Dit manuscript beschrijft het gebruik van transgene reporter muizen en andere beheerprogramma routes van fluorescente kleurstoffen in angiotensine II-geïnduceerde hypertensie met behulp van intravital videomicroscopie van bloedvaten te evalueren van de activering van immune cellen en hun mogelijkheid te rollen en zich houden aan het endotheel.
Epifluorescence intravital videomicroscopie (GODT) van de bloedvaten is een gevestigde methode om te evalueren van de activering van immune cellen en hun vermogen om de rol en zich houden aan de endothelial laag. Visualisatie van circulerende cellen door injectie van fluorescente kleurstoffen of fluorophore-coupled antilichamen wordt vaak gebruikt. Ook kunnen fluorescerende verslaggever muizen worden gebruikt. Interacties van leukocyten, in bepaalde lysozym M+ (LysM+) monocyten, met de vaatwand spelen een cruciale rol bij het bevorderen van arteriële hypertensie en vasculaire dysfunctie. Hier presenteren we de techniek om te visualiseren en te kwantificeren van leukocyten rollen en hechting in halsslagaderen in angiotensine II (AngII)-geïnduceerde hypertensie in muizen door GODT.
De inplanting van een katheter schaadt de vasculaire muur en leidt tot reacties van de gewijzigde bloedcel. Wij vergeleken verschillende injectie technieken en administratie routes te visualiseren van leukocyten in een LysMCre+IRG+ muis met wijdverspreide expressie van rode fluorescerende eiwit en voorwaardelijke expressie van groen fluorescent proteïne in LysM + cellen. Studeren LysM+ cel activatie, gebruikten we AngII geïnfundeerd muizen in welke rollen en de hechting van de leukocyten op het endotheel wordt verhoogd. We ofwel geïnjecteerd acridine oranje met behulp van een jugular katheter of direct al de staart ader en ten opzichte van de hoeveelheid rollen en naleven van cellen. We vonden dat jugular katheter implantatie per se steeg het aantal rollen en daaraan vastzittende LysM+ cellen in sham-geïnfundeerd LysMCre+IRG+ muizen in vergelijking met besturingselementen. Deze activering werd opgedreven in AngII-geïnfundeerd muizen. Interessant, injecteren van acridine oranje rechtstreeks via de staart ader niet verhogen LysM+ cel adhesie of rollen in sham-geïnfundeerd muizen. We daarmee het belang van transgene reporter muizen uiting van fluorescente proteïnen te niet mengen met in vivo processen tijdens experimenten aangetoond. Bovendien, staart veneuze injectie van fluorescerende traceurs misschien wel een mogelijk alternatief voor jugular katheter injecties.
Arteriële hypertensie verhoogt het risico van hart-en vaatziekten en dood en bevordert de ontwikkeling van atherosclerose, coronaire hart-en vaatziekten en arteriële of veneuze thromboembolisms1. De ontwikkeling van hypertensie, is afhankelijk van de interactie van milieu, genetische, endocriene en hemodynamische factoren. Momenteel, worden immuniteit en verwante ontsteking gewaardeerd om te spelen een belangrijke rol in de etiologie van hypertensie2.
Onder immuuncellen, T lymfocyten en monocyten en macrofagen bleken causaal betrokken in AngII-induced vasculaire ontsteking en hypertensie, gedeeltelijk gerelateerd aan hun vermogen om het activeren van reactieve zuurstof soorten3. Macrophage kolonie-stimulerende factor deficiënte muizen toonde verminderde reactie op AngII met betrekking tot de verhoging van de bloeddruk en vasculaire ontsteking4. In een vorige werk, kunnen we laten zien dat LysM + monocyten vasculaire dysfunctie en ontsteking in AngII-geïnduceerde hypertensie5rijden. Meer onlangs, beschreven we een nieuwe weg in welke coagulatie factor XI werkt met de bloedplaatjes en de vaatwand samen voor het opwekken van trombine-afhankelijke vasculaire ontsteking6. De huidige kennis over de rol van het immune systeem in hypertensie werd onlangs samengevat en beoordeeld door Rodriguez-Iturbe et al. 7
Aangezien de betrokkenheid van immuuncellen in de ontwikkeling van hypertensie bleek, modellen en technieken te bestuderen de interactie tussen het schip en de immuuncellen noodzakelijk geworden. Epifluorescence IVM van de bloedvaten is een nuttig instrument om te observeren in vivo interacties tussen het circulerende bloed cellen en het endotheel8,9,10. Met deze techniek, kan de injectie van kleurstoffen intercalating met DNA (zoals acridine oranje) genucleëerde cellen (circulerende evenals van het endotheel) visualiseren. Geïsoleerde bloedplaatjes gekleurd ex vivo met rhodamin – 6 G of dichlorofluorescein (DCF) kan worden geïnjecteerd om te visualiseren van platelet-rich trombus in arteriële of veneuze letsel modellen.
Meestal een halsslagader katheter wordt gebruikt om te injecteren van verklikstoffen of gemarkeerd bloedplaatjes. Wijziging van het endotheel en verdere activering van de stolling cascade zijn beide bekend dat gevolgen hebben voor monocyt activering. Endothelial letsel leidt onmiddellijk tot bloedplaatjes activering via subendothelial matrix moleculen te verzegelen het weefsel, met de daaruit voortvloeiende monocyt attractie en activering11. Integendeel, is een intact endotheel bekend dat anticoagulatie eigenschappen (bijvoorbeeld via weefsel factor pathway remmer of thrombomodulin)12 en directe remmende effecten op de monocyt, bijvoorbeelddoor middel van de secretie van extracellulaire blaasjes met microRNAs13. Monocyten staan bekend om een factor van weefsel, de extrinsieke activator van de stolling cascade en uitdrukkelijke protease-geactiveerde receptoren (PARs) dat kunnen worden geactiveerd door trombine en deelnemen aan monocyt activering14,15 . Dus, elke activering van bloedplaatjes of van de stolling cascade als gevolg van vasculaire verwonding wellicht onverwachte effecten op monocyt activering en interfereren met de waargenomen fenomeen. Met de hulp van IRG transgene LysM Cre transgene muizen, een dubbel-belichting fluorescerende Cre verslaggever muis (LysMCre+IRG+), stellen wij voor om te studeren in detail het effect van injecties met een katheter en alternatieve methoden op LysM+ MyeloMonocytaire cellen in een muismodel van arteriële hypertensie16.
LysM+ monocyten werden eerder vertoond te worden betrokken bij de ontwikkeling van hypertensie5. Hier laten we zien dat LysM+ immuuncellen rollen en zich aan de endothelial laag in reactie op AngII infusie houden. Deze bevinding werd verkregen met behulp van LysMCre+IRG+ muizen uit onze eerdere studies verkenning van de rol van immuuncellen in hypertensie in vivo door leukocyten met injectie van acridine oranje6,10te visualiseren. Discriminatie van celtypes vast te houden aan het endotheel was dus niet mogelijk.
De GODT is een zeer nuttig hulpmiddel voor vasculaire studies en in vivo waarnemingen van cellen rechtstreeks in de therapieën, maar het effect van het injecteren van kleurstoffen met de hulp van een chirurgisch ingevoegde katheter in de inflammatoire context van hypertensie blijft onbekend. Voor de evaluatie van het potentiële effect van katheter en acridine oranje injectie we profiteerde van de LysMCre+IRG+ muizen. AngII infusie steeg het nummer van het rollend LysM+ cellen aan het endotheel. Inbrengen van een katheter in de halsslagader versterkt het effect en meer etappen te verwezenlijken, daaraan vastzittende leukocyten werden ontdekt in AngII-geïnfundeerd muizen geïnstrumenteerd met een katheter in vergelijking met muizen zonder katheter implantaten. Dit geeft aan dat het implanteren van een carotis katheter wordt een systemische inflammatoire reactie in het kader van wondheling die als overlay met de immune reactie gezien in hypertensie18. Bovendien, als gevolg van de nabijheid van de halsslagader aan de halsslagader zou kunnen een extra immuunactivatie hebben voorgedaan door het beïnvloeden van de halsslagader. Aangezien dit effect niet aanwezig was toen injecties rechtstreeks in de ader van de staart zijn aangebracht, kunnen we ervan uitgaan dat het effect te wijten was niet naar de kleurstof maar naar de procedure voor het invoegen van de katheter. We hier het belang van transgene reporter muizen uiting van fluorescente proteïnen te niet mengen met in vivo processen tijdens experimenten aangetoond. Bovendien, staart veneuze injectie van fluorescerende traceurs misschien wel een mogelijk alternatief voor jugular katheter injecties.
Een kritische stap van de procedure is de AngII infusie. Staart kan manchet de bloeddruk worden beoordeeld om te bepalen van de effectiviteit van AngII levering door de pomp. Bloed druk moet toenemen na 2−3 dagen van infusie. Om te beperken ontsteking die LysM+ cellen activering kan beïnvloeden, moet de sluiting van de incisie waar de pomp is geïmplanteerd met hechtingen in plaats van clips worden gemaakt. Een beperking dient te worden opgemerkt over staart veneuze injectie: om de beste mogelijke data-acquisitie, 4 video’s zijn meestal genomen voor elke halsslagader. Als het fluorescent signaal afneemt, 50 µL van acridine oranje worden geïnjecteerd maar met staart injectie is het moeilijker om verschillende injecties en de carotids om stabiel te houden onder de Microscoop doelstelling. De duur van de aanwezigheid van een katheter in de halsslagader misschien ook de activering van de immune cellen moduleren het invloed heeft op de activering van de stolling in platelet-rich plasma bereid 4 h na de katheter implantatie19. Dit aspect van de katheter implantatie moet verder onderzoek.
Ten slotte, zelfs als we de impact van jugular katheter implantatie op activering van de cel van de LysM+ na AngII infusie waarderen, kan niet volledig schatten we de rol van de voorbereiding, verwijdering van de huid en carotis isolatie op een potentiële LysM+ -cel activering. We concluderen dat het gebruik van fluorescentie reporter muizen zoals de LysMCre+IRG+ muis wordt aanbevolen om onderbrekingen van de integriteit van het schip tijdens de dierlijke voorbereiding voor in vivo imaging te voorkomen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Duitse ministerie voor onderwijs en onderzoek (goedgekeurd 01EO1003 en goedgekeurd 01EO1503).
Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
Braunol | B Braun | ||
Octeniderm | Schülke | ||
Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS – DualView2 MicroImager | |
Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |