Här vi illustrera hur enda molekyl foto-aktiverat lokalisering mikroskopi kan utföras på den motor nerv terminalen av en levande Drosophila melanogaster tredje instar larv.
Ett ökande antal super-resolution mikroskopi tekniker hjälper till att avslöja de mekanismer som reglerar nanoskala cellulära världen. Singel-molekyl imaging är fart eftersom det ger enastående tillgång till visualisering av enskilda molekyler i levande celler. Här, beskriver vi en teknik som vi utvecklat för att utföra enkel-particle tracking foto-aktiverat lokalisering mikroskopi (sptPALM) i Drosophila larver. Synaptiska kommunikation bygger på viktiga presynaptiska proteiner som agerar genom dockning, grundning och främja fusion av signalsubstansen-innehållande vesikler med plasmamembranet. En rad interaktioner mellan protein-protein och protein-lipid reglerar tätt dessa processer och de presynaptiska proteinerna därför uppvisar förändringar i rörlighet är associerad med var och en av dessa viktiga händelser. Undersöka hur rörligheten av dessa proteiner korrelerar med deras fysiologiska funktion i ett intakt levande djur är nödvändig för att förstå deras exakta verkningsmekanism. Utvinna protein rörlighet med hög upplösning i vivo kräver att övervinna begränsningar såsom optisk transparens, tillgänglighet och genomträngningsdjupet. Vi beskriver hur photoconvertible fluorescerande proteiner taggade till presynaptiska proteinet Syntaxin-1A kan visualiseras via liten sned belysning och spåras vid terminalen motor nerv eller längs motorneuronen axon tredje instar Drosophila larv.
Neuronal kommunikation är beroende av neurotransmitterfrigöraren, som uppstår genom reglerade fusion av signalsubstansen-innehållande synaptiska vesikler med plasmamembranet1. Denna process kallas exocytos2,3,4,5,6 är mycket dynamisk och kan upp – eller ner-reglerade enligt variationer i graden av stimulering7. Proteinerna som är inblandade i dessa processer är föremål för Brownsk rörelse, och därför visar halvledarkomponent organisation kan upprätthålla en rad bindande åtgärder som stärker dessa fysiologiska funktioner. Plasmamembranet proteiner är mycket dynamisk, vilket gör att laterala svällning av molekyler i nanoclusters på plasmamembranet7,8,9,10,11, 12. Som sådan, undersöker rörlighet av dessa proteiner bidrar till att belysa deras verkningssätt åtgärd8. Synaptic proteiner såsom de lösliga N-ethylmaleimide känslig faktor fastsättning protein receptorerna (snaror), till exempel Syntaxin-1A, är nu känt att uppvisar laterala snabb rörlighet samt laterala svällning inom nanoclusters som kan fungera som molekylära depåer och platser för vesikler fusion9,13,14,15.
Den senaste utvecklingen av photoconvertible fluorescerande proteiner, såsom monomer (m) Eos16,17 och Kaede18, har tillåtit halvledarkomponent resolutionen av nervcellernas plasmamembran proteiner med hjälp av metoder sådana som foto-aktiverat lokalisering mikroskopi (PALM) och stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)14,15,19. Denna utveckling har aktiverat utredningar av rörlighet och nanoclustering av biologiska proteiner i odlade levande celler och nervceller. Mer nyligen, studier har genomförts för att belysa (vid liknande höga upplösningar) dynamik och organisationen av dessa membranproteiner i nervceller i levande intakt organismer sådan Mus musculus, Caenorhabditis elegans, och Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Undersöker dynamics och organisationen av ett protein i vivo kräver inte bara använda de nyutvecklade super-upplösning imaging verktyg (såsom PALM, STORM och photoconvertible fluorophores), men också förmågan att övervinna hinder sådan som hjälpmedel av proteinet och genomträngningsdjupet av imaging lasern. Imaging intracellulära proteiner hos intakta djur är till sin natur utmanande som imaging proteiner på strukturer inbäddad djupt i levande vävnader av intakta djur, såsom hippocampus av en intakt mus. Proteiner på eller nära ytan av vävnaden är därför lättare avbildas. En annan svårighet med imaging i vivo är att säkerställa reproducerbarhet över djuren. Som anatomi skiljer sig från ett prov till den andra, att välja en struktur med lätthet av replikering i olika intakta djur prover skulle också kunna vara utmanande. Användning av stereotypa strukturer, såsom synapser, hjälpa till med att övervinna några av dessa svårigheter.
Nyligen genomförda studier har avbildats protein rörlighet hos djur med en optiskt transparent epidermis såsom Caenorhabditis elegans22, medan andra undersökningar har avbildats protein organisation på ytan av en vävnad/organ, till exempel aktin imaging i kortikala nervceller genom skallen av en levande mus21. I vissa fall har anestetika använts för att hålla djuret orörliga; specifika bedövningsmedel kan dock inverka proteinet av intresse. Alternativa metoder för att hålla djur orörliga under i vivo imaging bör därför undersökas för att minimera fel.
En annan varning till super-upplösning imaging i vivo är att lasrar används för att belysa proteinerna av intresse negativt kan påverka den omgivande vävnaden, och därmed hålla excitation intensiteten så låg som möjligt rekommenderas. Belysning i den omgivande vävnaden av lasern tenderar också att öka bakgrunden signalen. Användning av låg excitation intensitet hjälper till att reducera bakgrunden, förbehållet att det också kan leda till en minskning av fluorescerande protein photon avkastning. Bakgrunden subtraktion under analysen kan användas som ett alternativ innebär att minska bakgrunden signalen före bildanalys.
Drosophila presenterar en idealisk organism för i vivo imaging eftersom det ger väl etablerade genetiska verktyg för utredning av specifika proteinfunktion. Uppströms aktiverande sekvensen (UAS)-Gal4 systemet medger tidsmässiga och rumsliga uttryck av proteiner och kan därför användas för att manipulera neurotransmission23, sådan att thermo-genetiska stimulering använda Drosophila övergående receptorn potentiella undergrupp A1 (dTRPA1)24 eller opto-genetiska stimulering använder far-red-skiftade CsChrimson25 kan kombineras med imaging14. Vi har övervunnit många av komplikationerna av utför i vivo singel-molekyl imaging i detta system och nu beskriva hur singel-particle tracking kan utföras i Drosophila melanogaster tredje instar larver.
Det här protokollet beskriver singel-molekyl spårning av mEos2-märkta proteiner vid den neuromuskulära förbindelsen för Drosophila tredje instar larven. För att undvika alltför uttryck av transgena proteinet, drevs Syntaxin-1A-mEos2 uttryck av endogena Syntaxin-1A arrangören. Studier av synaptic protein rörlighet har mestadels begränsats till in vitro- undersökningar av odlade celler och kortikala nervceller9,11,12,13. Huruvida dessa proteiner uppvisar liknande rörlighet signaturer i ett levande djur är till stor del okända. För att visualisera single-protein rörlighet i vivo, har begränsningar såsom optiskt djup på öppenhet, tillgänglighet och penetration att övervinna. Genom att dissekera larval beredning och visualisera de neuromuskulära korsningar inbäddade på ytan av muskeln, undvika vi frågan om optisk transparens och tillgänglighet. Försök att bild singel-molekyl rörlighet i normal Frida konfiguration visat sig framgångsrik. Dock tillåter användning av något sned belysning för ökad excitation laser tränger djup. Dessutom minutien stiften används för att immobilisera larven bidragit till att undvika möjliga negativa effekter av bedövningsmedel användning på protein rörlighet. Det är möjligt att använda högre förstoringsgrad, såsom 100 x olja nedsänkning mål, för att visualisera enstaka molekyler i vivo. Men kan ökad förstoring öka förekomsten av drivorna ur fokus. Dessutom har vi använt en lägre intensitet (~ 30%) 561 nm laser lyckat att bilden enstaka molekyler vid motor nerv terminaler. Ytterligare tester krävas att använda lägre lasereffekt.
Detta protokoll är lämplig att visualisera rörlighet synaptic proteiner inom närheten av neuronala plasmamembranet. Använder denna metod, rörlighet av proteinet SNARA – Syntaxin-1A och autophagosome bunden protein Atg18a – har varit framgångsrikt avbildad i vivo14,26. Rörlighet för proteiner på motorneuronen axoner kan också vara undersökt27. Utredning av proteiner i hjärnan eller ventrala nerv sladd rörlighet kan emellertid visa sig svårt att bedöma på grund av den höga bakgrund signal produceras av underliggande vävnad; Dessutom visualisera protein rörlighet på samma hjärnstruktur kommer att kräva fluorescently taggning hjärnans struktur (för att säkerställa replikerbarhet), och användningen av dual-kamera imaging skulle behövas.
Nuvarande metoder tillgängliga för super-resolution mikroskopi i Drosophila är mestadels begränsad till imaging embryon, snarare än mer utvecklade tredje instar larv38,39. Den viktigaste frågan med dessa protokoll är att de ger ett lågt antal banor i området avbildas, och därmed förhindra fördjupad analys av rörlighet har22,40. Vår i vivo enda molekyl spårning protokoll har kapacitet att generera ett stort antal banor, och kan därför användas i andra djurmodeller som Caenorhabiditis elegans och zebrafisk. Faktiskt genereras varje NMJ kedja ~ 2400 banor vilket gör den lämplig för att analysera de olika mobila staterna och övergångar mellan dessa stater14,27. Dessutom beroende många i vivo enda molekyl imaging strategier av användning av bedövningsmedel att immobilisera djur20,22, som kan påverka fysiologiska funktionen som bildtagning sker. Här optimerat vi en ‘anestesi-fri’ protokoll för att immobilisera larverna med minutien stift.
En möjlig användning av detta protokoll kan vara för att visualisera rörlighet av proteiner i tre dimensioner. Senaste framstegen inom super-resolution mikroskopi tillåta protein rörlighet vara visualiserade i vitro i ‘x’, ‘y’, och ‘z’ mått41,42. Vår nuvarande metoden tar inte hänsyn till rörligheten för proteiner i ‘z’-axeln. Ännu Drosophila motoriska nerven terminal är en sfärisk struktur och en värdefull framtida strategi kommer att vara att kvantifiera protein rörlighet i en tredimensionell volym43. Bildbehandling i z-dimensionen är genomförbart använder en astigmatisk lins. Alternativt i Frida läge44,45ökas z-upplösningen också. Men i våra experiment, har vi använt något sned belysning för att visualisera enstaka molekyler av syntaxin1A-mEos2 utan astigmatisk objektivet.
Sammanfattningsvis, tillgänglighet i båda transgena Drosophila flyga lager uttrycker proteiner märkta med ett photoconvertible protein, en PDMS bas att dissekera transgena larven, samt Frida Mikroskop utrustat med möjligheten att ändra den vinkeln på belysningen är de viktigaste verktygen som behövs för att visualisera inre proteiner som beskrivs i detta protokoll.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Jean-Baptiste Sibarita och Daniel Choquet (IINS, CNRS/University of Bordeaux) för deras vänliga stöd med singel-molekyl analysen. Vi tackar särskilt Nick Valmas och Jessica Mcgaw (QBI, University of Queensland) för deras hjälp med video inspelning, voice-over samt figur grafisk design. Detta arbete stöds av projektet australiensisk forskning rådet (AR) upptäckt (DP170100125 till Forsberg.), australiska forskningsrådet (LIEF Grant LE0882864 till Forsberg.), framtiden Fellowship (FT100100725 till B.V.S.), australiska forskningsrådet (LIEF Grant LE130100078 till Forsberg.) och NHMRC projektanslag (APP1103923 till B.V.S.). Forsberg är en NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).
PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |