Dette manuskriptet beskriver bruk av transgene reporter mus og ulike administrasjon ruter fluorescerende fargestoffer angiotensin II-induserte hypertensjon ved hjelp intravital video mikroskopi av blodkar evaluere aktivering av immunceller og deres muligheten til å rulle og overholder endotelet.
Epifluorescence intravital video mikroskopi (IVM) av blod fartøy er en etablert metode for å vurdere aktivering av immunceller og deres evne til rolle og overholder endothelial laget. Visualisering av sirkulerende celler ved injeksjon av fluorescerende fargestoffer eller fluorophore-kombinert antistoffer er vanlig. Alternativt kan fluorescerende reporter mus brukes. Interaksjoner av leukocytter, i bestemt lysozyme M+ (LysM+) monocytter, med fartøyet veggen spille viktige roller i å fremme vaskulær dysfunksjon og arteriell hypertensjon. Vi presenterer her teknikk for å visualisere og kvantifisere leukocytter rullende og vedheft i carotis arteriene i angiotensin II (AngII)-induserte hypertensjon hos mus ved IVM.
Implantering av et kateter skader den vaskulære veggen og fører til endrede blodlegemer svar. Vi sammenlignet ulike injeksjon teknikker og administrasjon ruter å visualisere leukocytter i en LysMCre+IRG+ musen med utbredt uttrykket røde fluorescerende protein og betingelsesuttrykk grønne fluorescerende protein i LysM + celler. For å studere LysM+ celle aktivering, vi brukte AngII infundert mus rullende og adhesjon av leukocytter til endotelet er økt. Vi injisert enten Akridin oransje bruker en vena kateter eller direkte om halen vene og sammenlignet mengden av rullende og følge celler. Vi fant at jugulare kateter implantasjon sådan økt antall rullende og overholde LysM+ celler i humbug-tilført LysMCre+IRG+ mus sammenlignet med kontrollene. Denne aktiveringen ble utvidet i AngII-tilført mus. Interessant, injisere Akridin oransje direkte gjennom halen blodåre ikke økte LysM+ celleadhesjon eller rulle i humbug-tilført mus. Vi vist dermed betydningen av transgene reporter mus uttrykke fluorescerende proteiner ikke forstyrre i vivo prosesser under eksperimentering. Videre kan hale blodåre injeksjon av fluorescerende tracers være et mulig alternativ til jugulare kateter injeksjoner.
Arteriell hypertensjon øker risikoen for hjerte-og karsykdommer og død og fremmer utvikling av aterosklerose, koronar hjertesykdom og venøs eller arteriell thromboembolisms1. Utvikling av hypertensjon, avhenger av samspillet av miljømessige, genetiske, endokrine og hemodynamic faktorer. Foreløpig er immunitet og relaterte betennelse verdsatt for å spille en viktig rolle i etiologien for hypertensjon2.
Blant immunceller, ble T-lymfocytter og monocytter og makrofager funnet for å være causally involvert i AngII-indusert vaskulær betennelser og hypertensjon, delvis knyttet til deres evne til å utløse reaktive oksygen arter3. Macrophage koloni-stimulerende faktor mangelfull mus viste redusert respons til AngII om blodtrykk økning og vaskulær betennelse4. I en tidligere arbeid, kunne vi vise at LysM + monocytter kjøre vaskulær dysfunksjon og betennelser i AngII-induserte hypertensjon5. Nylig beskrev vi en ny sti i hvilke koagulering faktor XI samarbeider med blodplater og fartøyet veggen å indusere trombin-avhengige vaskulære betennelse6. Gjeldende kunnskap om rollen av immunsystemet hypertensjon ble nylig oppsummerte og gjennomgått av Rodriguez-Iturbe et al. 7
Siden involvering av immunceller i utviklingen av hypertensjon ble tydelig, ble modeller og teknikker for å studere samspillet mellom fartøyet og immunceller nødvendig. Epifluorescence IVM av blod fartøy er et nyttig verktøy å observere i vivo samspillet mellom sirkulerende blod celler og endotelet8,9,10. Med denne teknikken, kan injeksjon av fargestoffer intercalating med DNA (for eksempel Akridin oransje) visualisere kjerne celler (sirkulerende samt fra endotelet). Isolert blodplater farget ex vivo med rhodamin – 6 G eller dichlorofluorescein (DCF) kan injiseres for å visualisere blodplater-rich blodpropp i venøs eller arteriell skaden modeller.
Vanligvis et vena jugularis kateter brukes til å injisere tracers eller merket blodplater. Endring av endotelet og påfølgende aktivering av koagulasjonssystemet cascade er begge kjent å ha effekter på monocytt aktivisering. Endothelial skade fører umiddelbart til blodplater aktivisering via subendothelial matrise molekyler å forsegle vevet, med påfølgende monocytt attraksjon og aktivisering11. Tvert imot, er en intakt endotelet kjent for å ha antikoagulerende egenskaper (f.eks via vevet faktoren skoleveien hemmer eller thrombomodulin)12 og direkte hemmende effekt på monocytt, f.eksgjennom utskillelsen av ekstracellulære blemmer som inneholder microRNAs13. Monocytter er kjent for å produsere en vev faktor, ytre aktivatoren koagulasjonssystemet cascade og uttrykke protease-aktivert reseptorer (PARs) som kan aktiveres av trombin og delta i monocytt aktivisering14,15 . Derfor aktivering av blodplater eller koagulasjonssystemet cascade på grunn av vaskulære skader kan ha uventede innvirkninger på monocytt aktivisering og forstyrre observert fenomenet. Med hjelp av IRG transgene LysM Cre transgene mus, en dobbel-fluorescerende grobunn reporter mus (LysMCre+IRG+) foreslår vi å studere i detalj effekten av injeksjoner med et kateter og alternative metoder på LysM+ myelomonocytic celler i en musemodell av arteriell hypertensjon16.
LysM+ monocytter ble tidligere vist å være innblandet i utviklingen av hypertensjon5. Her viser vi at LysM+ immunceller roll og overholder endothelial laget i respons til AngII infusjon. Dette funnet ble innhentet bruker LysMCre+IRG+ mus fra våre tidligere studier utforske rollen immunceller i hypertensjon i vivo ved å visualisere leukocytter med injeksjon av Akridin oransje6,10. Dermed var diskriminering celletyper følge endotelet ikke mulig.
IVM er et svært nyttig verktøy for vaskulær studier og observasjoner i vivo celleområde direkte i er blodkar, men virkningen av sprøytebruk fargestoffer ved hjelp av et kirurgisk innsatte kateter i inflammatorisk sammenheng med hypertensjon er ukjent. Å vurdere den potensielle effekten av kateter og Akridin oransje injeksjon vi tok fordel av LysMCre+IRG+ mus. AngII infusjon økte antallet rullende LysM+ celler til endotelet. Innsetting av et kateter vena jugularis forsterket effekten og mer rullende og overholde leukocytter ble oppdaget i AngII-tilført mus instrumentert med et kateter sammenlignet med mus uten kateter implantater. Dette indikerer at implantering av en carotis kateter forårsaker en systemisk inflammatorisk reaksjon i sammenheng med sårtilheling som ligger over med immunreaksjon sett i hypertensjon18. I tillegg takket være nærheten til vena jugularis til arteria carotis kan en ekstra immun aktivering ha oppstått ved å påvirke vena jugularis. Siden denne effekten ikke var tilstede da injeksjoner ble gjort direkte inn i venen hale, kan vi anta at effekten var ikke fargestoff men prosedyren for å sette inn kateter. Vi vist her betydningen av transgene reporter mus uttrykke fluorescerende proteiner ikke forstyrre i vivo prosesser under eksperimentering. Videre kan hale blodåre injeksjon av fluorescerende tracers være et mulig alternativ til jugulare kateter injeksjoner.
En kritisk trinn i prosedyren er AngII infusjon. Hale mansjett vurdering av blodtrykket kan gjøres for å kontrollere effektiviteten av AngII levering av pumpen. Blodtrykk bør øke etter 2−3 dager av infusjonen. For å begrense betennelse som kan påvirke LysM+ celler aktivisering, bør nedleggelsen av innsnitt der pumpen er implantert gjøres med suturene i stedet for klipp. En begrensning må bemerkes om hale blodåre injeksjon: for å lage best mulig datainnsamling, 4 videoer er vanligvis tatt for hver carotis. Hvis fluorescerende signalet synker, 50 µL av Akridin orange er injisert men med halen injeksjon det er vanskeligere å gjøre flere injeksjoner og å holde carotis stabile mikroskop mål. Varigheten av tilstedeværelsen av et kateter i vena jugularis kan også modulerer immunceller aktiveringen siden det påvirker koagulering aktivering i blodplater-rich plasma forberedt 4T etter kateter implantasjon19. Dette aspektet av kateter implantasjon trenger videre etterforskning.
Til slutt, selv om vi setter pris på virkningen av jugulare kateter implantasjon på LysM+ celle aktivering etter AngII infusjon, ikke vi fullt anslår rollen av forberedelse, hud fjerning og carotis isolasjon på en potensiell LysM+ -celle aktivisering. Vi konkludere med at bruk av fluorescens reporter mus som LysMCre+IRG+ musen anbefales å unngå avbrudd fartøyet integritet under dyr forberedelsene til i vivo bildebehandling.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tysk departementet for utdanning og forskning (BMBF 01EO1003 og BMBF 01EO1503).
Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
Braunol | B Braun | ||
Octeniderm | Schülke | ||
Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS – DualView2 MicroImager | |
Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |