuldig worden ontworpen en deze relaties moeten administratief worden verwerkt bij de interpretatie van de gegevens van de ektacytometry.
Een ander belangrijk voorbehoud is dat er niet sprake is van een rechtstreekse algemene relatie tussen verminderde ektacytometry maatregelen en afname van de overleving van de rode cel. Asymptomatische voorwaarden met ernstig verminderde vervormbaarheid, zoals Zuidoost-Aziatische ovalocytosis, aanwezig. 38 vervormbaarheid metingen door elke techniek zijn echter complex en afhankelijk van de cel-oppervlakte volumeverhouding (bolvorm), cytoplasmatische viscositeit (cellulaire hemoglobine concentratie) en membraan stijfheid. Reologie van de rode cel is eveneens ingewikkeld, en er is niet een beschikbare techniek die de complexiteit van de fysiologische bloedstroom in verschillende vasculaire bedden kan reproduceren. Ektacytometry biedt niettemin belangrijke inzichten in gewijzigde rode cel vervormbaarheid en reologie.
De belangrijkste beperking van ektacytometry is het onvermogen om te meten vervormbaarheid in afzonderlijke cellen. Dus, in sikkelcelanemie, er is geen manier om te bepalen van de bijdrage van de fetal hemoglobine, die een heterocellular-distributie, op de vervormbaarheid van een bepaalde erytrocyt heeft. 10 ook in een pool van Plasmodium geïnfecteerd bloed van een patiënt er is geen manier om te bepalen van de invloed van de looptijd van de parasiet binnen een specifieke rode bloedcellen. 19 toekomst studies ektacytometery resultaten vergelijken met die welke verkregen met behulp van de methoden van toepassing voor afzonderlijke cellen zou waardevol zijn. Ongeacht deze beperking biedt ektacytometry een handige en gevoelige maat voor de Rheologische eigenschappen van erytrocyten en de heterogeniteit van de bevolking van het bloed. Deze gegevens zijn belangrijk in de studie van verschillende stoornissen en vaak van klinische relevantie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van de nationale instituten van Diabetes, digestief en nierziekten en de National Heart, Lung en bloed Instituut van het National Institutes of Health. De meningen die hierin zijn de exclusieve verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
References
- Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance. Blood. 61 (5), 899-910 (1983).
- Da Costa, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders: Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells Mol Dis. 56 (1), 9-22 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. J Clin Invest. 65 (1), 189-196 (1980).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Bessis, M., Mohandas, N. Laser Diffraction Patterns of Sickle Cells in Fluid Shear Fields. Blood Cells. 3, 229-239 (1977).
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Blood Cell - An Overview of Studies in Hematology. Moschandreou, T. E. , InTech. (2012).
- Streekstra, G. J., Dobbe, J. G., Hoekstra, A. G. Quantification of the fraction poorly deformable red blood cells using ektacytometry. Opt Express. 18 (13), 14173-14182 (2010).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization for the ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2 in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells Mol Dis. 65, 41-50 (2017).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Johnson, R. M., Ravindranath, Y. Osmotic scan ektacytometry in clinical diagnosis. J Pediatr Hematol Oncol. 18 (2), 122-129 (1996).
- Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S., Shohet, S. B. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest. 66 (3), 563-573 (1980).
- Lazarova, E., Gulbis, B., Oirschot, B. V., van Wijk, R. Next-generation osmotic gradient ektacytometry for the diagnosis of hereditary spherocytosis: interlaboratory method validation and experience. Clin Chem Lab Med. 55 (3), 394-402 (2017).
- Anderson, C., Aronson, I., Jacobs, P. Erythrocyte Deformability is Reduced and Fragility increased by Iron Deficiency. Hematology. 4 (5), 457-460 (1999).
- Reinhart, W. H., et al. Washing stored red blood cells in an albumin solution improves their morphologic and hemorheologic properties. Transfusion. 55 (8), 1872-1881 (2015).
- Shin, S., et al. Progressive impairment of erythrocyte deformability as indicator of microangiopathy in type 2 diabetes mellitus. Clin Hemorheol Microcirc. 36 (3), 253-261 (2007).
- Tu, H., et al. Low Red Blood Cell Vitamin C Concentrations Induce Red Blood Cell Fragility: A Link to Diabetes Via Glucose, Glucose Transporters, and Dehydroascorbic Acid. EBioMedicine. 2 (11), 1735-1750 (2015).
- Tiburcio, M., et al. A switch in infected erythrocyte deformability at the maturation and blood circulation of Plasmodium falciparum transmission stages. Blood. 119 (24), e172-e180 (2012).
- Henon, S., Lenormand, G., Richert, A., Gallet, F. A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers. Biophys J. 76 (2), 1145-1151 (1999).
- Mills, J. P., Qie, L., Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers. Mech Chem Biosyst. 1 (3), 169-180 (2004).
- Moura, D. S., et al. Automatic real time evaluation of red blood cell elasticity by optical tweezers. Rev Sci Instrum. 86 (5), 053702 (2015).
- Evans, E. A. New membrane concept applied to the analysis of fluid shear- and micropipette-deformed red blood cells. Biophys J. 13 (9), 941-954 (1973).
- Chen, X., Feng, L., Jin, H., Feng, S., Yu, Y. Quantification of the erythrocyte deformability using atomic force microscopy: correlation study of the erythrocyte deformability with atomic force microscopy and hemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (3), 243-251 (2009).
- Musielak, M. Red blood cell-deformability measurement: review of techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (1), 47-64 (2009).
- Dobbe, J. G., Streekstra, G. J., Hardeman, M. R., Ince, C., Grimbergen, C. A. Measurement of the distribution of red blood cell deformability using an automated rheoscope. Cytometry. 50 (6), 313-325 (2002).
- Dobbe, J. G., et al. Analyzing red blood cell-deformability distributions. Blood Cells Mol Dis. 28 (3), 373-384 (2002).
- Kikuchi, Y., Arai, T., Koyama, T. Improved filtration method for red cell deformability measurement. Med Biol Eng Comput. 21 (3), 270-276 (1983).
- Moessmer, G., Meiselman, H. J. A new micropore filtration approach to the analysis of white cell rheology. Biorheology. 27 (6), 829-848 (1990).
- Guo, Q., et al. Microfluidic analysis of red blood cell deformability. J Biomech. 47 (8), 1767-1776 (2014).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Appl Phys Lett. 100 (17), 173702-173703 (2012).
- Baskurt, O. K., et al. Comparison of three commercially available ektacytometers with different shearing geometries. Biorheology. 46 (3), 251-264 (2009).
- Baskurt, O. K., et al. New guidelines for hemorheological laboratory techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (2), 75-97 (2009).
- Uyuklu, M., et al. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (4), 269-278 (2009).
- Uyuklu, M., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effect of hemoglobin oxygenation level on red blood cell deformability and aggregation parameters. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (3), 179-188 (2009).
- Embury, S. H., Clark, M. R., Monroy, G., Mohandas, N. Concurrent sickle cell anemia and alpha-thalassemia. Effect on pathological properties of sickle erythrocytes. J Clin Invest. 73 (1), 116-123 (1984).
- von Tempelhoff, G. F., et al. Correlation between blood rheological properties and red blood cell indices(MCH, MCV, MCHC) in healthy women. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (1), 45-54 (2016).
- Da Costa, L., Galimand, J., Fenneteau, O., Mohandas, N. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Rev. 27 (4), 167-178 (2013).
