Summary
وقد وضعت النعيم، بروتوكول وضع العلامات مزدوجة لدراسة ديناميات ليجنيفيكيشن،. استخدام مونوليجنول الاصطناعية الصحفيين ومجموعة متسلسلة من سباك وكواك بيورثوجونال انقر فوق ردود الفعل، وهذه المنهجية يمهد الطريق إلى التحليل المتعمق للعوامل التي تنظم في نشوء حيوي من ليجنينس في بﻻنتا.
Abstract
اللجنين هو أحد البوليمرات البيولوجية الأكثر شيوعاً على هذا الكوكب وعنصرا رئيسيا من الكتلة الحيوية الليجنوسليولوزيه. هذا البوليمر الفينولية تلعب دوراً حيويا في الهيكلية والحمائية في التنمية وفي الحياة من النباتات العليا. على الرغم من أن الآليات المعقدة التي تنظم ليجنيفيكيشن العمليات في فيفو بشدة تأثير تثمين الصناعية للعديد من المنتجات المشتقة من النباتات، المجتمع العلمي لا يزال أمامها طريق طويل للذهاب إلى فك لهم. في سير عمل ثلاث خطوات بسيطة، تمكن بروتوكول وضع العلامات المزدوجة المقدمة في هذه الوثيقة الدراسات بيويماجينج من ليجنيفيينج بنشاط مناطق الأنسجة النباتية. الخطوة الأولى تتمثل في إدراج الأيضية لاثنين من المستقلين الصحفيين الكيميائية، الأمهات البديلات مونوليجنولس الأصلية اثنين التي تؤدي إلى اللجنين وحدات ح وز. بعد دمج في تزايد البوليمرات اللجنين، ثم يسمى كل مراسل على وجه التحديد مع تحقيقاتها الفلورسنت عبر مجموعة متسلسلة من سباك/كواك بيورثوجونال انقر فوق ردود الفعل. جنبا إلى جنب مع أوتوفلوريسسينسي اللجنين، هذا النهج يؤدي إلى توليد خرائط التعريب ألوان من خشبين داخل جدران الخلايا النباتية بالأسفار [كنفوكل] مجهرية ويوفر معلومات مكانية دقيقة على وجود أو عدم وجود نشط ليجنيفيكيشن إليه بمقياس الأنسجة النباتية وخلايا وطبقات مختلفة من جدار الخلية.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين، برزت استراتيجية مراسل الكيميائية كمنهجية خطوتين قوية للتحقيق في ديناميات ووظائف الجزيئات الحيوية المشفرة غير وراثيا. 1 , 2 , 3 في هذه الاستراتيجية تناظرية اصطناعية من بيوموليكولي للفائدة مع تعديل صغير – مراسل الكيميائية – يتم أولاً استقلاب بالحي، ومن ثم تحقيق الكيميائي (مثلاً.، فلوروفوري للأسفار تصوير مجهرية [كنفوكل]) يرتبط تساهميا المراسل إدراجها عن طريق الكيمياء انقر فوق بيورثوجونال. أن التحقيق يجب أن تستجيب بسرعة وعلى وجه التحديد مع التعديل الكيميائي أدخلت حين خاملة لأي من الجزيئات الحيوية الموجودة في نظام المعيشة. من نواح عديدة، وهذا الأسلوب يتغلب على القيود المفروضة على تقنيات بيوكونجوجيشن المشتركة من خلال استخدام ليجيشنز الكيمياء انقر محددة للغاية وبالتالي توفير الفرصة لتعقب نواتج الأيض أو بيوماكروموليكوليس التي كانت سابقا غير قابل للوصول في المعيشة نظم4،،من56.
وعلى الرغم من شعبية هذا الأسلوب قوية في الخلايا البكتيرية والحيوانية سريعة النمو، تقارير تصف استخدامه في علم الأحياء النباتية القليلة من المدهش والآن بين7،،من8109،، 11،12. كنا اهتماما خاصا بتطبيق هذه الاستراتيجية في المصانع لدراسة تكوين اللجنين، أحد البوليمرات البيولوجية الأكثر شيوعاً على هذا الكوكب وعنصرا رئيسيا من الكتلة الحيوية الليجنوسليولوزيه. 13 , 14 اللجنين هو بوليمر الفينولية التي تلعب دوراً حيويا في الهيكلية والحمائية في التنمية وفي الحياة من النباتات العليا.
وهو عموما يتألف من ثلاثة 4-هيدروكسيفينيلبروبانويد مويتيس: ح (فهيدروكسيفينيل), G (جاياسيل) ووحدات S (سيرينجيل) على التوالي المستمدة من ثلاثة 'مونوليجنولس' (فكوماريل، كونيفيريل، وسينابيل الكحول) التي وتوليفها عبر ممر فينيلبروبانويد في السيتوبلازم للخلية (الشكل 1). تتأكسد بعد تصديرها إلى جدار الخلية، مونوليجنولس إلى الجذور التي بيروكسيداسيس أو لاككاسيس بعد ذلك أنها تمر بتفاعلات كيميائية بحتة اقتران الراديكالية بلمرة للبوليمرات اللجنين، وصف عملية ليجنيفيكيشن. 15 , 16 على الرغم من أن ليجنينس تأثيراً قويا تثمين الصناعية كثير المشتقة من النباتات المنتجات، والمجتمع العلمي لا يزال أمامها طريق طويل للذهاب إلى فك الآليات المعقدة التي تنظم ليجنيفيكيشن.
رقم 1: عملية ليجنيفيكيشن في الخلايا النباتية- مونوليجنولس بيوسينثيسيزيد من فينيلألانين في سيتوسول. تتأكسد بعد تصديرها إلى جدار الخلية، مونوليجنولس إلى الجذور التي بيروكسيداسيس أو لاككاسيس بعد ذلك أنها تمر بتفاعلات كيميائية بحتة اقتران الراديكالية بلمرة للبوليمرات اللجنين، وصف عملية ليجنيفيكيشن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
على الرغم من تقارير عن استخدام ردود الفعل بيورثوجونال لتحليل جليكان العديدة،2،،من317 بهم تطبيق الأمثلة على أنواع أخرى من الجزيئات الحيوية أقل. كان رائدا استخدام الكيمياء بيورثوجونال لأغراض بيويماجينج اللجنين إلا في الآونة الأخيرة من قبل توبيماتسو et al. 8 في نبات التمويل لتوفير معلومات حول إدماج كونيفيريل الأمهات البديلات الكحول إلى البوليمر اللجنين حيث أنها تشكل وحدات ز،،من89 مما يدل على إثبات المبدأ الذي مراسل الكيميائية استراتيجيات قابلة للتطبيق في هذا السياق. استخدام كواك كانت تتجلى أيضا في استخدام مشتق الكحول كونيفيريل مختلفة قليلة في الشهر في وقت لاحق بوكوفسكي وآخرون. 9 ولكن اللجنين يحتوي أيضا على وحدات ح وق وفهم أعمق لعملية ليجنيفيكيشن يتطلب المزيد من المعرفة عن كيفية إدراج كل من مونوليجنولس في البوليمر وما هي العوامل التي يمكن التحكم في تشكيلها. التطورات الجديدة في هذا الميدان يعتمدون حاليا على تطوير منهجيات فعالة لتعقب الصحفيين الكيميائية متعددة في نفس الوقت في الأنظمة الحية. على الرغم من أن بعض المواد في جليكانس قد أرست الأساس في السنوات الأخيرة18،19،20،،من2122، وصف النهج المزدوج يظل تحديا رئيسيا في كيمياء بيورثوجونال. إذا كان بروتوكول انقر فوق تسمية مفردة استنساخه من الصعب تطوير، ثم مزدوج وسم النهج التي تتطلب التحسين في ترادف اثنين بعضها بعضا بيورثوجونال متوافق مع ردود الفعل على اثنين من الصحفيين الكيميائية منفصلة أصعب. تستخدم الأمثلة القليلة التي كانت رائدة في هذا الجانب مزيجاً من سلالة تشجيع أزيد-ألكاين سيكلواديشن (سباك) والطلب الإلكترونية العكسية الكين-تيترازيني ديلز-الدر (داللاستثمارات) ردود الفعل لدراسة جليكانس في الخلايا الحيوانية. ومع ذلك، كنا نظن أن بيورثوجوناليتي من رد فعل داينف قد لا يمكن ضمانها في هذا التطبيق نظراً للسمات الهيكلية من اللجنين (التي تتألف من مونومرات الغنية بالإلكترونات المستبدلة سيناميل-نوع التي يمكن أن تتفاعل مع إلكترون-الفقراء دينيس مثل المجسات تيترازيني المستخدمة في التفاعلات داينف)، وأن هذا قد يولد وسم غير محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب رد فعلللاستثمارات دا مقابض الكيميائية التي يصعب صناعيا بالوصول، فضلا عن كونها ضخمة ومحبتين مما زاد من إمكانية أن معدل التأسيس والنقل و/أو الترجمة للمادة الكيميائية مراسل في فيفو قد تتأثر. كما رأينا أن الجانب الأخير بصفة خاصة في حالة اتباع نهج انقر فوق كيمياء لدراسة ليجنيفيكيشن، اخترنا اتجاه مختلف وتطويرها باستخدام "بيورثوجونال ربط التصوير المتسلسل استراتيجية" (النعيم) مزيج من سيكلواديشن أزيد-ألكاين سترينبروموتيد (سباك) والنحاس حفزت أزيد-ألكاين "سيكلواديشن" (كواك) المجراة في. 23
ردود الفعل هذه اثنين هي في الواقع فوق بيورثوجونال الرئيسية اثنين من ردود الفعل التي استخدمت حتى الآن، وأخص في الأمثلة القليلة من اللجنين التصوير التي نشرت مؤخرا. 8 , 9 استراتيجيتنا التوسيم المزدوج يمكن استخدام moiety أزيد شأن مراسل مونوليجنول واحد والكاين طرفية الأخرى، اثنين من مقابض الكيميائية ط) أونريكتيفي نحو الهياكل ذات الصلة بيولوجيا والثاني) جداً صغيرة الحجم (الشكل 2 ). كنتيجة لذلك، يتم تصغير أثر هذه التعديلات الاصطناعية في الخصائص الفيزيائية بيوموليكولي قيد الدراسة وبالتالي تقليل الاختلافات الممكنة بين ركائز مونوليجنول الطبيعية وغير الطبيعية من حيث النقل و معدلات ميتابوليزيشن أثناء الخطوة إدراج الأيضية. على الرغم من أن الجمع بين سباك وكواك تبدو بديهية جداً للوهلة الأولى، أنها معرفتنا فقط المثال الثاني وسم المزدوج باستخدام هذه الاستراتيجية والتطبيق الأول على هياكل خلاف جليكانس. 12 , 23
رقم 2: بليس وسم استراتيجية مزدوجة- الكيميائية الصحفيين حمن الألف إلى الياء وزكيه هي النظير المعلمة مونوليجنولس ح وز الأم. أولاً إدماجها في البوليمرات اللجنين المتزايد لجدر الخلايا عن طريق تغذية خارجية (الخطوة 1). سيكلوكتيني-وأزيد-فونكتيوناليزيد المسابير الفلورسنت ثم هي متصلة تسلسلياً للصحفيين مدمجة من بيورثوجونال انقر فوق الكيمياء: رد فعل سباك (الخطوة 2) محددة للغاية لوحدات حمن الألف إلى الياء وتبعتها (رد فعل كواك الخطوة 3) التي محددة لوحدات زكيه (الخطوة 3)، مما يتيح التعريب محددة لكل الصحفيين بشكل مستقل في نفس العينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
نحن أولاً المصممة والتحقق من صحة مراسل حمونوليجنول معلم أزيدمن الألف إلى الياء (مركب الكحول-كوماريل ف) والسلائف من وحدات اللجنين ح، وثم وضعت استراتيجية التوسيم المزدوج النعيم الذي يتم استخدامه بالتزامن مع وذكرت سابقا معلم ألكاين زكيه،9 (مركب الكحول كونيفيريل) والسلائف من اللجنين ز وحدات. في هذا البروتوكول استنساخه طورت واختبرت في الكتان، ويتحقق من أنواع النباتية هامة اقتصاديا، إدراج الأيضية المزدوج حمن الألف إلى الياء و زكيه في اللجنين أولاً قبل متسلسلة سباك/كواك وضع العلامات. هنا، هي وحداتمن الألف إلى الياء حالمعلمة أولاً المسمى على وجه التحديد عن طريق ربط سباك من فلوروفوري فونكتيوناليزيد سيكلوكتيني، تليها كواك بوساطة ربط التحقيق الفلورسنت الثانية على المعلمة زكيه الوحدات. هذا الأسلوب تم استخدامه للتحقيق في ديناميات العمليات ليجنيفيكيشن داخل جدران الخلايا النباتية ويمكن تطبيقها في فيفو لوقف المقاطع العرضية، تعيش ينبع فضلا عن شتلة من الأنواع النباتية المختلفة.
Protocol
ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا السائلة والصلبة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الوسائط مسبقاً كما هو موضح في الجدول 1 تكميلية.
1-مصنع الثقافة
-
الثقافة لنباتات الكتان شهرا 2
- زرع بذور الكتان (Linum usitatissimum L.) في الأواني البلاستيكية باستخدام السماد بوتينغ.
- ينمو الكتان في دوائر النمو عند 22 درجة مئوية مع كبيرة من ح 16/8 ح/نهاراً.
- تجهيز النباتات مع دعم عمودي بعد شهر 1 وتنمو حتى أنهم 2 شهرا.
-
ثقافة 2 منذ أسابيع شتلات الكتان
- التفاف 12 بذور الكتان في قطعة قماش الجبن وإصلاحها مع شريط المطاطي جعل حزمة.
ملاحظة: إجراء الخطوات التالية تحت ظروف معقمة تحت غطاء دخان الاندفاق الصفحي. - ضع حزمة البذور في زجاجة زجاج 250 مل يعقم سابقا.
- إضافة مل 70% 70 EtOH في الزجاجة ولطف يقلب لمدة 1 دقيقة.
- بعناية إزالة EtOH والصفق بينما تترك الباقة في الزجاجة.
- إضافة 100 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 2% ويقلب بلطف لمدة 10 دقائق.
- إزالة الحل تحت كلوريت الصوديوم بواسطة والصفق بينما تترك الباقة في الزجاجة.
- كرر الخطوات 1.2.5-1.2.6.
- إضافة 100 مل الماء المعقم عالي النقاوة ويقلب لمدة 1 دقيقة.
- كرر الخطوة 1.2.8 3 مرات، على زيادة وقت الشطف كل شطف (5، 10 و 15 دقيقة).
- الحارة الصلبة ½ MS المتوسطة ومن أجل ذلك في مربع ثقافة النباتية عقيمة إلى ارتفاع 2 سم وندعه يبرد حتى التجميد.
- دقة وضع كل البذور على الصلبة المتوسطة استخدام الملقط العقيمة.
- قم بإغلاق مربع العقيمة.
- تحويل المربع إلى دائرة نمو عند 22 درجة مئوية مع كبيرة من ح 16/8 ح/نهاراً وتنمو بذور الكتان لمدة أسبوعين.
- التفاف 12 بذور الكتان في قطعة قماش الجبن وإصلاحها مع شريط المطاطي جعل حزمة.
2-التمثيل الغذائي إدراج الصحفيين الكيميائية
ملاحظة: يتم عرض ثلاثة نماذج تجريبية أدناه: وسم ط) الأيض الجذعية المقاطع العرضية وينبع ثانيا) كله والشتلات النباتية الثالث). ويرد كل بروتوكول لتكرار البيولوجية واحدة وكميات يمكن تكييفها وفقا لعدد replicates البيولوجية المطلوبة. وتعد الحلول مونوليجنول من حلول الأسهم التي يتم إجراؤها على النحو المبين في الجدول 2 قبل التجربة. ويمكن تخزين الحلول الأسهم عدة أشهر في-20 درجة مئوية. حمن الألف إلى الياء: زكيه أو نسب H:G ويمكن تعديلها لتناسب جميع تصاميم تجريبية مصنوعة خصيصا.
- إدراج مراسل الكيميائية في المقاطع العرضية الجذعية الكتان شهرا 2
- إعداد 300 ميليلتر مراسل كيميائية محلول يحتوي على 10 ميكرون من زكيه و 10 ميكرون من حمن الألف إلى الياء في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة.
- دوامة حمن الألف إلى الياء/زكيه الحل وأنه نقل إلى بئر واحدة من صفيحة 48-جيدا مع ميكروبيبيتي.
- إعداد 300 ميليلتر مراقبة سلبية محلول يحتوي على 10 ميكرون من ز و 10 ميكرون من ح في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة.
- دوامة ح/ز الحل وأنه نقل إلى بئر ثانية من نفس لوحة 48-جيدا.
- قطع ساق نبات الكتان 2 شهرا في 10 سم فوق سطح التربة باستخدام شفرة حلاقة جديدة.
- دقة إعداد 50 المقاطع العرضية مستعرضة مرفوعة من الساق باستخدام شفرة حلاقة (حوالي 150-250 ميكرون سميكة).
- فورا مكان في المقاطع العرضية في السائلة المتوسطة ½ MS العقيمة في زجاج مشاهدة.
- افحص بصريا وحدد المقاطع العرضية كلها سليمة وتوزيعها عشوائياً 10 منهم في شغلها جيدا مع حمن الألف إلى الياء/زكيه الحل.
- كرر الخطوة 2.1.8 لشغلها جيدا مع ح/ز الحل (كالمراقبة السلبية).
- كرر الخطوة 2.1.8 ثالث مليئة أيضا 300 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد (كخلفية عنصر التحكم لضبط خط الأساس fluorescence أثناء معالجة البيانات اللاحقة من الصور مجهرية [كنفوكل]).
- احتضان اللوحة في ضوء مستمر في دائرة نمو عند 20 درجة مئوية ح 20.
- إزالة الحل مونوليجنول في كل بئر ميكروبيبيتي.
- إضافة 500 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد لكل بئر ويقلب بلطف لمدة 10 دقائق وإزالة هذا الشطف الحل مع ميكروبيبيتي. كرر 4 مرات وانتقل إلى بليس وسم فورا (المادة 3).
- مراسل الكيميائية إدماج 2 شهرا الكتان كله ينبع
- تحضير محلول مراسل كيميائية 5 مل يحتوي على 10 ميكرون من زكيه و 10 ميكرون من حمن الألف إلى الياء في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة.
- دوامة حمن الألف إلى الياء/حلزكيه ونقل ذلك إلى اختبار زجاج 20 سم عالية أنبوب مع ماصة.
- تحضير محلول مراقبة سلبية 5 مل يحتوي على 10 ميكرون من ز و 10 ميكرون من ح في السائل معقمة متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
- دوامة ح/ز الحل ونقل ذلك إلى اختبار زجاج 20 سم عالية أنبوب.
- إعداد أنبوب اختبار زجاج ثالثة التي تحتوي على 5 مل متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد (كخلفية عنصر التحكم لضبط خط الأساس fluorescence أثناء معالجة البيانات اللاحقة من الصور مجهرية [كنفوكل]).
- قطع ساق نبات الكتان 2 شهرا في 10 سم فوق سطح التربة باستخدام شفرة حلاقة جديدة. تجاهل جذر النظام والجزء السفلي من الساق، والمضي قدما إلى الخطوة التالية مع الجزء العلوي من الساق النباتية.
- تزج قاعدة جذع قطع كامل في أنبوب يحتوي على حمن الألف إلى الياء/زكيه الحل. ضع الجذعية في الحضانة وحلها فورا بعد إزالة جذر النظام بغية منعها من التجفيف.
ملاحظة: إذا كان الأسلوب يطبق على النباتات الأصغر/كبار السن و/أو الأنواع الأخرى، يجب تعديل حجم مونوليجنول الحلول وفقا للحجم عمر النبات والقطر في الساق. - إرفاق الجذعية لدعم عمودي للحفاظ على التوالي.
- ختم أنبوب الزجاج مع بارافيلم لتجنب تبخر المحلول.
- كرر الخطوات 2.2.6-2.2.9 للحصول على نموذج المراقبة السلبية مع ح/ز الحل.
- كرر الخطوات 2.2.6-2.2.9 لنموذج عنصر تحكم خلفية الأسفار التي تحتوي على متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
- احتضان كل الجذعية ح 20 في ضوء استمرار استخدام ضوء نيون.
- بعد 20 ساعة إدراج الأيضية، إزالة الجذعية المحتضنة في حمن الألف إلى الياء/حلزكيه وشطفه مع متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
- قطع وتجاهل الجزء السفلي 1 سم الساق باستخدام شفرة حلاقة، ثم قم بإعداد اسطوانة ارتفاع 1 سم من قاعدة جذع المتبقية.
- إعداد المقاطع 20 عرضية مرفوعة العرضية (حوالي 150-250 ميكرون سميكة) من هذه الاسطوانة ووضعها مباشرة في مشاهدة زجاج مليئة بمتوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد بعناية.
- وضع 500 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد في بئر واحدة للوحة 48-جيدا.
- افحص بصريا وحدد المقاطع العرضية كلها سليمة وتوزيعها عشوائياً 10 منهم في البئر مليئة بحل مرض التصلب العصبي المتعدد ½.
- كرر الخطوات 2.2.13-2.2.17 للمراقبة السلبية الجذعية المحتضنة مع الحل ح/ز .
- كرر الخطوات 2.2.13-2.2.17 لوقف التحكم الخلفية الفلورية المحتضنة مع متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
- بعناية إزالة الحل في كل بئر ميكروبيبيتي.
- إضافة 500 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد لكل بئر ويقلب بلطف لمدة 10 دقائق وإزالة هذا الشطف الحل مع ميكروبيبيتي. كرر 4 مرات وانتقل إلى بليس وسم فورا (المادة 3).
- مراسل الكيميائية إدماج 2 منذ أسابيع الكتان الشتلات
ملاحظة: الخطوات التالية جميعها تنفذ تحت ظروف معقمة.- تحضير محلول مراسل كيميائية 2 مل يحتوي على 10 ميكرون من زكيه و 10 ميكرون من حمن الألف إلى الياء في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة.
- دوامة حمن الألف إلى الياء/حلزكيه ونقل ذلك إلى اختبار 20 سم ارتفاع زجاج أنبوب مع ماصة.
- تحضير محلول مراقبة سلبية 2 مل يحتوي على 10 ميكرون من ز و 10 ميكرون من ح في السائل معقمة متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
- دوامة ح/ز الحل ونقل ذلك إلى اختبار 20 سم ارتفاع زجاج الأنبوبة.
- إعداد أنبوب اختبار زجاج 20 سم عالية ثالث الذي يحتوي على 2 مل متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد (كخلفية عنصر التحكم لضبط خط الأساس fluorescence أثناء معالجة البيانات اللاحقة من الصور مجهرية [كنفوكل]).
- دقة إزالة شتلات كتان منذ 2 أسابيع من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الصلبة باستخدام زوج طويل من ملاقط (الفرع 1.2. أعلاه).
- نقل بلطف الشتلات للأنبوب الذي يحتوي على حمن الألف إلى الياء/حلزكيه ، وضمان أن جذوره مغمورة في الحل.
- أغلق أنبوب زجاج مع غطاء بلاستيكي لتجنب التبخر.
- كرر الخطوات 2.3.6-2.3.8 لأنبوب مراقبة سلبية مع H/G الحل.
- كرر الخطوات 2.3.6-2.3.8 لأنبوب التحكم الخلفية الأسفار التي تحتوي على متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
- احتضان كل الشتلات في ضوء مستمر في دائرة نمو ح 20 في 20 درجة مئوية.
- دقة إزالة الشتلات المحتضنة في حمن الألف إلى الياء/حلزكيه وشطفه مع متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
- دقة إعداد المقاطع العرضية يدوي 20 (أبروكسيماتيفيلي 150-250 ميكرون سميكة) هيبوكوتيل.
- وضع 500 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد في بئر واحدة للوحة 48-جيدا.
- افحص بصريا وحدد المقاطع العرضية كلها سليمة وتوزيعها عشوائياً 10 منهم في البئر مليئة بحل مرض التصلب العصبي المتعدد ½.
- كرر الخطوات 2.3.12-2.3.15 للشتلة المراقبة السلبية المحتضنة مع الحل ح/ز .
- كرر الخطوات 2.3.12-2.3.15 للشتلة التحكم الخلفية الفلورية المحتضنة مع متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
- بعناية إزالة الحل في كل بئر ميكروبيبيتي.
- إضافة 500 ميليلتر من متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد لكل بئر ويقلب بلطف لمدة 10 دقائق وإزالة هذا الشطف الحل مع ميكروبيبيتي. كرر 4 مرات وانتقل إلى بليس وسم فورا (المادة 3).
3-الأسفار مزدوج وسم عينات النبات المقطع العرضي سباك وكواك
ملاحظة: بليس وسم البروتوكول مطابق لجميع النماذج التجريبية 3 (القسم 2).
-
تروج لها سلالة وسم أزيد-ألكاين سيكلواديشن (سباك)
- إعداد 1 مل محلول سباك يحتوي على 5 ميكرومتر شماعة دبكو4-5/6-كاربوكسيرهوداميني 110 في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة. دوامة الحل والاحتفاظ بها في الظلام.
- بعد الغسيل النهائي إزالة متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الخطوات البروتوكول إدراج الأيضية [2.1.13 أو 2.2.21 أو 2.3.19 حسب التصميم التجريبي الذي تم اختياره]، وإضافة 300 ميليلتر من الحل سباك الواحدة جيدا مع ميكروبيبيتي.
- درع لوحة 48-جيدا من الضوء التي تغطي برقائق الألومنيوم أو بوضعه في مربع.
- يحرك بلطف اللوحة على شاكر ميكانيكية ح 1 في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
-
حفزت النحاس وسم أزيد-ألكاين "سيكلواديشن" (كواك)
- تغسل كل جيدا 4 مرات كما هو موضح في الخطوة 2.1.13 مع الإبقاء اللوحة في الظلام.
- إعداد 1 مل محلول كواك يحتوي على 2.5 مم اسكوربات الصوديوم و 0.5 مم CuSO4 ميكرومتر 5 5-طمره-شماعة3-أزيد في السائل المتوسطة ½ MS العقيمة. دوامة الحل والاحتفاظ بها في الظلام.
ملاحظة: هذا الحل كواك يجب أن يكون طازج قبل الاستخدام ولا يمكن تخزين أكثر من بضعة أيام في 4 درجات مئوية. - إزالة متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد في كل بئر ومباشرة إضافة 300 ميليلتر من الحل كواك الواحدة وكذلك استخدام ميكروبيبيتي.
- يحرك بلطف اللوحة على شاكر ميكانيكية ح 1 في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل كواك باستخدام ميكروبيبيتي.
- استخدام ميكروبيبيتي، أضف ميليلتر 500 مللي ثانية ½، ضجة في الظلام لمدة 10 دقائق ثم إزالة هذا الحل الغسيل. كرر مرتين.
- إضافة 500 ميليلتر لحل ميوه والماء 7:3، وآثاره في الظلام ح 1 ثم إزالة الحل
تنبيه: الميثانول سامة بتماس الجلد أو استنشاق، وتم تعيينه كمسرطن. يتطلب الانتفاع أغطية الأبخرة الكيميائية والقفازات. - إضافة 500 ميليلتر من ½ مرض التصلب العصبي المتعدد، وآثاره في الظلام لمدة 10 دقائق ثم إزالة الحل. كرر 4 مرات.
4-تركيب العينات في المجهر الشرائح
- 5 مكان قطرات من المتوسطة المتصاعدة على شريحة الميكروسكوب زجاجية.
- إيداع بعناية كل حمن الألف إلى الياء/زكيهمعلم شريحة على الشريحة.
- تطبيق طلاء الأظافر على طرفي نقيض هما من الشريحة.
- وتشمل الشريحة مع ساترة. كن حذراً لتجنب فقاعات الهواء.
- قم بإزالة تركيب الزائدة المتوسطة باستخدام منشفة ورقية.
- ختم العينة مع طلاء الأظافر على جميع الأطراف 4. واسمحوا مسمار الورنيش الجاف في درجة حرارة الغرفة (حوالي 30 دقيقة).
- كرر الخطوات من 4.1-4.6 للمقاطع العرضية ح/ز مراقبة سلبية.
- كرر الخطوات من 4.1-4.6 للتحكم الخلفية الفلورية المقاطع العرضية.
- تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية في الظلام حتى المراقبة تحت مجهر [كنفوكل].
ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح استعدادا لعدة أسابيع إلى عدة أشهر حسب نوعية الإعداد. إذا كان هناك ملاحظة أخرى جديدة بعد التخزين، وضمان أن العينات لم جفت.
5-صورة اكتساب Fluorescence مجهرية [كنفوكل]
- قم بتشغيل جميع الوحدات اللازمة لنظام الفحص المجهري [كنفوكل] بالترتيب الصحيح وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- حدد الهدف المنشود مع الفتحة العددية القصوى وتكييفها مع أطوال موجية الإثارة والانبعاثات (مثلاً، obj. 60 س، N.A. 1.2. قناة أوتوفلوريسسينسي: λتحويله 405 نانومتر، λم 450 نانومتر 25؛ قناة حمن الألف إلى الياء سباك: λت 488 نانومتر، λم 525 نانومتر 25؛ قناة زكيه كواك: λتحويله 561 nm, λم 595 nm 25؛ وضع تسلسلي).
- حدد المعلمات المطلوبة لتوليد الصور في البرنامج (12 أو 16-بت المطلوبة، حجم بكسل تتكيف مع معيار نايكست).
- ضع الشريحة حمن الألف إلى الياء/Gكيه في مرحلة مجهر ووضع العينة تحت عدسة الهدف.
- مراقبة والعثور على المنطقة المرغوبة من الأنسجة النباتية.
-
الحصول على صور ذات جودة عالية [كنفوكل] لمضاعفة المسمى/Gمن الألف إلى الياءح عينةكيه .
- حدد الطائرة الفلورسنت الأكثر في محور ع.
- ضبط المكاسب، طاقة الليزر والإزاحة لتحقيق توزيع الإشارات الأمثل على طول نطاق مستوى رمادي كاملة لكل قناة (أوتوفلوريسسينسي، حمن الألف إلى الياء و زكيه). ويجب تطبيق نفس المعلمات لجميع المقتنيات التالية.
- بدء الحصول على الصورة المحددة وقم بحفظ الملف. كرر لكل مجال ذي صلة عينة.
ملاحظة: إعادة البناء Z-مكدس ثلاثي الأبعاد كما يمكن اكتساب إذا لزم الأمر.
- استخدام نفس الإعدادات، الحصول على الصور من ليس تمييز عينة فقط المحتضنة في ½ مرض التصلب العصبي المتعدد لتحديد مستوى أوتوفلوريسسينسي (الأسفار خلفية عنصر التحكم كما هو موضح في القسم 2).
- استخدام نفس الإعدادات، الحصول على صور لعينات مراقبة سلبية المحتضنة مع مونوليجنولس الأصلية H/G لتحديد التصاق fluorophore غير محدد بالعينة.
- تطبيق معالجة البيانات للصور المكتسبة بطرح الخلفية إشارات أوتوفلوريسسينسي في كل من ح/ز مراقبة سلبية الصور والصور من الألف إلى الياءح/Gكيه .
Representative Results
باستخدام بروتوكول النعيم المقدمة التي تنطوي على النظير مونوليجنول الاصطناعية وبيورثوجونال فوق الكيمياء، فإنه من الممكن تصور ديناميات عملية ليجنيفيكيشن في النباتات الحية. خلافا للتقنيات المتبعة اللجنين أهداف التصور (مثل histochemical تلطيخ أو إيمونولوكاليزيشن أو أوتوفلوريسسينسي)، وهذا 'انقر نقراً مزدوجاً فوق' البروتوكول حصرا اللجنين أنتجت حيثياته أثناء إدراج الأيضية خطوة ويفرق من اللجنين الموجودة مسبقاً من العينة مع تصوير الخلوية ثلاثية القنوات بالأسفار [كنفوكل] مجهرية (الشكل 3). ح من الألف إلى الياء-وحدات يتم الكشف عنها باستخدام موجات الإثارة والانبعاثات من شماعة دبكو4-5/6-أدرجت كاربوكسيرهوداميني 110 الذي هو على وجه التحديد بالنقر فوق على مهام أزيد من جزيئاتمن الألف إلى الياء حأثناء الخطوة سباك (λex 501 نانومتر/λم 526 نانومتر، قناة الأخضر)، بينما زكيه-وبالمثل يتم الكشف عن الوحدات عند أطوال موجية مميزة المسبار أزيديفلوور 545 الذي هو على وجه التحديد بالنقر فوق على العلامات ألكاين الطرفية مدمجة من ز كيه أثناء الخطوة كواك (λex 546 نانومتر/λم 565 نانومتر، الأحمر قناة)؛ القناة الثالثة يناظر اللجنين الموجودة من قبل، التي يتم الكشف عنها باستخدام به أوتوفلوريسسينسي المتأصلة في 405 نانومتر (القناة الزرقاء). هذا النهج يؤدي إلى توليد خرائط التعريب ألوان من خشبين داخل جدران الخلايا النباتية التي توفر معلومات مكانية دقيقة عن وجود أو عدم وجود إليه نشطة ليجنيفيكيشن بين أنسجة مختلفة من جهاز (الشكل 3 ألف )، بين أنواع الخلايا المختلفة داخل الأنسجة ذاتها (الشكل 3-ج) وفي طبقات مختلفة من الجدار من نفس الخلية (الشكل 3D). وبعبارة أخرى، هذه المنهجية يسمح لنا بإبراز وتعريب المواقع 'النشط' ليجنيفيكيشن (حمن الألف إلى الياء وقنواتكيه ز) على وجه التحديد بالتفريق لهم من مناطق حيث شكلت اللجنين في سابق مرحلة التنمية النباتية (قناة أوتوفلوريسسينسي). وباﻹضافة إلى ذلك، يتعزز حساسية التقنية هائلة بالمقارنة مع أوتوفلوريسسينسي، ويمكن أن تكون كميات أصغر بكثير من اللجنين المركبة حديثا الكشف عن (الشكل 3B).
الشكل 3: التصوير من الصحفيين مونوليجنول أدرجت المواد الكيميائية في "ينبع الكتان". (أ) نصف مقطع مستعرضة المصنوعة من جذع الكتان، صورة أعيد بناؤها. (ب) عن قرب من الطبقات الأولى التفريق بين الخشب. غادر الفريق: أوتوفلوريسسينسي اللجنين (الأزرق، 405 nm)، الفريق الأوسط: دمج أوتوفلوريسسينسي اللجنين (الأزرق) والأسفار حمن الألف إلى الياء (526 الخضراء، شمال البحر الأبيض المتوسط) القنوات، اللوحة اليمنى: دمج اللجنين أوتوفلوريسسينسي (أزرق) وزكيه الفلورية (أحمر، 565 نانومتر) القنوات. يشير السهم إلى الجدار خلية مسماة أول من كامبيوم توضح زيادة حساسية بليس مقارنة مع أوتوفلوريسسينسي. (ج) التالي في خلية مختلفة الأنواع من الخشب الثانوي و (د) عن قرب على خلايا الخشب الثانوية التي توضح الاختلافات التوسيم في طبقات مختلفة من نفس الخلية جدار. غادر الفريق: دمج أوتوفلوريسسينسي اللجنين (الأزرق) والأسفار حمن الألف إلى الياء (526 الخضراء، شمال البحر الأبيض المتوسط) القنوات، الفريق الأوسط: دمج أوتوفلوريسسينسي اللجنين (الأزرق) والأسفار زكيه (565 أحمر، شمال البحر الأبيض المتوسط) القنوات، حق لوحة: دمج أوتوفلوريسسينسي اللجنين (الأزرق)، حمن الألف إلى الياء (الأخضر) وقنوات fluorescence زكيه (أحمر). ويرد التعريب المشارك حمن الألف إلى الياء وزكيه باللون الأصفر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
استراتيجيات مراسل الكيميائية مثل الأسلوب بليس المعروضة هنا أو إجراءات تسمية واحدة نشرتها سابقا توبيماتسو et al. 8 وبالتالي السماح لدراسة أكثر دقة من أساليب موجوداً مسبقاً مثل المناعية-أو تلطيخ histochemical حين يجري بسيطة للغاية لتنفيذ. على سبيل المثال، يوضح الشكل 4 أن كثافة إشارة حمن الألف إلى الياء/زكيه التأسيس في الألياف تراتشيدس/سفن (قدم) من الخشب الثانوي الكتان مرتفع جداً في جدران الخلايا القليلة الأولى من كامبيوم ولكن ينخفض تدريجيا في الخلايا القديمة. هذا التشكيل الجانبي هو معاكس أوتوفلوريسسينسي ويشير إلى أن ليجنيفيكيشن الأقصى سريعاً للغاية التوصل إلى في طبقات الخلية الأولى قدم اثنين أو ثلاثة من كامبيوم. وفي المقابل، رأي (ص) الخلايا تظهر على مواصلة ليجنيفيكيشن لكثير من مراحل لاحقة لتنميتها حمن الألف إلى الياء/زكيه التأسيس ثابت أكثر بكثير في الجدران لكافة الخلايا من كامبيوم للب. ليس من المستغرب أن أنواع الخلايا متر و R عرض ديناميات ليجنيفيكيشن يتناقض، نظراً لأنواع الخلايا هذه الأدوار البيولوجية المختلفة مع الاختلافات المرتبطة بها في برامجها الإنمائية. FTs هي أنابيب ممدود في الواقع أن تنضج ويموت سريعاً، وترك الخلايا الفارغة الميت مع جدران سميكة ليجنيفيد التي تلعب أدواراً أساسية في دعم الميكانيكية والنقل الرأسي للمياه والمعادن، بينما خلايا الصفوف الضيقة للبحث والتطوير التي يؤلف الخشب أشعة على قيد الحياة في دولته ناضجة والوظيفية دون وجود جدران سميكة ليجنيفيد.
الشكل 4: إدراج مراسل مونوليجنول خلية على حدة في الخشب الكتان. عرض برايت-حقل [كنفوكل] مجهرية (A) من جزء من شريحة مرفوعة من جذع كتان. وردي (رأي حمة الخلايا, R) والأصفر (ألياف تراتشيد الخلايا، قدم) تشير الأسهم إلى متجهات تمتد من منطقة كامبيل تجاه لب ومسحها ضوئياً أوتوفلوريسسينسي اللجنين في 405 نانومتر (ب)، والأسفار حمن الألف إلى الياء في 526 nm (ج) وز كيه fluorescence في 565 نانومتر (د). (ه) عرض من الخشب الثانوي. غادر الفريق: دمج أوتوفلوريسسينسي (الأزرق)، اللجنين حمن الألف إلى الياء (الأخضر)، ومجموعةكيه قنوات الفلورية (أحمر). ويرد التعريب المشارك حمن الألف إلى الياء وزكيه باللون الأصفر. اللوحة اليسرى: التوضيح التخطيطي هيكل الخشب الثانوي في الساق الكتان. الخامس، والسفينة؛ متر، تراتشيد الألياف؛ R، رأي لحمه الخلية. وقد تم تعديل هذا الرقم من الأسد et al. 23 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وبالإضافة إلى ذلك، يتيح استخدام اثنين من الصحفيين الكيميائية المميزة المطابقة لوحدات ح وز مع اثنين من ردود فعل بيورثوجونال في البروتوكول بليس المزيد من النتائج الكمية الحصول عليها. متعدد وسم استراتيجيات مثل بليس يمكن أن توفر أفكاراً إضافية في السيطرة على مونوليجنول نسب إدماج في ظروف مختلفة ويمكن أن تسهم في فك رموز عملية ليجنيفيكيشن بعيد المنال. إذا كانت النسب النسبية من مونوليجنولس ح، ز وق في ليجنينس في الواقع المتغير جداً وفقا للأنواع أو الأنسجة أو العمر أو الظروف البيئية للمصنع، لا تزال لا تماما مفهومة الآليات المعقدة التي تنظم هذا التشكيل. التكنولوجيا التوسيم المزدوج يمثل وسيلة قوية للتحقيق في بعض المعلمات التي تنظم تكوين اللجنين. على سبيل المثال، متفاوتة حمن الألف إلى الياء: زنسبةكيه مع بليس سمح لنا أن ندلل على أن تكوين اللجنين في أنسجة الخشب الثانوي مباشرة يتوقف على توافر مونوليجنول داخل جدران الخلية، بدلاً من التركيز على خصوصية البيروكسيديز/لاككاسي (الشكل 5).
الشكل 5: تأثير تفرخ أبواب الجذعية الكتان بنسب مئوية مختلفة من حمن الألف إلى الياء وزكيه. حمن الألف إلى الياء: يتم إعطاء نسب % زكيهفوق كل عمود من الأرقام. أعلى: دمج القنوات حمن الألف إلى الياء وزكيه . أسفل: رسوم بيانية تبين fluorescence متوسط كثافة حمن الألف إلى الياء و زكيه لنسب مختلفة في المائة. يتم التعبير عن القيم بمتوسط كثافة fluorescence يعني في مستويات الرمادي ± مقياس التنمية المستدامة. بار = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من الأسد et al. 23 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويزرع الكتان لما الحائيه (BF) التي يتم استخدامها لتصنيع المنسوجات، أوراق فاخرة أو مواد مركبة صديقة للبيئة. جانبا مهما من على تثمين الصناعية هو أنها تحتوي على مستويات منخفضة جداً من اللجنين في جدرانها الخلية، التي تتميز بكثيف جداً S2/ز19،طبقة ثانوية24. يمكن تمييز بليس ليجنيفيكيشن ديناميات الاختلافات بين طبقات مختلفة من نفس الخلية جدار. يبين الشكل 6A مقصورة على أركان الخلية وجدار الخلية الابتدائية صفاحه الأوسط الحائيه بعض ولكن ليس كافة إدراج مراسل حمن الألف إلى الياء و زكيه . الغياب التام ليجنيفيكيشن في الخلية الثانوية الجدار طبقة سميكة اللحاء الألياف حتى عند الصحفيين مونوليجنول الكيميائية مناشئ الموردة تكشف أن دولته هيبوليجنيفيد ينبع من عدم وجود بيئة جزيئية مناسبة أكسدة انزيماتيكالي بوساطة وإدماج مونوليجنولس في سلسلة بوليمر متنامية، وأنه ليس فقط بسبب تنظيم النسخي جينات تخليق الحيوي مونوليجنول كما سبق وذكرت25. هذه الملاحظة أيضا يرتبط تماما مع الحقيقة أن البيروكسيديز الكتان الجينات حتى-ينظم في الأنسجة الجذعية الخارجي للمسخ الكتان الكيميائية lbf1 التي تمتلك الحائيه ليجنيفيد26.
رقم 6: النعيم يسلط الضوء على الاختلافات الهيكلية أو طبقة محددة جدار الخلية. (أ) ترك الفريق: صورة مشرقة الميدانية قسم الجذعية الكتان. الدائرة تشير إلى حزمة ألياف. اللوحة اليسرى: قريبة في الحائيه. دمج قنوات حمن الألف إلى الياء وزكيه (مع ودون مشرق الميدان) تبين أن ليجنيفيكيشن يقتصر على أركان الخلية (
) وجدار الخلية الابتدائية صفاحه الأوسط بعض الحائيه. فرنك بلجيكي، ألياف اللحاء؛ الاسمية، لحمه الخلية؛ M، صفاحه الأوسط؛ ف، جدار الخلية الأولية؛ S1، والطبقة الأولى من جدار الخلية الثانوية؛ S2/ز، والثانوي طبقة/هلامية طبقة من جدار الخلية الثانوية. (ب) شريحة 2D والتعمير 3D من المكدس z [كنفوكل] التكبير الكتان الجذر endodermis المنطقة. وفي قطاع كاسباريان () يعرض أوتوفلوريسسينسي فقط ولا تتضمن حاز أو زكيه. فلوروجرام المرتبطة بها يظهر زكيه/Hمن الألف إلى الياء المضادة الارتباط: يرتبط الفلورية الخضراء عالية لإشارة حمراء منخفضة (اللحاء) والعكس بالعكس (endodermis). بيريسيكلي (ف)، Endodermis (ﻫ)، Cortex (C). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
أخيرا، هذه المنهجية اللونين يمكن أيضا تقديم معلومات قيمة عن 'الدولة ليجنيفيكيشن' من جدار الخلية هياكل فرعية في مراحل إنمائية مختلفة وفي مصنع الأجهزة عدا الجذعية. على سبيل المثال، endodermis من الكتان الجذور تتميز بوجود عصابة كاسباريان في جدرانه خلية شعاعي وعرضية خلال المراحل الأولى من التنمية. يمنع الماء والذوائب بالجذر من دخول سلبية من خلال أبوبلاست هذه الفرقة من بيوبوليمير مسعور، مصنوعة من سوبيرين و/أو اللجنين، ويفرض عليهم المرور عبر غشاء البلازما عبر مسار سيمبلاستيك مما يسهم في قدرات الامتصاص الانتقائي لجذور النباتات. عند تطبيقها على جذور الكتان، واستراتيجيتنا أظهرت أن حمن الألف إلى الياء وزكيه مدرجة في الجدران عرضية للخلايا اندوديرمال، وكذلك كما هو الحال في أجزاء من الجدران شعاعي حيث الفرقة كاسباريان غياب (الشكل 6B). ومع ذلك، الغياب التام لإدماج مراسل مونوليجنول في الفرقة كاسباريان نفسها تشير إلى أنها ناضجة في هذه المرحلة الإنمائية بينما الجدران الأخرى لا يزال الموقع كذلك بيوبوليمير ترسب. عرض ثلاثي الأبعاد أعيد بناؤها من كدسة z وضوح يجلب الفرقة كاسباريان للضوء. من المثير للاهتمام، على جدران بعض الخلايا القشرية المجاورة endodermis ثبت أيضا قادرة على دمج حمن الألف إلى الياء تفضيلي (مما يشير إلى وجود اللجنين/صابرين في قشرة الجذر الكتان) لكن لا زكيه. وأظهر تحليل المشارك الترجمة ارتباط المضادة بين حمن الألف إلى الياء وزكيه، والتي توحي بوجود إليه هيكل/الانزيمية جدار الخلية المحددة في هذين النوعين من الخلايا المجاورة.
تكميلية الجدول 1: إعداد الصلبة ½ MS المتوسطة اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الجدول 2: إعداد الحلول الكيميائية مراسل الأسهم اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
كما ذكر آنفا، البروتوكول بليس التوسيم المزدوجة المعروضة في هذه الورقة أحد الأمثلة الأولى تركيبة سباك/كواك في فيفو12،23. كل خطوة كان جيدا الأمثل، والتحقق من صحتها، وأنه من المهم جداً أن يحترم النظام فيها اثنين انقر فوق الكيمياء ردود فعل التوسيم تتم تسلسلياً (أي سباك أولاً، تليها كواك). ضوابط عبر كافة أظهرت أن كل خطوة وصفها محددة عندما يكون البروتوكول بليس التطبيقية23 : القيام بخطوة سباك يؤدي أولاً إلى تشيموسيليكتيفي عالية وسم حمهام أزيدمن الألف إلى الياء فونكتيوناليزيد سيكلوكتيني فلوروفوري من خلال رد فعل [2 3 +] سيكلواديشن مع حركية سريعة. حالما يتم تمييزها وحدات حمن الألف إلى الياء ، يمكن القيام الخطوة كواك مما يستلزم تفعيل زكيه الكينس محطة لتوليد وصلات تريازولي برد فعل مع التحقيق 545 فلور أزيد النحاس الأحادي حفزت. وفي المقابل، بالترتيب العكسي (أي، كواك أولاً، متبوعة سباك) لا ينبغي أن تستخدم كما أنها تؤدي إلى وحدة زكيه وحمن الألف إلى الياء اقتران الصليب، الذي يتنافس مع ربط فلوروفوري ويؤدي إلى خسارة درامية في إشارة . من المهم أيضا التشديد على ضرورة الخطوات الوسيطة الغسيل لتجنب تلطيخ غير محددة.
وقد أظهرنا أن لدينا طريقة يمكن تطبيقها على مختلف التجارب البيولوجية التصاميم. أولاً طبق بليس وسم البروتوكول للمقاطع العرضية مرفوعة من الكتان ينبع (حوالي 150-250 ميكرون سميكة) التي كانت سابقا قص والمحتضنة مع مونوليجنولس انقر فوق استعداد. على الرغم من أن هذا التصميم يتميز بتقليل الكميات اللازمة من مراسل الكيميائية (كما يتم تقليل حجم حاضنات) وتيسير إنتاج replicates الإحصائية، أنها ليست كذلك، صارما في حديثة، نظام في الجسم الحي ، وفي بعض الحالات، قد لا تعكس جميع جوانب الديناميات ليجنيفيكيشن الحقيقي الزمانية. في تصميم تجريبية ثانية، ولذلك نحن تكييف البروتوكول بليس لأسلوب الذي تم استخدامه مسبقاً لدراسة إدراج مونوليجنولس راديولابيليد في الصنوبر والجنكه27. في هذا النهج، جذور وساق النبات تكون مفصولة ماديا وهي المحتضنة قاعدة الجذع كله في حل مونوليجنول بما قد يطلق عليه النهج 'إناء الزهور'. بعد مغادرة ينبع الوقت المطلوب (الحضانة)، المقاطع العرضية هي قص وبروتوكول النعيم أداء. هذا يسمح لنا بإظهار (ط) أن مونوليجنولس تعديل يتم نقلها عن طريق الجذعية الحية وأدرجت في تزايد البوليمرات اللجنين داخل جدران الخلية و (ثانيا) أن كان نمط التعريب أساسا مطابقاً للمقطع العرضي النهج. يتميز هذا النوع من التجربة المنجزة في مصنع لمعيشة حقيقية/خلية يعيش نهج السماح بتجارب أطول وأكثر الدراسات المتعمقة، ولكن يتطلب كميات أكبر من المواد الكيميائية مراسل. وأخيراً، كان أيضا استخدام البروتوكول النعيم مع شتلات نبات الكتان، تمثل حقيقي يعيش طراز النبات فيها للصحفيين الكيميائية يجب أن تكون يمتص عن طريق الجذور قبل نقلها حتى وقف. بينما هذا النموذج له ميزة واضحة يجري تنفيذها في النباتات الحية، في الممارسة العملية، فإنه يقتصر على شتلات صغار وليس حقاً مناسبة للتحقيق في ديناميات ليجنيفيكيشن في النباتات الأكبر سنا لأسباب عملية (حضانة طويلة الوقت، مرتفعة كمية من الصحفيين الكيميائية). ومع ذلك، هذه التجربة ثلاثة التصاميم متكاملان، وجميعها إيجابيات وسلبيات فيما يتعلق بالجوانب العملية وأهمية بيولوجية تبعاً لنوع السؤال البيولوجية الرد على.
المتقدمة لدراسة ديناميات ليجنيفيكيشن في الكتان، لدينا بروتوكول القدرة على التكيف، ليس فقط من حيث تصميم التجربة البيولوجية، بل أيضا من حيث انطباقه على الآخر زراعة الأنواع وأجهزة/الأنسجة. على سبيل المثال، يمكن بسهولة نقل بليس لنبات أو أجناس حور التي أكثر قابلية للدراسات مع طفرات المغلوب أو تدق لأسفل لجينات مختلفة. من حيث المبدأ، دراسات وضع العلامات المزدوجة مع نهجنا يمكن أيضا توسيع للجزيئات الحيوية الأخرى باستخدام اثنين من السلائف معدلة متميزة البوليمرات جدار الخلية النباتية--بما في ذلك جميع مونوليجنولس الرئيسية الثلاث أو سلائفها الأيضية فضلا عن مختلف السكريات الأحادية التي تشكل مصفوفة السكاريد. منذ نشأتها، الكيمياء بيورثوجونال في الواقع أساسا وضعت للتحقيق في جليكانس/السكريات عن طريق oligosaccharide الأيضية الهندسية (وزارة التربية والتعليم)4،5،،من1728، ولكن من المدهش أن هناك فقط تطبيقات قليلة جداً لزراعة الأحياء حتى الآن7،،من89،10،،من1112. من حيث التوافق من ردود الفعل، وكانت دراسة اللجنين الواقع قضية معقدة لحل كل الصحفيين الكيميائية مدرجة ضمن نفس البوليمر شبكية. إمكانية غير مسمى حمن الألف إلى الياء-تكوين قياسكيه زكان القضية الرئيسية للتغلب على نظراً للقرب المكاني زكيه ووحداتمن الألف إلى الياء حداخل 3D هيكل من اللجنين23، قيد التي قد لا تكون موجودة في حالة عدم إدراج اثنين من الصحفيين الكيميائية في نفس النوع من بيوبوليمير أو في نفس المنطقة المكانية لأي خلية معينة.
على نطاق أوسع يمكن تطبيق المنهجية بليس أساسا لأي دراسة الأسفار اللونين التصوير في النماذج البكتيرية أو الحيوانية باستخدام اثنين من الصحفيين الكيميائية المتميزة آخذا أزيد والعلامة ألكاين الطرفية، على التوالي.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن مدينون إلى "فرابيو اتحاد البحوث" ومنصة التصوير تيسبيو (جامعة ليل، يزار، الأب 3688، فرابيو، بيوتشيميستروكتورالي et Biomoléculaires فونكتيونيلي des تجمعات) لتوفير البيئة التقنية المؤدية إلى تحقيق هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
| (E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
| 2% sodium hypochlorite | |||
| 20 cm high glass tube | |||
| 250 mL Schott glass bottle | |||
| 48-well Plate | |||
| 5/6-TAMRA-PEG3-Azide | Jena Bioscience | CLK-AZ109-1 | |
| Aluminium foil | |||
| Cheese cloth | |||
| Compost containing clay | |||
| Coniferyl alcohol (G) | Sigma Aldrich | MFCD00002922 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | |||
| DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 | Jena Bioscience | CLK-A127-1 | |
| Milli-Q Ultrapure water | |||
| Eppendorf 1,5 mL | |||
| EtOH | |||
| Flax seeds (L. usitatissimum L.) | |||
| Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Glass coverslip | |||
| Glass microscope slide | |||
| Growth chamber | CLF-Plant Climatics | For 2-week-old plants culture | |
| Growth chamber | Angelantoni Life Sciences | For 2-month-old plants culture | |
| Magenta plant culture box | For 2-week-old seedling culture | ||
| Methanol | Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood | ||
| Micropipette | |||
| Nail polish | |||
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | ||
| Orbital shaker | |||
| Parafilm | |||
| p-Coumaryl alcohol (H) | Carbosynth | FC145653 | |
| Plastic cap | |||
| Plastic pipette | |||
| Plastic pot | For 2-month-old plants culture | ||
| Razor blade | |||
| Rubber band | |||
| Sodium Ascorbate | |||
| Sterile clamp | |||
| Vertical support | |||
| Vortex | |||
| Reagents for liquid and solid ½ MS medium | |||
| KH2PO4 | |||
| KNO3 | |||
| NH4NO3 | |||
| MgSO4.7H2O | |||
| CaCl2.2H2O | |||
| MnSO4.H2O | |||
| ZnSO4.7H2O | |||
| H3BO3 | |||
| KI | |||
| Na2MoO4.2H2O | |||
| CuSO4.5H2O | |||
| CoCl2.6H2O | |||
| Na2EDTA.2H2O | |||
| FeSO4.7H2O | |||
| Thiamine.HCl | |||
| Pyridoxine.HCl | |||
| Glycine | |||
| Nicotinic acid | |||
| Myo-inositol | |||
| Saccharose | |||
| MES hydrate | |||
| Agar |
References
- Grammel, M., Hang, H. C. Chemical reporters for biological discovery. Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).
- Prescher, J. A., Bertozzi, C. R.
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Chang, P. V., et al. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).
- Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
- Mbua, N. E., et al. Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).
- Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).
- Tobimatsu, Y., et al. A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification. Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).
- Bukowski, N., et al. Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls. Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).
- Pandey, J. L., et al. A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls. PLOS ONE. 10 (4), e0121334 (2015).
- Pandey, J. L., et al. Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems. Front Plant Sci. 7, (2016).
- Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M.
- Weng, J. -K., Chapple, C.
- Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification. Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).
- Rinaldi, R., et al. Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis. Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).
- Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).
- Feng, L., et al. Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans. J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).
- Dumont, M., et al. Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d - manno -oct-2-ulosonic acid. Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).
- Niederwieser, A., et al. Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry. Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).
- Späte, A. -K., et al. Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering. Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).
- Späte, A. -K., et al. Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter. Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).
- Lion, C., et al. BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants. Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).
- del Río, J. C., et al. Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives. J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).
- Huis, R., et al. Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems. Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).
- Chantreau, M., et al. Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition. The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).
- Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora. Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).
- Noel, M., et al. Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human β-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins. Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).
