Summary
Qui, presentiamo la legatura dei dotti biliari parziale come un modello chirurgico della lesione del fegato e la rigenerazione in roditori.
Abstract
Nei roditori, la legatura del dotto biliare completa (cBDL) del dotto biliare comune è una tecnica chirurgica consolidata per lo studio della proliferazione del dotto biliare e colestasi ostruttiva. Tuttavia, esperimenti a lungo termine possono portare a un aumento della morbilità e la mortalità. In ceppi di selezione del mouse con affezione epatica di fondo, confronti significativi possono avvenire anche con la legatura di un singolo lobo del fegato, che può ridurre le spese e le perdite degli animali. Qui, descriviamo la legatura parziale dei dotti biliari (pBDL) nel topo, in cui solo il sinistra dei dotti biliari epatici è legato, causando ostruzione biliare nel lobo di sinistra ma non i lobi rimanenti. Con un'attenta tecnica microchirurgica, esperimenti di pBDL possono essere convenienti, poiché il lobo deossiHb serve come controllo interno ai lobi legati, quando sottoposti alle stesse condizioni dello stesso animale. A differenza di cBDL, un gruppo di controllo sham-operated separato non è necessario. pBDL è altamente utile direttamente confronta localizzato contro effetti sistemici di colestasi e altri componenti di bile mantenuto. pBDL può essere riproposto anche come un nuovo metodo per studiare i meccanismi legati ai farmaci e migrazione cellulare.
Introduction
Modelli chirurgici di lesioni epatiche acute e riparazione, ad esempio hepatectomy parziale o legatura del dotto biliare comune (cBDL), sono stati utilizzati per decenni in roditori per studiare la rigenerazione del fegato e patobiologia1,2. In cBDL, il dotto biliare comune (che drena tutta bile prodotta nel fegato) è legato, con conseguente colestasi ostruttiva, infiammazione e fibrosi nelle prime 2-3 settimane dopo la chirurgia, con eventuale progressione verso la cirrosi3. Proliferazione dei dotti biliari, transdifferenziazione e induzione di cellule staminali e progenitori residenti del fegato sono anche caratteristiche di cBDL4,5. Anche se cBDL delucida meccanismi specifici di colangiopatia ostruttiva, che sono ben caratterizzati con risultati riproducibili nei topi wild-type e in quegli sforzi con fegati normali6,7,8, la procedura può essere tecnicamente impegnativo in alcuni modelli di topi transgenici di malattie del fegato, che richiedono gli animali più del previsto a causa di più alta morbilità e mortalità dell'ostruzione biliare nel corso del tempo. Questa tecnica è anche utile per lo studio della malattia di topi transgenici con sottostanti del fegato, che altrimenti non potrebbe tollerare lo stress degli esperimenti di corso di tempo prolungato dopo cBDL.
pBDL può fornire un'alternativa ragionevole per aiutare a superare alcune di queste sfide. PBDL iniziale studi nei topi wild-type volti a distinguere localmente recitazione e sistemici di mediatori di infiammazione9. In pBDL, la confluenza biliare principale dei dotti biliari epatici destro e sinistro sopra il dotto biliare comune è attentamente fruita al hilum, e solo il sinistra dei dotti biliari epatici è legato per generare una colestasi ostruttiva localizzata. pBDL offre diversi vantaggi ai cBDL. In pBDL, il lobo di destra deossiHb serve come controllo interno identicamente abbinato per il lobo di sinistra legato, sottoposto agli stessi effetti sistemici, quali lo stato nutrizionale o fattori di circolazione. Anche se mediatori pro-infiammatori sistemici erano presenti, Osawa et al osservati meno fibrosi e necrosi nei lobi deossiHb, ma aumentato di cellule infiammatorie e l'espressione di fattore di crescita-β trasformante nel lobo dei9.
Più recentemente, pBDL è stato ridefinito per studiare gli effetti sul fegato parenchimatici di bile mantenuto10. Utilizzando lo stesso animale per il controllo interno (deossiHb "falsità") e nei gruppi sperimentali, pBDL in modo efficace dimezza il numero di animali necessari per esperimento, che a sua volta è più conveniente. I topi tollerano gli effetti di pBDL molto meglio, in modo che il momento ideale corso sperimentare (≥ 2 settimane) possono essere raggiunto nel lobo legato. La cosa più importante, pBDL in grado di distinguere gli effetti diretti intraepatici di colestasi ostruttiva e mantenuto componenti della bile nel lobo legato, rispetto al lobo deossiHb controllo. Nel complesso, pBDL è un interessante metodo per studiare gli effetti specifici del lobo di colestasi localizzata nel fegato.
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Protocol
Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida etiche del Comitato uso dell'Università di Pittsburgh e istituzionali Animal Care.
1. basi tecniche e procedure comuni
- Autoclave microsurgical tutte le apparecchiature prima dell'uso.
- Per evitare di uccidere il mouse dall'anestesia, controllare attentamente il suo modello di respirazione.
- Toccare gli organi e il meno possibile per evitare di danneggiare gli organi e causando sanguinamento dell'intestino. Premere punti di spurgo con tamponi di cotone bagnato o spugne garza.
- Utilizzare tamponi di cotone bagnato per la delicata manipolazione degli organi. Spugne garza bagnata, non-tessuto sono utilizzati in due dimensioni, 3,5 × 3,5 cm e 6.0 × 6,0 cm. utilizzare quella più piccola per ritrarre l'intero fegato. Utilizzare quello più grande per avvolgere i piccoli e grandi intestini.
2. prechirurgica preparazione
- Utilizzare topi c57/b6 maschi, 8-12 settimane di età (quando il peso corporeo è circa 20-35 g) per legatura parziale dei dotti biliari.
- Consentire il libero accesso all'acqua e cibo i topi fino ad induzione dell'anestesia.
3. operazione di legatura dei dotti biliari parziale
- Anestetizzare il mouse mettendo l'animale in un'aula di induzione con un mix di 1.5-2.0% isoflurane e 1 L/min di ossigeno. Monitorare con attenzione l'animale osservando il tasso di respirazione. Quando il tasso di respirazione dell'animale è un fiato al secondo, il mouse è ben anestetizzato. Dal momento che il riflesso di ritiro arto anteriore scomparirà più rapidamente, pizzicare il piede dell'arto anche per confermare la completa assenza del riflesso del ritiro. Gli occhi devono essere lubrificati con un agente oftalmico lubrificante per prevenire le ulcere corneale. Nota che la prima dose di analgesico può essere dato pre-operatively per prevenire la stimolazione dei recettori del dolore.
- Rasatura della parete addominale con tosatrici e posizionare il mouse sul tavolo operatorio al microscopio chirurgico. Fissare tutte le membra al tavolo con del nastro. Uso inalatorio isoflurano per mantenere il mouse in anestesia generale.
- Regolare il vaporizzatore di isoflurano e utilizzare isoflurano 2.0-3.0% per induzione.
- Utilizzando tamponi sterili, disinfettare la parete addominale prima con 0.3-0.5 mL povidone-iodio applicato topicamente, seguita da etanolo al 70%. Animale dovrebbe essere coperto con un telo sterile.
- Praticare un'incisione addominale lunga linea mediana al xifoideo al pube usando le forbici e pinzette Adson. Dopo aver effettuato l'incisione addominale, ridurre isoflurano a 0,8-1,0% per la manutenzione.
- Esporre la cavità addominale utilizzando una Micro-divaricatore. Tenere il xifoideo con pinza mosquito e ritrarre verso la testa del mouse. Fissare la pinza mosquito mediante argilla morbida.
- Instillare 1-2 mL di caldo (37 ° C) sterilizzato tampone fosfato salino (PBS) nella cavità addominale per evitare di ferire gli organi addominali. Tenere il piccolo intestino con tamponi di cotone bagnato e li retrarre delicatamente verso la testa del mouse. Tagliare i legamenti tra l'intestino tenue e il retroperitoneum per evitare di ferire il piccolo intestino (Figura 1A).
- Avvolgere i piccoli e grandi intestini con una spugna bagnata, non-tessuto garza. Metterli sul lato caudale della cavità addominale. Intestini avvolti in garza sterile possono essere posizionati su campo drappeggiato sterile per evitare la contaminazione.
- Ritirare delicatamente l'intero fegato verso il xifoideo utilizzando una spugna piccola garza umida di tessuto non tessuto per esporre l'ILO epatico e legamento epato-duodenale (Figura 1B).
- Verifica per confermare l'anatomia dell'ILO epatico. Il dotto biliare comune è situato sul lato ventrale della vena portale. Confermare le posizioni della destra e il sinistra dei dotti biliari epatici, che vuotano nella confluenza biliare principale all'ilo epatico.
- Identificare il sinistra dei dotti biliari epatici che drena il lobo di sinistra e circondano con una sutura in nylon 10-0 con la parte smussata di un ago per sutura (Figura 2A). Evitare di ferire la vena porta, arteria epatica e superficie del fegato.
- Legare il dotto biliare di sinistro con nylon 10-0. (Figura 2B).
- Posizionare i piccoli e grandi intestini nella stessa posizione come prima dell'operazione utilizzando tamponi di cotone bagnato.
- Confermare che non c'è nessuna torsione intestinale e spurgo intra-addominale, quindi chiudere il muscolo e la pelle in due strati con vicryl 4-0. Sutura intrecciata (Vicryl) è stato utilizzato per la chiusura della pelle, ma monofilamento è preferito per ridurre la probabilità di infezione.
Nota: Chiudere fascia da sutura continua da xifoideo al pube e chiudere la pelle da sutura continua dal pube al xifoideo. - Interrompere l'anestesia dopo l'incisione di chiusura.
4. follow-up e trattamento postoperatorio
- Appena dopo l'intervento chirurgico, pizzicare la pelle dorsale del mouse e iniettare Buprenex (0,1 mg/kg) e cefazolina (100 mg/kg) per via sottocutanea, seguita da Buprenex iniezione ogni 12 h per 3 giorni e cefazolina ogni 24 h per 3 giorni rispettivamente11,12 ,13. Nota che la prima dose di analgesico può essere dato pre-operatively per prevenire la stimolazione dei recettori del dolore. Cefazolina e altri antibiotici peri-operatorio sono necessarie solo per animali immunosoppressi, come quelli usati negli studi di trapianto.
Nota: Se l'ambulatorio è stato effettuato con successo, il mouse di solito recupera entro 30 min. attività dei topi sarà quasi lo stesso come la condizione preoperatoria. - Controllare i topi al giorno per tutti i segni di afflizione.
- Sacrificare i topi dalla dislocazione cervicale in anestesia generale per procurarsi il fegato e altri campioni di tessuto (cioè, 7, 14, 21 giorni) a intervalli di tempo definiti previa pBDL.
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Representative Results
Per questo esperimento tipico, pBDL è stato effettuato in triplice copia PiZ di topi transgenici, che ricapitolano la malattia del fegato umana trovata in alfa-1 antitripsina (A1AT). Il mouse di PiZ overexpresses un transgene composta da più frammenti genomic del DNA che contengono le regioni codificanti del gene A1AT umano mutante e promotore, insieme con gli introni e ~ 2 kilobasi di upstream e downstream che fiancheggiano le regioni14, 15. A1AT normale è una proteina secreta siero prodotta nel fegato. La forma mutata di A1AT genera aggregati proteici insolubili che spontaneamente si accumulano nel fegato causando stress tossici. Gli esperimenti utilizzate 3 - mesi-vecchio maschi topi PiZ, che esprimono il fenotipo più grave di questa malattia, quando l'aggregazione proteica picchi16.
Biochemistries del fegato del siero sono stati confrontati in pBDL e cBDL PiZ topi (tabella 1)10. Gli enzimi epatici alanina aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST) sono biomarcatori di danno epatocellulare, mentre la bilirubina totale (TSB) misura il grado di colestasi. Nel complesso, i topi sottoposti a pBDL non hanno mostrato segni di grave danno epatico o colestasi, come i valori del siero erano simili a previsione10. È importante notare che i topi con pBDL non riuscito (a causa di problemi tecnici, come il dotto biliare o lesioni vascolari) mostrerà i valori del siero simili ai topi di cBDL, con significativo aumento degli enzimi epatici e TSB. Clinicamente, topi con pBDL fallito appariranno più jaundiced e in difficoltà, con i risultati di perdite di bile, ascite, peritonite o ematoma e in ultima analisi dovrà essere sacrificato.
Poiché i topi sottoposti a pBDL sviluppano specifiche del lobo colestasi ostruttiva, non acquistano la colecisti dilatata, scura, pieno di bile vista in cBDL. Solo il lobo legato appare più pallido a colori, mentre i lobi deossiHb manterranno la loro colorazione normale, scuro, bruno-rossastro (Figura 3). Ci sono differenze fondamentali in istologia del fegato pure, con proliferazione aumentata dei dotti biliari e fibrosi nel lobo legato (Figura 4). 10
Tabella 1: Biochemistries rappresentativo del fegato del siero dalla legatura del dotto biliare parziale (pBDL) rispetto a completare la legatura dei dotti biliari (cBDL) 10 . Ogni punto di tempo rappresenta topi di 3-4. Nota PiZ topi transgenici sono su uno sfondo di c57/bl6. Campi di riferimento del laboratorio sono anche riportati tra parentesi. (WT, selvaggio-tipo; TSB, bilirubina totale; ALT, alanina aminotransferasi; ALP, fosfatasi alcalina).
Figura 1:l'esposizione del sistema di cavità e hepatobiliary addominale. (A) piccoli intestini rifluiranno delicatamente per evitare la ferita delle viscere, e i legamenti comunicanti sono tagliare gratis from retroperitoneum. (B) fegato è delicatamente retratta per permettere la massima visualizzazione dell'albero biliare al hilum epatico (freccia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Legatura parziale dei dotti biliari. (A) l'estremità smussata dell'ago chirurgico è usato per circondare attentamente la sutura in nylon intorno la sinistra dei dotti biliari epatici, sopra la confluenza del dotto biliare comune (originale ingrandimento 40x). (B) successo legatura del dotto sinistro epatico biliare, che normalmente drena il lobo sinistro del fegato. I rimanenti dotti biliari sono deossiHb (originale ingrandimento 40x). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: lordo aspetto del fegato del topo WT (c57/b6) 14 giorni dopo pBDL. Si noti che il lobo di sinistra legato appare più pallido a colori (frecce), mentre i lobi deossiHb mantengono la loro colorazione normale, scuro, bruno-rossastro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Modifiche di lobo-specifiche nelle sezioni rappresentative del tessuto del fegato da giorno 14 pBDL confronto del lobo di destra deossiHb (R) dei lobo a sinistra (L) nei topi WT (c57/b6). (A) ematossilina ed eosina (H & E) visualizzando aumentata colorazione (frecce) proliferazione dei dotti biliari nel lobo legato. (B) Sirius rosso macchia visualizzando bridging fibrosi che accompagna la proliferazione dei dotti biliari nel lobo legato. Istologia per il PiZ mouse è stata precedentemente segnalato10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se cBDL è la più comune tecnica sperimentale per colestasi ostruttiva, può presentare molteplici sfide in roditori. A seconda del numero di giorni post-operatori necessaria per ottenere un endpoint, gli animali possono sperimentare significativa morbidità e mortalità mentre il tempo progredisce. Il grado di lesione del tessuto e necrosi biliare è ulteriormente aggravato quando si lavora con alcuni modelli di mouse transgenici dell'affezione epatica, che dimostrano il parenchima del fegato anormale e funzione alla linea di base. Rispetto al cBDL, i rapporti di pBDL sono limitati, ma questa tecnica può essere applicata come alternativa negli esperimenti selezionati per ridurre esiti negativi e perdite di animali.
Inoltre sono state segnalate variazioni nel metodo pBDL. Nel metodo di Heinrich et al., un ago curvo esterno è posizionato accanto al dotto biliare comune, seguito dalla legatura intorno sia il dotto biliare comune e l' ago17. L'ago viene rimosso prima della chiusura della parete addominale, con conseguente flusso di bile limitato attraverso un lume ristretto (cioè, ostruzione subtotale) del dotto biliare17. Durante questa procedura, la cistifellea viene rimosso anche per impedire la colecistite17. Gli autori hanno concluso che questo metodo era più utile per studiare la colestasi acuta piuttosto che cambiamenti cronici17. Al contrario, il metodo di pBDL che abbiamo descritto qui è molto controllato, con lobi ("sham") sia legati e deossiHb nello stesso animale, quindi meno animali sono necessari per esperimento. Anche animali transgenici con grave epatopatia sottostante possono essere sostenuti per più punti finali (2-3 settimane). Deve prestare attenzione per esporre completamente e di identificare l'albero biliare con tecniche di microdissezione, limitata manipolazione delle strutture vascolari e biliari per evitare lesioni.
Nell'esperimento ideale, tessuti dai lobi legati (a sinistra) e deossiHb (a destra) saranno raccolte allo stesso tempo, così i confronti diretti di funzione secretiva biliare e trasportatori possono essere fatta usando le tecniche istologiche e molecolari. Anche se biochemistries del fegato del siero non rifletterà grave colestasi, il lobo legato dimostrerà cambiamenti istologici associati a colestasi ostruttiva10. Questo modello è utile per studiare effetti diretti microambientali di componenti biliari conservati (per esempio, gli acidi biliari, lipidi, colesterolo) all'interno del fegato. Come uno studio futuro, può essere considerato pBDL per indagare cholehepatic lo smistamento, dove alcuni degli acidi biliari e farmaci vengono riassorbite direttamente da colangiociti a epatociti18,19. Endogeni acidi biliari coniugati inefficacemente dagli epatociti passivamente sono assorbiti dall'epitelio biliare a subire cholehepatic smistamento pure, che conduce a hypercholeresis e alkanlinization della bile di bicarbonato aumentata secrezione20. Applicazione della tecnica pBDL potrebbe facilitare la scoperta di nuovi farmaci identificando i meccanismi farmacologici per romanzo degli acidi biliari terapeutica sotto inchiesta per l'affezione epatica.
Applicazioni aggiuntive per pBDL possono estendersi oltre l'albero biliare. Reversibilità dei cBDL e dei suoi effetti associati è stata descritta, e questo può anche essere applicato a pBDL con confronto diretto per il controllo interno21. Allo stesso modo, bioimmagini longitudinale in vivo dell'espressione di reporter fluorescente in fegato del topo sono stato studiato dopo cBDL22, con potenti implicazioni per gli esperimenti pBDL. Inoltre, roditore esperimenti utilizzando pBDL hanno il potenziale per incorporare l'analisi lignaggio o "homing" delle cellule, quali cellule mesenchimali derivate da midollo osseo, al sito di danno epatico, consentendo loro di essere rilevati in vivo con più di circolazione precisione23,24,25.
Chiaramente, ci sono applicazioni diffuse per pBDL da solo come una tecnica internamente controllata e riproducibile per studiare al fegato e riparazione, con metabolismo biliare di fisiologia e di droga. Per gli esperimenti che mirano a valutare la progressione ed effetti sistemici di colestasi cronica, cBDL è ancora il metodo più comodo; Tuttavia, pBDL vorrei ancora aggiungere dati complementari per supportare tali risultati.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.
Acknowledgments
Dr. Khan riconosce sovvenzioni da NIH/NICHD K12HD052892, Alpha-1 Foundation, la Fondazione di Hillman e il centro di ricerca del fegato di Pittsburgh. Dr. Michalopoulos riconosce sovvenzioni da NIH/NIDDK P01DK096990. Apprezziamo l'assistenza tecnica eccellente e generoso di Anne Orr. Siamo anche grati al Dr. David A. Geller per fornire l'accesso al laboratorio di microchirurgia trapianto/roditore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope-Leica Wild M650, 6–40× magnification | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 isoflurane funnel fill vaporizer | General Anesthetic Services | n/a | |
| Stevens Tenotomy Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | |
| Mosquito classic delicate hemostatic forceps | Codman | 30-4472 | |
| Micro-retractor | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| Nonwoven gauze sponges | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” Small Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS Forceps - Standard Tips/Angled 45°/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge | Fine science tools | 15000-00 | |
| Microneedle holder | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 µm, TAP points | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5-ml Syringe | BD | 309646 | |
| Falcon tissue culture dish, 60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| Isoflurane, United States Pharmacopeia (USP) liquid for inhalation, 250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex injectable (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| Cefazolin for injection , USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| PVP scrub solution (povidone–iodine 7.5%) | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Phosphate Buffered Saline Without Calcium or Magnesium | LONZA | 17-516F | |
| Sirius Red | Sigma | 365548 | |
| Hematolxylin | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| Eosin | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 |
References
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