Summary
ブリス、木質化のダイナミクスを研究するためのデュアル ラベル プロトコルが開発されました。合成モノリグノールを使用して記者と SPAAC と CuAAC bioorthogonal の連続の組み合わせ反応、この方法論は、 planta のリグニンの生合成を制御する要因の詳細な分析への道の道を開くをクリックします。
Abstract
リグニンは地球上最も一般的な生体高分子の一つ、リグノ セルロース系バイオマスの主要なコンポーネントです。このフェノール樹脂は、開発と高等植物の生活に重要な構造、保護の役割を果たしています。強く木質化プロセス生体内で規定している複雑なメカニズムに影響を与える多くの植物由来製品産業の物価安定政策、科学界はまだそれらを解読するために行くには長い道のりを持っています。簡単な 3 ステップのワークフローでは、ここに記載したデュアル ラベリング プロトコルは、植物組織のゾーンを積極的に lignifying のバイオ イメージング研究をできます。最初のステップは、2 つの独立した化学記者リグニン H と G 単位に上昇を与える 2 つのネイティブ monolignols のサロゲートの代謝の定款で構成されます。高分子リグニンの成長に設立後各記者は、具体的に付いた bioorthogonal SPAAC/CuAAC クリック反応の連続の組み合わせで独自の蛍光プローブ。蛍光がリグニンと結合されて、このアプローチ共焦点蛍光顕微鏡による植物細胞壁のリグニンの 3色ローカリゼーション マップの生成をもたらすし、アクティブの有無で正確な空間情報を提供します植物組織、細胞と異なる細胞壁レイヤーの縮尺で木質化の機械。
Introduction
過去 20 年間の化学薬品レポーター戦略動態および非遺伝子にエンコードされた生体分子の機能を調査するための強力な 2 段階の方法論として浮上しています。1,2,3この戦略で小さな変調-化学薬品レポーター -興味の生体分子の合成アナログはまず代謝される生きている有機体の化学プローブ順 (e.g、蛍光の蛍光。共焦点顕微鏡イメージング) 共有、bioorthogonal クリックケミストリーによって組み込まれた記者にリンクされます。急速に、特にプローブが反応する必要があります任意の生体分子の生きているシステムに存在する不活性でありながら導入化学修飾。多くの方法でこのメソッドは、非常に特定のクリック化学およびそれにより代謝物または以前アクセスできなかった生体高分子を追跡する機会を提供するを使用して共通化反応技術の限界を克服します。生活システム4,5,6。
細菌と動物の細胞でこの強力なメソッドの急成長している人気にもかかわらず植物生物学での使用を記述するレポートは、意外にも少数ありまでの間7,8,9,10、します。 11,12。地球上最も一般的な生体高分子の一つ、リグノ セルロース系バイオマスの主成分リグニンの形成を研究する植物でこの戦略を適用することに特に興味を持っていた。13,14リグニンはフェノール樹脂開発と高等植物の生活保護構造の重要な役割を果たしています。
一般的に 3 つの 4 hydroxyphenylpropanoid 鎖から成り立っています: H (p-ヒドロキシフェニル)、G (グアヤシル) と S (結果) の単位はそれぞれ 3 つから派生した、'monolignols' (p- coumaryl、コニフェリルとシナピル アルコール)フェニルプロパノイド経路 (図 1) 細胞の細胞質で合成されました。Monolignols の酸化細胞壁にエクスポートされている後ペルオキシダーゼまたはリグニン ポリマー重合する純粋化学の根本的なカップリング反応を受けるその後 laccases によってラジカルにプロセスは木質化と呼ばれます。15,16リグニンに強く影響を与える植物由来の多くの産業の物価安定政策が、製品、科学界は、木質化を調節する複雑なメカニズムを解読する長い道のりをまだ持っています。
図 1: 植物細胞における木質化プロセス。Monolignols は細胞質でフェニルアラニンから生合成されます。Monolignols の酸化細胞壁にエクスポートされている後ペルオキシダーゼまたはリグニン ポリマー重合する純粋化学の根本的なカップリング反応を受けるその後 laccases によってラジカルにプロセスは木質化と呼ばれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
糖鎖解析 bioorthogonal 反応の利用に関する報告が多数、2,3,17他生体分子の種類にその応用例は少ない。リグニン バイオ イメージング用 bioorthogonal 化学の使用が飛松らによって開拓されたばかり8 シロイヌナズナG 単位、8,9概念実証デモを形作るそれリグニン ポリマーにアルコール サロゲート コニフェリル定款についての情報を提供するために、化学薬品レポーターの戦略は、このコンテキストで適用されます。CuAAC の使用もによって示された数ヶ月別のコニフェリル アルコール誘導体を使用して後でブコウスキーら。9ただし、リグニンも H と S のユニットを含むし、木質化のプロセスのより深い理解は、monolignols のすべてが、ポリマーに組み込まれる方法についてより多くの知識を必要とするどのような要因がその組成を制御します。このフィールドの新しい進歩は現在生きているシステムで同時に複数の化学記者を追跡するための効率的な手法の開発に依存します。主要な課題にもかかわらず、糖鎖に関するいくつかの記事は、近年18,19,の基礎を築いたが20,21,22, デュアル アプローチをラベル付けのままbioorthogonal 化学。再現可能な単一ラベル クリック プロトコルが開発するは難しい、互いに 2 つのタンデムで最適化を必要とするアプローチをラベリングし、デュアルの場合 2 つの独立した化学記者に互換性のある bioorthogonal 反応がさらに困難。この面を開拓したほとんどの例は、動物細胞の糖鎖を勉強するひずみ昇格アジ化物アルキン環 (SPAAC) とアルケン tetrazine 逆の電子式需要 (DAinv) のディールス ・ アルダー反応の組み合わせを しました。ただし、我々 は、DAinv 反応の bioorthogonality は、(電子不足と反応することができます電子豊富な置換シンナミル タイプ単量体から成っているリグニンの構造機能のおかげでこのアプリケーションの保証されないかもしれないと思ったジエン DAinv 反作用で使用された tetrazine のプローブなど)、これが非固有のラベルを生成する可能性があります。加えて、DAinv反応がかさばるし、可能性を高めることにより脂溶性にあることと同様、アクセス困難な総合的化学処理が必要ですが設立、輸送および/または化学物質の局在化の率生体内で記者があります。後者の側面は木質化を研究するためのクリック化学アプローチの場合特に関連すると考えて、我々 別の方向を選んだ、Bioorthogonal 結紮イメージング逐次戦略 (至福) を使用して開発、Strain-Promoted アジ化物アルキン環 (SPAAC) と銅触媒によるアジ化物アルキン環 (CuAAC) の組み合わせ体内。23
これら 2 つの反応は、実際に 2 つの主な bioorthogonal をクリックして日付に使用されている反応とリグニンのいくつかの例では特に画像最近出版されました。8,9デュアル ラベリング戦略を有効に 1 つモノリグノール記者アジ化部位と、他のターミナル アルキン i) 関連する生物学的構造にたがわず、ii) は非常に小さなサイズ (図 2の 2 つの化学ハンドルの使用).その結果、調査の下で生体分子の物理化学的性質のこれらの合成の修正の影響を最小限交通の面で不自然なモノリグノール基板間不一致を減らすと代謝率代謝設立段階。SPAAC と CuAAC の組み合わせが、一見非常に直感的なようだがデュアルのマーキング以外の糖鎖構造にこの作戦の最初のアプリケーションを使用してのみ、2 番目の例我々 の知識です。12,23
図 2: ブリス デュアル戦略をラベリングします。化学記者 HAZ GALKは、ネイティブの H と G monolignols の類似するタグ。彼らは最初外因性 (ステップ 1) を供給することにより、細胞壁の成長のリグニンの重合体に組み込まれます。Cyclooctyne とアジ化-機能集積化蛍光プローブが、順番に組み合わされて組み込まれた記者に bioorthogonal によってクリックケミストリー: SPAAC 反応 (ステップ 2) 特異性が高く Hアリゾナ州単位の CuAAC 反応 (が続きますステップ 3) 単位 GALK (ステップ 3) の特定であるようにない両方の記者の特定のローカリゼーション独立して同じサンプルの。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
我々 は、まず設計アジ化タグ モノリグノール記者HAZ ( p- coumaryl アルコールの代理人) とリグニン H 単位の前駆体を検証し、連動される至福のデュアル ラベリング戦略を考案、タグ付きのアルキンGALK9 (コニフェリル アルコールの代理人) とリグニン G 単位の前駆体を報告しました。この再現可能なプロトコルを開発し、亜麻のテストでは、経済的に重要な植物、リグニンにHAZとGALKのデュアル代謝定款はシーケンシャル SPAAC/CuAAC の前に達成した最初ラベリング。ここでは、タグHアリゾナ州単位最初具体的にはラベルが付いています経由でタグGALK の 2 番目の蛍光プローブの CuAAC を介した結紮に続いて cyclooctyne 修飾 fluorophore の SPAAC 結紮ユニット。このメソッドは、植物細胞壁内の木質化のプロセスのダイナミクスを調べるに使用された、応用生体内で茎の断面、別の植物種の苗と同様、茎の生活をすることができます。
Protocol
注: 液体と固体の ½ の MS メディアは補足の表 1に説明されているように事前準備されなければなりません。
1. 植物培養
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2 ヶ月歳の亜麻植物の文化
- ポッティングの堆肥を用いたプラスチックの鉢の亜麻 (アマl.) の種をまきます。
- 成長日長 16 h/8 h と 22 ° C で培養室内で亜麻デイ/ナイト。
- 1 ヶ月後の垂直方向のサポートが付いている植物を装備し、2 ヶ月齢になるまでに成長します。
-
2 週齢亜麻苗の文化
- チーズの布の部分に 12 の亜麻の種子をラップし、バンドルを作るためのゴムバンドで固定します。
注: は、層流ヒューム フードの下で無菌条件下で次の手順を実行します。 - 以前オートクレーブ 250 mL の瓶に種子バンドルを配置します。
- 70% の 70 mL を加えてエタノール ボトルと優しく 1 分間かき混ぜます。
- ボトルにバンドルを残しながらデカンテーションによって、江藤を慎重に取り外します。
- 2% ナトリウム次亜塩素酸を 100 mL を加え、10 分間ゆっくりかき混ぜます。
- ボトルにバンドルを残しながらデカンテーションによってナトリウム次亜塩素酸のソリューションを削除します。
- 1.2.5-1.2.6 の手順を繰り返します。
- 滅菌超純水水 100 mL を加え、1 分間かき混ぜます。
- (5、10、15 分) 各リンスのすすぎ時間を増やすことに 3 回 1.2.8 のステップを繰り返します。
- 固体 ½ MS 培地を暖かい、2 cm の高さに滅菌プラント カルチャー ボックスにそれを注ぎ、凝固までそれはクールダウンをしましょう。
- 繊細な滅菌鉗子を用いた固体中の各シードを配置します。
- 滅菌ボックスを閉じます。
- 日長 16 h/8 h の 22 ° C の成長チャンバー ボックスに転送昼/夜 2 週間亜麻の苗を育てると。
- チーズの布の部分に 12 の亜麻の種子をラップし、バンドルを作るためのゴムバンドで固定します。
2. 代謝化学記者定款
注: 3 つの実験モデルを以下に示します: 幹断面、ii) 全体の茎と三苗の i) 代謝ラベリングします。各プロトコルは 1 つの生物学的複製し量は必要な生物的複製の数に適応することができます.このソリューションは、実験前に表 2に説明されているように作られている株価ソリューションから用意しています。溶液は-20 ° C で数ヶ月保存できます。HAZ: GALKまたはH:G比率は、すべてカスタムメイドの実験的デザインに合うように調整できます。
- 2 ヶ月歳の亜麻の茎断面に化学薬品レポーター設立
- GALKの 10 μ M と 10 μ M の液体滅菌 ½ MS 培地でHアリゾナ州を含む 300 μ L 化学レポーター ソリューションを準備します。
- 渦HAZ/GALKソリューションし、マイクロ ピペットで 48 ウェル プレートの 1 つの井戸に転送。
- 液体滅菌 ½ MS 培地でHの 10 μ M と 10 μ M のGを含む 300 μ L 否定的な制御ソリューションを準備します。
- 渦H/Gソリューションと同じ 48 ウェル プレートの 2 番目の井戸に転送します。
- 新しいかみそりの刃を使用して土壌レベルより 10 cm 上で 2 ヶ月歳亜麻植物の茎をカットします。
- 繊細なかみそりの刃 (約 150-250 μ m 厚) を使用して茎の 50 のフリーハンド横断面を準備します。
- すぐに時計ガラスの液体滅菌 ½ MS 培地にクロス セクションを配置します。
- 目視で確認、そのまま全体 2 次元断面を選択し、 Hアリゾナ州でもいっぱいで、それらの 10 をランダムに配布/GALKソリューション。
- Hもいっぱいの繰り返し手順 2.1.8/Gソリューション (マイナス コントロール) として。
- ステップ 2.1.8 (共焦点顕微鏡画像の後続のデータ処理中に蛍光のベースラインを調整するバック グラウンド コントロール) として ½ MS 培地の 300 μ L でいっぱいよく第三者に対して繰り返します。
- 20 h 20 ° C で成長槽内連続光でプレートを孵化させなさい。
- マイクロ ピペットの各ウェルにこのソリューションを削除します。
- ½ MS 培地の 500 μ L を各ウェルに追加、10 分間穏やかにかき混ぜ、リンス液をマイクロ ピペットでこれを削除します。4 回繰り返すし、すぐにラベルの至福 (セクション 3) に進みます。
- 2 ヶ月歳の亜麻全体茎に化学薬品レポーター設立
- GALKの 10 μ M と 10 μ M の液体滅菌 ½ MS 培地でHアリゾナ州を含む 5 mL 化学レポーター ソリューションを準備します。
- 渦HAZ/高さ 20 cm ガラス テストにはピペットでチューブGALKソリューションと転送。
- 液体滅菌 ½ MS 培地でHの 10 μ M と 10 μ M のGを含む 5 mL 否定的な制御ソリューションを準備します。
- 渦H/Gソリューションと転送高さ 20 cm ガラス テストするチューブします。
- (共焦点顕微鏡画像の後続のデータ処理中に蛍光のベースラインを調整するバック グラウンド コントロール) として ½ MS 培地 5 mL を含む第 3 ガラスの試験管を準備します。
- 新しいかみそりの刃を使用して土壌レベルより 10 cm 上で 2 ヶ月歳亜麻植物の茎をカットします。根と茎の下の部分を破棄し、植物の茎の上部に、次の手順に進みます。
- Hアリゾナ州を含む管内全体カット茎の基部を浸す/GALKソリューション。乾燥からそれを防ぐためにインキュベーション ソリューションにおける根系を除去した直後の茎を配置します。
注: 若い/古い植物や他の種にメソッドを適用すると場合、モノリグノール ソリューションのボリュームが必要に応じて調整するサイズ/時代の植物の茎の直径。 - 幹をまっすぐに保つために垂直方向のサポートに接続します。
- パラフィルム、溶液の蒸発を避けるためにガラス管をシールします。
- H否定的な制御サンプル手順 2.2.6-2.2.9 を繰り返す/Gソリューション。
- ½ MS 培地を含む蛍光バック グラウンド コントロール サンプルの 2.2.6-2.2.9 の手順を繰り返します。
- ネオンの光を使用して連続光で 20 h のそれぞれの幹を孵化させなさい。
- 代謝定款 20 時間後HAZ培養幹を削除/GALKソリューション、½ の MS 培地でそれをすすいでください。
- カットしかみそりの刃を使用してください幹の 1 cm 下を破棄し、残りの茎の根元から 1 cm の高いシリンダーを準備しています。
- 慎重にこのシリンダーから 20 フリーハンド横断面 (約 150-250 μ m 厚) を準備し、時計ガラスの ½ の MS 培地でいっぱいですぐにそれらを配置します。
- 48 ウェル プレートのウェル 1 個で 500 μ L の ½ の MS 培地を置きます。
- 目視で確認、そのまま全体 2 次元断面を選択し、½ MS ソリューションでいっぱいよくそれらの 10 をランダムに配布します。
- 2.2.13-2.2.17 H/Gソリューションと培養陰性対照幹の手順を繰り返します。
- 蛍光バック グラウンド コントロール幹の手順 2.2.13-2.2.17 ½ MS 培地で培養を繰り返します。
- マイクロ ピペットの各ウェルにソリューションを慎重に取り外します。
- ½ MS 培地の 500 μ L を各ウェルに追加、10 分間穏やかにかき混ぜ、リンス液をマイクロ ピペットでこれを削除します。4 回繰り返すし、すぐにラベルの至福 (セクション 3) に進みます。
- 2 週齢亜麻苗に化学薬品レポーター設立
注: 次の手順は、すべて実施無菌条件の下で。- GALKの 10 μ M と 10 μ M の液体滅菌 ½ MS 培地でHアリゾナ州を含む 2 mL 化学レポーター ソリューションを準備します。
- 渦HAZ/ピペットとチューブに 20 cm の高さのガラスのテストGALKソリューションと転送。
- 液体滅菌 ½ MS 培地でHの 10 μ M と 10 μ M のGを含む 2 mL 否定的な制御ソリューションを準備します。
- 渦H/Gソリューションと転送して、20 cm の高さのガラスのテスト チューブします。
- (共焦点顕微鏡画像の後続のデータ処理中に蛍光のベースラインを調整するバック グラウンド コントロール) として ½ MS 培地 2 mL を含む第 3 高さ 20 cm ガラス試験管を準備します。
- 繊細な長いピンセットのペアを使用して固体の ½ の MS 培地から 2 週齢亜麻苗を削除 (セクション 1.2. の上)。
- 優しくH のアリゾナ州を含む管に苗を転送/GALKソリューション、そのルーツがソリューションに没頭していることを確保します。
- 蒸発を避けるためにプラスチック製のキャップとガラス管を閉じます。
- H を持つ否定的な制御管の手順 2.3.6-2.3.8 を繰り返す/G ソリューション。
- ½ MS 培地を含む蛍光バック グラウンド コントロール チューブの 2.3.6-2.3.8 の手順を繰り返します。
- 各苗成長室 20 ° C で 20 時間の連続光を孵化させなさい
- 繊細なHAZ培養苗を削除/GALKソリューション、½ の MS 培地でそれをすすいでください。
- 繊細な胚軸部 20 フリーハンド断面 (approximatively 150 250 μ m 厚) を準備します。
- 48 ウェル プレートのウェル 1 個で 500 μ L の ½ の MS 培地を置きます。
- 目視で確認、そのまま全体 2 次元断面を選択し、½ MS ソリューションでいっぱいよくそれらの 10 をランダムに配布します。
- 2.3.12-2.3.15 H/Gソリューションと培養陰性対照の苗を手順を繰り返します。
- 蛍光バック グラウンド コントロール苗の手順 2.3.12-2.3.15 ½ MS 培地で培養を繰り返します。
- マイクロ ピペットの各ウェルにソリューションを慎重に取り外します。
- ½ MS 培地の 500 μ L を各ウェルに追加、10 分間穏やかにかき混ぜ、リンス液をマイクロ ピペットでこれを削除します。4 回繰り返すし、すぐにラベルの至福 (セクション 3) に進みます。
3 SPAAC と CuAAC による工場断面試料の二重蛍光標識
注: 至福の分類のプロトコルは、すべて 3 実験モデル (セクション 2) の同じです。
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ひずみ昇格アジ化物アルキンの環化付加反応 (SPAAC) のラベル付け
- DBCO ペグ4-5 5 μ M を含む SPAAC 溶液の 1 mL を準備/6-液体滅菌 ½ MS 培地で carboxyrhodamine 110。渦ソリューション暗闇の中に保管してください。
- 最終洗浄後 [2.1.13、2.2.21 または選ばれた実験的なデザインによって 2.3.19] 代謝結合のプロトコルの手順は ½ MS 培地を削除し、マイクロ ピペットでウェルあたり SPAAC ソリューションの 300 μ L を追加します。
- アルミ箔でカバーやボックスに置くことで、光から 48 ウェル プレートをシールドします。
- 周囲温度で暗闇の中 1 h の機械的シェーカーでプレートを優しくかき混ぜます。
-
銅触媒を用いたアジ化物アルキンの環化付加反応 (CuAAC) のラベル付け
- 暗闇の中でプレートを維持しながらも 4 回 2.1.13 のステップで説明されている各を洗ってください。
- アスコルビン酸ナトリウム 2.5 mM, 0.5 mM CuSO4 , 5 耽羅ペグ3の 5 μ M の CuAAC の溶液 1 mL を準備-液体滅菌 ½ MS 培地でアジ。渦ソリューション暗闇の中に保管してください。
注: この CuAAC ソリューションたて使用する前に準備する必要があります、4 ° C で数日以上を格納できません。 - 各ウェルに ½ MS 培地を取り外して直接マイクロ ピペットを使用してあたり CuAAC ソリューションの 300 μ L を追加します。
- 周囲温度で暗闇の中 1 h の機械的シェーカーでプレートを優しくかき混ぜます。
- マイクロ ピペットを使用して、CuAAC ソリューションを削除します。
- マイクロ ピペットを使用して、½ MS を 500 μ l 添加、10 分間暗闇の中で攪拌し、この洗浄液を削除します。2 回繰り返します。
- 7:3 のメタノール/水溶液を 500 μ l 添加、1 h の暗闇の中で攪拌し、ソリューションを削除
注意: メタノールは皮膚への接触や吸入によって有毒である、人間の発癌物質として指定されています。その利用には、化学の発煙のフードと手袋が必要です。 - ½ MS を 500 μ l 添加、暗闇のなかで 10 分攪拌ソリューションを削除します。4 回繰り返します。
4. 顕微鏡でサンプルの取り付けスライドします。
- ガラス顕微鏡スライドでメディアをマウントの場所 5 が値下がりしました。
- 慎重に各HAZを沈殿物/GALKスライドの断面をタグ付き。
- スライドの対向する二辺にマニキュアを適用します。
- 観察のスライドをカバーします。空気の泡を避けるために注意してください。
- 紙タオルを使用してメディアを余分なマウントを削除します。
- 4 四方をマニキュアでサンプルをシールします。ワニス乾燥室温 (約 30 分) で爪をしましょう。
- 否定的な制御/G の H断面について、手順 4.1 4.6。
- 蛍光バック グラウンド コントロール断面について、手順 4.1 4.6。
- 共焦点顕微鏡観察まで、暗闇の中で 4 ° C でスライドを保存します。
注: 準備の質によって数ヶ月に数週間の準備されたスライドを格納できます。新しい観察をストレージした場合は、サンプルが乾燥していないことを確認します。
5. 画像の取得蛍光共焦点顕微鏡
- 製造元の指示に従って正しい順序で共焦点顕微鏡システムの必要な単位をすべてオンにします。
- 最大開口を希望する目標を選択し、励起と放射の波長を合わせられる (例えば、obj. 60 x、n. a. 1.2。蛍光チャネル: λex 405 nm、λem 450 nm 25;SPAAC Hアリゾナ州チャネル: λex 488 nm、λem 525 nm 25;CuAAC GALKチャネル: λex 561 nm、λem 595 nm 25;シーケンシャル モード)。
- ソフトウェア (12 ビットまたは 16 ビット必要、ナイキスト基準に適応したピクセル サイズ) の画像の生成のための目的のパラメーターを選択します。
- 顕微鏡ステージ上HAZ/GALKスライドを置き、対物レンズの下でサンプルを配置します。
- 観察、植物組織の目的の地域を見つけます。
-
高品質二重標識 HAZ/G の共焦点画像を取得ALKサンプル。
- Z 軸には、大部分の蛍光灯の平面を選択します。
- ゲインを調整 (蛍光、 HAZとGALK) 各チャネルの全体灰色レベル範囲に沿って最適な信号の分配を達成するためにオフセットとレーザーの力。同じパラメーターは、すべての次の買収の適用する必要があります。
- 選択した画像の取得を起動し、ファイルを保存します。サンプルの関連する各地域を繰り返します。
注: 3 D Z スタック再構成必要に応じて取得することがも。
- 同じ設定を使用すると、自発レベル (蛍光バック グラウンド コントロールのセクション 2 の説明に従って) を決定する ½ MS 培養のみタグなしのサンプルの画像を取得します。
- 同じ設定を使用すると、ネイティブ monolignols H/Gのサンプルに非特異蛍光粘着を決定すると培養陰性対照サンプルの画像を取得します。
- H/G陰性対照画像でHAZ/GALK画像引き算バック グラウンド蛍光信号を取得した画像にデータ処理を適用します。
Representative Results
クリックケミストリー合成モノリグノール類縁体および bioorthogonal を含む提示至福のプロトコルを使用して、それは生きている植物の木質化の過程のダイナミクスを可視化することが可能です。リグニンの確立された技術とは異なり組織化学的染色などタバコプロトプ蛍光)、この 'ダブルクリック' プロトコルのみ可視化対象リグニン生成・ デ ・ ノボ代謝結合の間ステップし、共焦点蛍光顕微鏡観察 (図 3) によるトリプル チャネル細胞イメージングとサンプルの既存のリグニンからそれを区別します。Hアリゾナ州-ユニットは、DBCO ペグ4-5 の励起・発光波長を使用して検出されます/6-アジ化機能にクリックしては特に carboxyrhodamine 110 SPAAC 段階 (λex HAZ分子を組み込まれて501 の nm/λem 526 nm、緑チャンネル) に対しGALK- G の法人端末アルキン タグにクリックしては特に azidefluor 545 プローブの特性の波長で単位が検出された同様にCuAAC 段階 (λex 546 nm/λem 565 nm、赤色チャネル)アルク3 番目のチャネルが 405 でその本質的な蛍光を使用して検出された既存のリグニンに対応 nm (青色チャネル)。このアプローチはさまざまな組織器官 (図 3 a の間木質化のアクティブな機械の存在で正確な空間情報を提供する植物細胞壁のリグニンの 3色ローカリゼーション マップ有無の世代になります)、同じ組織 (図 3B-C) 内と同じセル (図 3 D) の別の壁層内の別のセル型の間。つまり、この方法により、私たちを強調表示し、具体的には 'アクティブ' 木質化サイト (HAZとGALKチャンネル) をローカライズするリグニンが以前に結成のゾーンからそれらを区別します。植物開発 (蛍光チャネル) の段階です。さらに、蛍光と比較した場合、技術の感度が大幅に強化、新鮮な合成リグニンのはるかに小さい量がすることができます (図 3 b) を検出します。
図 3: 亜麻の茎に組み込まれたモノリグノール化学記者のイメージングします。(A) 亜麻の茎、再構成画像の手作りの横断セクションの半分。木部の区別の最初の層の (B) のクローズ アップ。左右パネル: リグニン蛍光 (青、405 nm)、中央のパネル: リグニン自家蛍光特性 (青) と HAZ蛍光をマージ (緑、526 nm)、右側のパネルのチャンネル: リグニン自家蛍光特性 (青) と GALK をマージ蛍光 (赤色、565 nm) チャンネル。矢印は、蛍光と比較して至福の感度を示すひこばえから最初のラベル付きセル壁を示します。(C) ラベリング異なる細胞タイプの二次木部および (D) は同じ細胞壁のさまざまな層のラベルのバリエーションを示す二次木部細胞にクローズ アップ。左右パネル: リグニン自家蛍光特性 (青) と HAZ蛍光をマージ (緑、526 nm)、中央のパネルのチャンネル: リグニン自家蛍光特性 (青) と GALK蛍光をマージ (赤、565 nm) チャンネル、右パネル: リグニン自家蛍光特性 (青)、HAZ (緑) と GALK (赤) 蛍光チャネルを結合します。HAZと GALKの共局在が黄色で描かれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ここで紹介した至福方法や飛松らによって、以前公開されて単一ラベル プロシージャなど化学薬品レポーター戦略8したがって、免疫組織化学的染色を実装する非常にシンプルでありながらなど以前はアクセス方法よりもはるかに細かい研究ができます。たとえば、図 4に示していますHアリゾナ州の信号強度/亜麻の二次木部の繊維仮道管/血管 (フィート)GALK定款は、ひこばえから最初のいくつかの細胞壁が非常に高く、古い細胞が徐々 に減少します。このプロファイルは、蛍光とは逆、その最大の木質化が非常に急速に形成層から最初の 2 ~ 3 FT 細胞層到達を示します。対照的に、レイ (R) 細胞がHアリゾナ州としての開発の多くの後の段階に木質化を継続する表示/GALK定款は力強さ、ひこばえからすべての細胞の壁により一定。驚くべきこれらの細胞型の発達プログラムで関連付けられている違いと異なる生物学的役割を持っているので FT と R のセルタイプが木質化の対照的なダイナミクスを表示ことはありません。FTs は確かに細長いチューブが成熟し、急速に死ぬ、R の狭い行セルに対し機械的なサポートと水とミネラルの鉛直輸送の両方で重要な役割を果たす木の厚さの壁を残して死んでセル構成、木部光線はせずに木の厚さの壁を機能的な成熟した状態で生きています。
図 4: 亜麻の木部細胞特異モノリグノール記者設立。亜麻の茎からフリーハンド断面の部分の明視野共焦点顕微鏡ビュー (A)。ピンク (レイ柔細胞、R) と黄色 (繊維仮道管細胞の FT) 矢印髄に向かって形成ゾーンからのベクトルし、405 でリグニン蛍光のスキャンを示して nm (B)、526 で HAZ蛍光 nm (C) と GALK 565 で蛍光 nm (D)。二次木部の (E) 表示します。左右パネル: リグニン蛍光 (青)、HAZ (緑) と GALK (赤) 蛍光チャネルを結合します。HAZと GALKの共局在が黄色で描かれています。右側のパネル: 亜麻の茎の二次木部構造の模式図。V、容器;FT 繊維仮道管;R、レイ柔細胞。この図は、ライオンらから変更されています。23この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
さらに、する H と G-ユニット ブリス プロトコルで 2 つの bioorthogonal 反応に対応する 2 つの異なる化学記者の使用は、取得するより多くの量的な結果をことができます。ブリス モノリグノールの制御に関する様々 な条件で設立比率に追加の洞察力を提供できるとらえどころのない木質化プロセスの解読に貢献できると戦略をラベリングを多重化します。リグニンの H, G, S monolignols の相対的な割合が実際に種、組織、年齢または植物の環境条件によると非常に変数、この組成を調節する複雑なメカニズムが理解まだ完全ではないです。デュアル ラベリング技術は、リグニンの組成を調整するパラメーターのいくつかの調査の強力な方法を表します。たとえば、 HAZを変: GブリスとALK比二次木部組織でリグニン組成がモノリグノール可用性ではなく細胞壁内に直接依存して実証することができましたラッカーゼ ・ ペルオキシダーゼの特異性 (図 5)。
図 5: HAZと GALKの異なるパーセント比で亜麻の茎切片の培養の効果。HAZ: GALK比 % 上記各欄の数字。トップ: マージ HAZと GALKのチャンネルです。下: ヒストグラム Hアリゾナ州と異なる % 比 GALKの平均蛍光強度を示します。値は灰色のレベル ± SD. スケールで平均蛍光強度の平均値として表されますバー = 100 μ m. ライオンらからこの図が変更されています。23この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
亜麻は、繊維製品、高級紙や環境に優しい複合材料の製造に使用されるその靭皮繊維 (BF) の栽培されています。その産業の物価安定政策の重要な側面は、非常に厚い S2/G 二次層19,24によって特徴付けられる細胞壁のリグニンの非常に低いレベルが含まれていることです。ブリスは、同じ細胞壁のさまざまな層の木質化のダイナミクスの違いを強調表示できます。図 6A HAZとGALK記者定款がセルのコーナーとすべてではなくいくつかの靭皮繊維の中層/一次細胞壁に限定されることを示しています。モノリグノール化学記者が外因場合でも厚い靱皮繊維二次細胞壁レイヤーにおける木質化の合計不在供給の hypolignified 状態に適した分子環境の欠如から生じることを明らかに酵素によって酸化成長ポリマー鎖に monolignols の設立と、それがないモノリグノール生合成遺伝子の転写調節のためにだけ前述25を報告しました。この観測も事実とよく相関するその亜麻のペルオキシダーゼ遺伝子が調整される木の靭皮繊維26所有している亜麻化学lbf1変異体の外側の茎組織。
図 6: ブリス細胞壁構造やレイヤーに固有の相違点を強調表示します。(A) 左側のパネル: 亜麻の茎部明視野イメージ。マル印の繊維束。右側のパネル: 靱皮繊維上にクローズ アップ。HAZと GALKチャンネル (と明るいフィールドなし) を合併、木質がセルのコーナーに限定を示す (
) といくつかの靭皮繊維の中層/一次細胞壁。BF、靱皮繊維;パー、柔細胞;M の中層。P は、一次電池の壁;S1、二次細胞壁の最初の層二次細胞壁の S2/G、二次層/ゼラチン層。(B) の 2D スライスと共焦点 z スタックの 3次元再構成亜麻根の内皮の領域を拡大できます。カスパリー () のみ蛍光を表示し、HAZまたは GALKは組み込まれていません。関連付けられている fluorogram GALK/Hアリゾナ州反相関を示しています: 高蛍光グリーンは赤い信号 (皮質) その逆 (内皮) に関連付けられています。内鞘 (P)、内皮 (E)、Cortex (C)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
最後に、この 2 色の方法論は、様々 な発達段階や茎以外の植物器官で細胞壁部分の木質化の状態も貴重な情報を提供できます。たとえば、亜麻根の内皮は、開発の初期段階中に放射状および横断細胞壁のカスパリー バンドの存在によって特徴付けられます。疎水性高分子、スベリンやリグニン、作られてのこのバンド水と溶質、アポプラストを通じて受動的入力からルートによってとらを防止し、強制的にそれらに寄与する symplastic 経路を介して細胞膜を通過する、植物の根のカチオン容量。亜麻根に適用され、当社の戦略は HAZと GALKがカスパリー バンドが (図 6 b) 欠席は放射状の壁の部分のように内皮細胞同様の接線方向の壁に組み込まれていることを示した。ただし、定款モノリグノール記者カスパリー バンド自体の合計不在だ成熟したこの発達段階では、他の壁がまださらに生体高分子蒸着のサイト間を示します。Z スタックの再構成の 3D ビューは、明らかに光にカスパリー バンドをもたらします。興味深いことに、いくつかの皮質細胞、内皮細胞に隣接する壁はまた HAZを優先的に組み込むことができる証明 (リグニン/スベリン亜麻根野の存在を示すことにより) ない GALKが。共局在解析は、HAZと GALK、これらの 2 つの隣接するセルのタイプに特定の細胞壁構造/酵素機械の存在を示唆している間反相関を示した。
補足表 1: 固体の ½ の MS 培地の準備このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足テーブル 2: 化学薬品レポーターの貯蔵液の準備このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
前述したように、本稿で提示されたデュアル ラベル至福プロトコルは12,23体内SPAAC/CuAAC の組み合わせの最初の例の 1 つです。2 つが化学標識反応が行われるをクリックして順序を尊重することは非常に重要な各ステップは徹底的に最適化および検証され、(すなわち、SPAAC、順 CuAAC)。すべてクロス コントロールを示した、各付け、特定ブリス プロトコルが適用23 : まず化学高選択的につながる SPAAC ステップの実施によるHAZアジ化機能のラベル、高速な反応速度で [3 + 2] 環化付加反応による cyclooctyne 機能の fluorophore。Hアリゾナ州単位にタグは、アジ化蛍光 545 プローブとの反応によるトリアゾール リンクを生成するGALK末端アルキンの銅 (i) 触媒による活性化を施行した CuAAC ステップは実施できます。対照的に、逆の順序で (すなわち、CuAAC、順 SPAAC) それGALKとHアリゾナ州単位につながるとは使用しないでください fluorophore 結紮と競合し、信号の劇的な損失を誘発するクロス カップリング.また、非特定の染色を避けるために中間洗浄のステップの必要性を強調することが重要です。
我々 は本手法を様々 な生物学的実験デザインを適用できることを示しています。至福の分類のプロトコルは最初、以前カット、インキュベートを準備ができてクリック monolignols 亜麻の茎 (約 150-250 μ m 厚) のフリーハンドの断面に適用。このデザインには、(インキュベーション ボリュームが減少)、化学薬品レポーターの必要数量を最小化して統計をレプリケートの生産を容易にする利点がありますが、それはない、厳密に言えば、体内システムといくつかの場合、木質化の実時空間的ダイナミクスのすべての側面を表さない場合があります。2 番目の実験的デザインしたがって松や銀杏の27の radiolabeled monolignols 定款を研究に使用していたメソッドにブリス プロトコルを適応しました。このアプローチで根や植物の茎を物理的に分離、全体の茎の基部は '花花瓶' アプローチと呼ばれることがあります何でこのソリューションの培養です。茎の目的 (インキュベーション) の時間を残し後、断面、カットと実行ブリス プロトコル。これは局在パターンは本質的と同一断面の (ii) (i) 変更された monolignols 生活幹を通して運ばれ、成長する細胞壁のリグニン ポリマーに組み込まれていると表示することができましたアプローチ。このタイプの実験の実際の生きた植物で行われているメリットがあります/生きているセル長い実験とより詳細な研究のアプローチが化学レポーターの大きい量が必要です。最後に、ブリス プロトコルは、亜麻の植物苗、実際の生活化学記者必要がありますに根を通して吸収される、幹を運ばれる前にプラント モデルを表すとも使われました。このモデルには実習では、生きた植物で行われているの明確な利点は若い実生植物に制限され適していません本当に実用的な理由から (長い培養時間、高架より古い植物の木質化の動力学を調査するため化学記者の量)。それにもかかわらず、これらの 3 つの実験デザインは相補、実用的な側面と答えられる生物学的問題の種類によって生物学的意義に関して、賛否があるすべて。
亜麻の木質化のダイナミクスを研究するために開発、我々 のプロトコルは小回り、生物学的実験デザインの面でだけでなく、他への応用の観点からも植物の種や臓器・組織。例えば、ブリスは、シロイヌナズナや様々 な遺伝子ノックアウトまたはノックダウン変異体を用いた研究により適しているポプラ属に簡単に転送できます。原則として、我々 のアプローチとデュアル ラベル研究も拡張できます他の生体分子への 2 植物細胞壁ポリマー - すべての 3 つの主な monolignols または彼らの代謝前駆体のさまざまなを含む個別変更された前駆体を用いた多糖類マトリックスを構成する単糖類。創業以来、bioorthogonal 化学確かに主に開発した糖/多糖類代謝糖鎖工学 (萌)4,5,17,28を調査するには驚くほどしかありませんでしたが、植物生物学に非常にいくつかのアプリケーション、これまで7,8,9,10、11,12。反応の互換性の面では、リグニンの研究は確かに両方の化学の記者が同じ網状高分子に組み込まれている解決するために複雑なケースだった。ラベルのないHアリゾナ州- の可能性GALK架橋形成されたGALKと 3 D 内Hアリゾナ州単位の空間的近接のために克服するために主要な問題リグニン23、ないあるかもしれない 2 つの化学記者が組み込まれていない場合同じ種類の生体高分子や特定のセルの同じ空間領域制限の構造。
広い範囲で至福の方法論はアジとターミナル アルキン タグをそれぞれベアリング 2 つの異なる化学記者を使用して細菌や動物モデルの任意の 2 色蛍光イメージング研究に本質的に適用でした。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
研究連合 FRABio および TisBio イメージング プラットフォームにお世話になっております (大リール、CNRS、FR 3688、FRABio、BiochimieStructurale et Fonctionnelle デ群集 Biomoléculaires) これを達成するために、技術的な環境を提供するため作業。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
| (E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
| 2% sodium hypochlorite | |||
| 20 cm high glass tube | |||
| 250 mL Schott glass bottle | |||
| 48-well Plate | |||
| 5/6-TAMRA-PEG3-Azide | Jena Bioscience | CLK-AZ109-1 | |
| Aluminium foil | |||
| Cheese cloth | |||
| Compost containing clay | |||
| Coniferyl alcohol (G) | Sigma Aldrich | MFCD00002922 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | |||
| DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 | Jena Bioscience | CLK-A127-1 | |
| Milli-Q Ultrapure water | |||
| Eppendorf 1,5 mL | |||
| EtOH | |||
| Flax seeds (L. usitatissimum L.) | |||
| Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Glass coverslip | |||
| Glass microscope slide | |||
| Growth chamber | CLF-Plant Climatics | For 2-week-old plants culture | |
| Growth chamber | Angelantoni Life Sciences | For 2-month-old plants culture | |
| Magenta plant culture box | For 2-week-old seedling culture | ||
| Methanol | Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood | ||
| Micropipette | |||
| Nail polish | |||
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | ||
| Orbital shaker | |||
| Parafilm | |||
| p-Coumaryl alcohol (H) | Carbosynth | FC145653 | |
| Plastic cap | |||
| Plastic pipette | |||
| Plastic pot | For 2-month-old plants culture | ||
| Razor blade | |||
| Rubber band | |||
| Sodium Ascorbate | |||
| Sterile clamp | |||
| Vertical support | |||
| Vortex | |||
| Reagents for liquid and solid ½ MS medium | |||
| KH2PO4 | |||
| KNO3 | |||
| NH4NO3 | |||
| MgSO4.7H2O | |||
| CaCl2.2H2O | |||
| MnSO4.H2O | |||
| ZnSO4.7H2O | |||
| H3BO3 | |||
| KI | |||
| Na2MoO4.2H2O | |||
| CuSO4.5H2O | |||
| CoCl2.6H2O | |||
| Na2EDTA.2H2O | |||
| FeSO4.7H2O | |||
| Thiamine.HCl | |||
| Pyridoxine.HCl | |||
| Glycine | |||
| Nicotinic acid | |||
| Myo-inositol | |||
| Saccharose | |||
| MES hydrate | |||
| Agar |
References
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