Summary
Dette manuskriptet beskriver bruk av transgene reporter mus og ulike administrasjon ruter fluorescerende fargestoffer angiotensin II-induserte hypertensjon ved hjelp intravital video mikroskopi av blodkar evaluere aktivering av immunceller og deres muligheten til å rulle og overholder endotelet.
Abstract
Epifluorescence intravital video mikroskopi (IVM) av blod fartøy er en etablert metode for å vurdere aktivering av immunceller og deres evne til rolle og overholder endothelial laget. Visualisering av sirkulerende celler ved injeksjon av fluorescerende fargestoffer eller fluorophore-kombinert antistoffer er vanlig. Alternativt kan fluorescerende reporter mus brukes. Interaksjoner av leukocytter, i bestemt lysozyme M+ (LysM+) monocytter, med fartøyet veggen spille viktige roller i å fremme vaskulær dysfunksjon og arteriell hypertensjon. Vi presenterer her teknikk for å visualisere og kvantifisere leukocytter rullende og vedheft i carotis arteriene i angiotensin II (AngII)-induserte hypertensjon hos mus ved IVM.
Implantering av et kateter skader den vaskulære veggen og fører til endrede blodlegemer svar. Vi sammenlignet ulike injeksjon teknikker og administrasjon ruter å visualisere leukocytter i en LysMCre+IRG+ musen med utbredt uttrykket røde fluorescerende protein og betingelsesuttrykk grønne fluorescerende protein i LysM + celler. For å studere LysM+ celle aktivering, vi brukte AngII infundert mus rullende og adhesjon av leukocytter til endotelet er økt. Vi injisert enten Akridin oransje bruker en vena kateter eller direkte om halen vene og sammenlignet mengden av rullende og følge celler. Vi fant at jugulare kateter implantasjon sådan økt antall rullende og overholde LysM+ celler i humbug-tilført LysMCre+IRG+ mus sammenlignet med kontrollene. Denne aktiveringen ble utvidet i AngII-tilført mus. Interessant, injisere Akridin oransje direkte gjennom halen blodåre ikke økte LysM+ celleadhesjon eller rulle i humbug-tilført mus. Vi vist dermed betydningen av transgene reporter mus uttrykke fluorescerende proteiner ikke forstyrre i vivo prosesser under eksperimentering. Videre kan hale blodåre injeksjon av fluorescerende tracers være et mulig alternativ til jugulare kateter injeksjoner.
Introduction
Arteriell hypertensjon øker risikoen for hjerte-og karsykdommer og død og fremmer utvikling av aterosklerose, koronar hjertesykdom og venøs eller arteriell thromboembolisms1. Utvikling av hypertensjon, avhenger av samspillet av miljømessige, genetiske, endokrine og hemodynamic faktorer. Foreløpig er immunitet og relaterte betennelse verdsatt for å spille en viktig rolle i etiologien for hypertensjon2.
Blant immunceller, ble T-lymfocytter og monocytter og makrofager funnet for å være causally involvert i AngII-indusert vaskulær betennelser og hypertensjon, delvis knyttet til deres evne til å utløse reaktive oksygen arter3. Macrophage koloni-stimulerende faktor mangelfull mus viste redusert respons til AngII om blodtrykk økning og vaskulær betennelse4. I en tidligere arbeid, kunne vi vise at LysM + monocytter kjøre vaskulær dysfunksjon og betennelser i AngII-induserte hypertensjon5. Nylig beskrev vi en ny sti i hvilke koagulering faktor XI samarbeider med blodplater og fartøyet veggen å indusere trombin-avhengige vaskulære betennelse6. Gjeldende kunnskap om rollen av immunsystemet hypertensjon ble nylig oppsummerte og gjennomgått av Rodriguez-Iturbe et al. 7
Siden involvering av immunceller i utviklingen av hypertensjon ble tydelig, ble modeller og teknikker for å studere samspillet mellom fartøyet og immunceller nødvendig. Epifluorescence IVM av blod fartøy er et nyttig verktøy å observere i vivo samspillet mellom sirkulerende blod celler og endotelet8,9,10. Med denne teknikken, kan injeksjon av fargestoffer intercalating med DNA (for eksempel Akridin oransje) visualisere kjerne celler (sirkulerende samt fra endotelet). Isolert blodplater farget ex vivo med rhodamin - 6 G eller dichlorofluorescein (DCF) kan injiseres for å visualisere blodplater-rich blodpropp i venøs eller arteriell skaden modeller.
Vanligvis et vena jugularis kateter brukes til å injisere tracers eller merket blodplater. Endring av endotelet og påfølgende aktivering av koagulasjonssystemet cascade er begge kjent å ha effekter på monocytt aktivisering. Endothelial skade fører umiddelbart til blodplater aktivisering via subendothelial matrise molekyler å forsegle vevet, med påfølgende monocytt attraksjon og aktivisering11. Tvert imot, er en intakt endotelet kjent for å ha antikoagulerende egenskaper (f.eks via vevet faktoren skoleveien hemmer eller thrombomodulin)12 og direkte hemmende effekt på monocytt, f.eksgjennom utskillelsen av ekstracellulære blemmer som inneholder microRNAs13. Monocytter er kjent for å produsere en vev faktor, ytre aktivatoren koagulasjonssystemet cascade og uttrykke protease-aktivert reseptorer (PARs) som kan aktiveres av trombin og delta i monocytt aktivisering14,15 . Derfor aktivering av blodplater eller koagulasjonssystemet cascade på grunn av vaskulære skader kan ha uventede innvirkninger på monocytt aktivisering og forstyrre observert fenomenet. Med hjelp av IRG transgene LysM Cre transgene mus, en dobbel-fluorescerende grobunn reporter mus (LysMCre+IRG+) foreslår vi å studere i detalj effekten av injeksjoner med et kateter og alternative metoder på LysM+ myelomonocytic celler i en musemodell av arteriell hypertensjon16.
Protocol
Eksperimenter ble utført på mannlige mus alderen 8 til 12 uker gamle under godkjenning av den etiske komiteen på dyr eksperimentering fra Rheinland-Pfalz (Autorisasjonsnummer 23 177-07/G12-1-002 og 23 177-07/G15-1-051).
1. musen anestesi og kirurgi forberedelse
- Før kirurgi, kontrollere god helse og tilstand av dyrene. Før kirurgi, overvåke dyr en gang per dag for 2-3 dager for deres generelle tilstand (utseende, holdning, spontan opptreden) og kroppsvekt, mat og vannforbruk.
- Klargjør master blandingen for anestesi med midazolam (5 mg/kg kroppsvekt), medetomidine (0,5 mg/kg kroppsvekt) og fentanyl (0,05 mg/kg kroppsvekt) til intraperitoneally (IP) injisere 200 µL/30 g musen i 1 mL sprøyte med en 26 G nål.
- Osmotisk pumpe implantasjon og dyr forberedelse til IVM eksperimenter utføres en operasjon-feltet med 39 ° C oppvarming plattform. Sterilisere alle verktøy i desinfeksjon badekar og desinfisere oppvarming plattformen.
- Under prosedyrene, beskytte dyr øynene med øye ointment. Fjerne pelsen med razors før osmotisk pumpe implantasjon. Bruke en hårfjerning krem og bomull vattpinner for isolering av carotis og jugulare kateter implantering IVM eksperimenter. Desinfiser dyr huden med to huden desinfeksjonsmidler: en antiseptisk og desinfeksjonsmidler som inneholder povidon jod og en hud antiseptiske inneholder octenidine i alkohol-basert løsning.
- Klargjør master blandingen å antagonize anestesi ("antisedan mix") med atipamezol (0,05 mg/kg kroppsvekt) og flumazenil (0,01 mg/kgbody vekt), og forberede 200 µL/mus i 1 mL sprøyte med en 26 G nål til å være subcutaneously (SC) injiseres.
2. osmotisk pumpe forberedelse og implantasjon
Merk: Subkutan AngII infusjonen bruker osmotisk pumper ble beskrevet i detalj av Lu et al. 17
- Klargjør AngII ved å gjenoppbygge det lyofiliserte pulveret med sterilt saltvann og justere konsentrasjonen med dyr vekten og leveransetakt av pumpen. Hold den rekonstituerte AngII i plast rør (ikke bruke BILLEDRØR).
- Fyll pumper med AngII løsningen til å levere 1 mg/(kg·d) for 7 dager. Etter utarbeidelse, holde pumpene i sterilt saltvann for 4-6 h minimum på 37 ° C.
- Test av komplett bedøvelsen museklikk etter injeksjon av anestesi blandingen med bakre fot reflekser og plassere den på varme operasjon-feltet. Anestesi induksjon tar 10-15 min og fungerer bedre hvis dyr er satt i et mørkt miljø.
- Barbere nedre baksiden av musen og disinfect det med en alkoholholdige hud antiseptiske.
- Gjøre en 1 cm snitt vinkelrett ryggraden med saks. Opprette en lomme for pumpen bruker en stredet hemostat og sette pumpen (flyte moderator først). Lommen må tillate frie pumpen uten press på såret.
- Lukke såret med suturer og ikke klipp, for å begrense betennelse; deretter rense huden antiseptisk.
- Antagonize av bedøvelsen ved SC injeksjon av 200 µL av antisedan mix og tilbake musen til buret sitt.
- Utføre postoperativ analgesi med buprenorfin (0.075 mg/kg SC) en gang etter operasjonen og on demand avhengig av det dyr opptreden.
3. jugulare kateter implantasjon og carotis forberedelse
- Teste den komplette anestesi museklikk etter injeksjon av av bedøvelsen bland med bakre mat reflekser og plassere bedøvet dyret i dorsal recumbence på 39 ° C kirurgisk plate med en endetarms probe for å opprettholde temperaturen og sette salven over øynene for å beskytte dem under prosedyren.
- Fjerne halsen hår med hår fjerning krem. Bruk en bomullspinne å spre og gni krem for 2 min til håret begynner å falle ut. Etter en ytterligere 2 minutter, Fjern fløte og hår med en slikkepott, og rense huden med en alkoholholdige hud antiseptiske.
- Utføre operasjonen under en stereomicroscope. Lage et 1-1,5 cm langt snitt i huden langs i halsen, 1 cm ved luftrøret. Så gjøre to andre snitt vinkelrett til både ekstremiteter av de første incisions.
- Nøye fjerne vev ved siden av huden og fjern huden dekke venstre vena jugularis og luftrøret.
- Forsiktig isolere parotid kjertel; sublinguale og submaxillary kjertler fra sonen rundt med 2 buet tang. Ikke kutt eller skade kjertler, plassere dem slik at de beste tilgangen til vena jugularis og carotis.
- For å isolere vena jugularis, bruke tynn tang og langsomt åpne og lukke den forsiktig gratis fartøyet fra de omkringliggende vev. Når venen er helt ren, plassere tang under fartøyet og plassere to 7-0 suturer av 10 cm under den.
- Lukk suture proksimale til hodet med to knop. På det andre suture, forberede en knute men ikke lukk det.
- Hold kateter (0,28 mm inne diameter, 0,61 mm ytre diameter) fylt med 37 ° C sterilt saltvann med tang med én hånd; selv med den andre hånden, lag et lite innsnitt i fartøyet med en tynn saks eller en buet 26 G nål. Deretter kateter inn vena jugularis og Lukk knuten to ganger. Lukk suture proksimale til hodet over kateter for å sikre fullstendig immobilisering.
- Å isolere og forberede carotis arteriene, dissekere området dekker luftrøret bruker tynn buet tang.
- Når carotis er gratis fra omkringliggende vev, fjerne nervus vagus (det ser ut som en hvit linje ved carotis) fra fartøyet (men ikke klippe det). Tynn tang kan stengt og sakte åpnes for å mobilisere forsiktig nerve.
- Når begge arterier er helt ren, plasserer tang under den første arteria carotis og plassere en liten svart 3 mm bred x 2,5 cm lengde plast brikke under fartøyet. Det er veldig viktig ikke sprenger fartøyet og kontroller at blodgjennomstrømningen er tilstede når fartøyet holderen er plassert. Plass andre arterien over innehaveren av fartøyet. Hvis musen ikke er plassert direkte under mikroskopet, satt tilbake kjertler over luftrøret og bruker 37 ° C sterilt saltvann for å unngå tørking av sonen.
4. vurdering av rullende og følge leukocytter / LysM + celler med IVM
- Forberede Akridin oransje fra en 2 mg/mL lagerløsning lagret på 20 ° C og fortynne den 1:4 i sterilt saltvann (0,5 mg/mL siste konsentrasjon) i 1 mL sprøyte.
- Teste ulike forhold: (1) injeksjon av Akridin oransje med jugulare kateter; (2) injeksjon av Akridin oransje direkte inn i halen lateral venen (med denne tilstanden ikke jugulare kateter ble implantert); (3) mål uten Akridin oransje bruker fluorescens LysMCre+IRG+ mus (her igjen ingen jugulare kateter ble implantert).
Representative Results
Carotis av LysMCre+IRG+ mus tilført AngII ble observert ved hjelp av IVM. Akridin oransje ble injisert med en jugulare kateter. Vi som mål å se på andelen LysM+ celler i kontakt med vaskulære veggen sammenlignet med alle kjerne sirkulerende celler (som kan også samhandle med fartøyet siden diskriminering av celle type samarbeidsstil fartøyet forble en åpen spørsmål fra våre tidligere arbeid). Ved baseline forårsaker tilstedeværelsen av en jugulare kateter vedheft av LysM+ celler (figur 2A, D). Etter Akridin oransje injeksjon, de samme cellene var fluorescerende, men også endotelceller var fluorescerende (figur 2B, E). Etter reduksjon av bakgrunnen for å begrense endothelial relatert fluorescens, viser data at alle kjerne overholde celler er LysM+ (figur 2C, F); disse resultatene gjelder etter AngII infusjon bekrefter vår tidligere resultater og demonstrere at LysMCre+IRG+ er en god modell å observere effekten av AngII på LysM+ celle aktivering.
Vi vurdert rollen for administrasjon ruter Akridin oransje på LysM+ celle aktivering etter AngII infusjon i LysMCre+IRG+. Etter en uke med AngII infusjon, leukocytter endotelet interaksjoner i carotis arteriene av LysMCre+IRG+ mus ble fotografert og visualisert ved IVM med eller uten Akridin oransje injeksjon via et jugulare kateter eller gjennom halen åre. Uten kateter eller injeksjon, ble bølgende LysM+ celler betydelig økt etter AngII infusjon sammenlignet med ubehandlet mus og vedheft viste en økning (Figur 3). Injeksjon av Akridin oransje med en jugulare kateter økt vedheft og rulle i AngII behandlet mus i større grad sammenlignet med mus uten et kateter (Figur 3). Injeksjon av Akridin oransje i halen blodåre fører til lignende vedheft og rullende sammenlignet med musene som ikke mottok injeksjon av Akridin oransje (Figur 3).
Figur 1. Ordningen for angiotensin II infusjonen og vurdering av LysM+ celler rullende og vedheft i mus. LysMCre+IRG+ mus ble tilført 7 dager AngII og følge samt rullende LysM+ celler over carotis kvantifisert med eller uten injeksjon av Akridin oransje gjennom et kateter, jugulare eller hale vene injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Vurdering av LysM+ celleadhesjon og rulle i carotis arteriene av LysMCre+IRG+ mus. Vedheft av LysM+ celler i LysMCre+IRG+ mus før (A, D) og etter (B, E) Akridin injeksjon via et jugulare kateter. Rød og grønn fluorescens ble registrert, LysM+ celler (i grønt) og glatt muskelceller (i rødt) vises. Etter injeksjon av Akridin orange, endotelceller vises også i grønt, men fjerne bakgrunnen fluorescens tillater bare sirkulerer nucleated celle visualisering (C, F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Evaluering av administrasjonen ruter fluorescerende fargestoffer i angiotensin II tilført LysMCre+IRG+ mus. Kvantifisering av rullende (A) og (B) LysM+ å følge celler i humbug drives eller AngII-tilført dyr og med eller uten injeksjon Akridin oransje ved hjelp av en jugulare kateter eller hale blodåre injeksjon. Representant bilder av ulike forhold (C). Resultatene er gjennomsnittlig ± standardfeil av gjsnitt. 2-veis VARIANSANALYSE ble utført og Bonferronis innlegg hoc test, n = 3-12/grupper. p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
LysM+ monocytter ble tidligere vist å være innblandet i utviklingen av hypertensjon5. Her viser vi at LysM+ immunceller roll og overholder endothelial laget i respons til AngII infusjon. Dette funnet ble innhentet bruker LysMCre+IRG+ mus fra våre tidligere studier utforske rollen immunceller i hypertensjon i vivo ved å visualisere leukocytter med injeksjon av Akridin oransje6,10. Dermed var diskriminering celletyper følge endotelet ikke mulig.
IVM er et svært nyttig verktøy for vaskulær studier og observasjoner i vivo celleområde direkte i er blodkar, men virkningen av sprøytebruk fargestoffer ved hjelp av et kirurgisk innsatte kateter i inflammatorisk sammenheng med hypertensjon er ukjent. Å vurdere den potensielle effekten av kateter og Akridin oransje injeksjon vi tok fordel av LysMCre+IRG+ mus. AngII infusjon økte antallet rullende LysM+ celler til endotelet. Innsetting av et kateter vena jugularis forsterket effekten og mer rullende og overholde leukocytter ble oppdaget i AngII-tilført mus instrumentert med et kateter sammenlignet med mus uten kateter implantater. Dette indikerer at implantering av en carotis kateter forårsaker en systemisk inflammatorisk reaksjon i sammenheng med sårtilheling som ligger over med immunreaksjon sett i hypertensjon18. I tillegg takket være nærheten til vena jugularis til arteria carotis kan en ekstra immun aktivering ha oppstått ved å påvirke vena jugularis. Siden denne effekten ikke var tilstede da injeksjoner ble gjort direkte inn i venen hale, kan vi anta at effekten var ikke fargestoff men prosedyren for å sette inn kateter. Vi vist her betydningen av transgene reporter mus uttrykke fluorescerende proteiner ikke forstyrre i vivo prosesser under eksperimentering. Videre kan hale blodåre injeksjon av fluorescerende tracers være et mulig alternativ til jugulare kateter injeksjoner.
En kritisk trinn i prosedyren er AngII infusjon. Hale mansjett vurdering av blodtrykket kan gjøres for å kontrollere effektiviteten av AngII levering av pumpen. Blodtrykk bør øke etter 2−3 dager av infusjonen. For å begrense betennelse som kan påvirke LysM+ celler aktivisering, bør nedleggelsen av innsnitt der pumpen er implantert gjøres med suturene i stedet for klipp. En begrensning må bemerkes om hale blodåre injeksjon: for å lage best mulig datainnsamling, 4 videoer er vanligvis tatt for hver carotis. Hvis fluorescerende signalet synker, 50 µL av Akridin orange er injisert men med halen injeksjon det er vanskeligere å gjøre flere injeksjoner og å holde carotis stabile mikroskop mål. Varigheten av tilstedeværelsen av et kateter i vena jugularis kan også modulerer immunceller aktiveringen siden det påvirker koagulering aktivering i blodplater-rich plasma forberedt 4T etter kateter implantasjon19. Dette aspektet av kateter implantasjon trenger videre etterforskning.
Til slutt, selv om vi setter pris på virkningen av jugulare kateter implantasjon på LysM+ celle aktivering etter AngII infusjon, ikke vi fullt anslår rollen av forberedelse, hud fjerning og carotis isolasjon på en potensiell LysM+ -celle aktivisering. Vi konkludere med at bruk av fluorescens reporter mus som LysMCre+IRG+ musen anbefales å unngå avbrudd fartøyet integritet under dyr forberedelsene til i vivo bildebehandling.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tysk departementet for utdanning og forskning (BMBF 01EO1003 og BMBF 01EO1503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
| Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
| Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
| Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
| Braunol | B Braun | ||
| Octeniderm | Schülke | ||
| Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
| 7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
| Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
| Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
| Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
| Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager | |
| Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
| Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |
References
- Lewington, S., et al. Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies. Lancet. 360, 1903-1913 (2002).
- Harrison, D. G. The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension. J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).
- Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).
- De Ciuceis, C., et al. Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).
- Wenzel, P., et al. Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction. Circulation. 124, 1370-1381 (2011).
- Kossmann, S., et al. Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension. Sci Transl Med. 9, (2017).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J.
- Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Wenzel, P., et al. Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans. Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).
- Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. Interactions of monocytes and platelets: implication for life. Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).
- Hinsbergh, V. W. Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation. Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).
- Njock, M. S., et al. Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs. Blood. 125, 3202-3212 (2015).
- Colognato, R., et al. Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells. Blood. 102, 2645-2652 (2003).
- Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway. J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: the role of the macrophage. Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).
- Dargaud, Y., et al. Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. , (2017).
