Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.
Een toenemend aantal super resolutie microscopie technieken helpen bij het ontdekken van de mechanismen die de nanoschaal cellulaire wereld regeren. Single-molecuul imaging is goed op stoom als het biedt uitzonderlijke toegang tot de visualisatie van individuele moleculen in levende cellen. Hier beschrijven we een techniek die we ontwikkeld om uit te voeren single-deeltje tracking foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (sptPALM) in Drosophila larven. Synaptic mededeling berust op belangrijke presynaptische eiwitten die handelen door docking, priming en bevordering van de fusie van de neurotransmitter-bevattende blaasjes met het plasma-membraan. Een bereik van eiwit-eiwit en lipide-eiwit interacties strak regelt deze processen en de presynaptische eiwitten vertonen daarom wijzigingen in mobiliteit die is gekoppeld aan elk van deze belangrijke gebeurtenissen. Onderzoeken hoe de mobiliteit van deze proteïnen correleert met hun fysiologische functie in een intact levend dier is essentieel om te begrijpen hun precieze werkingsmechanisme. Winning van eiwit mobiliteit met hoge resolutie in vivo vereist het overwinnen van de beperkingen zoals optische transparantie, toegankelijkheid en diepte van de penetratie. We beschrijven hoe photoconvertible fluorescerende eiwitten gelabeld aan de presynaptische proteïne Syntaxin-1A kan worden gevisualiseerd via lichte schuine verlichting en bijgehouden op de motorische zenuw terminal of langs de motor neuron axon van de derde instar Drosophila larve.
Neuronale communicatie is afhankelijk van de neurotransmitter release, die door de gereglementeerde fusie van synaptische vesikels neurotransmitter-bevattende met het plasmamembraan1 ontstaat. Dit proces genoemd exocytose2,3,4,5,6 is zeer dynamisch en kan up – of down-geregeld volgens schommelingen in het tempo van de stimulatie7. De eiwitten die betrokken zijn bij deze processen zijn onderworpen aan de Brownse beweging, en daarom nanoscopische organisatie staat voor het behoud van een aantal bindende acties die ten grondslag liggen aan deze fysiologische functies weer te geven. Plasma membraaneiwitten zijn zeer dynamisch, waardoor laterale overlapping van moleculen in nanoclusters op het plasmamembraan7,8,9,10,11, 12. Als zodanig, helpt onderzoekt de mobiliteit van deze eiwitten hun wijze van actie8ophelderen. Synaptic eiwitten zoals de oplosbare N-ethylmaleimide gevoelige factor bijlage eiwit receptoren (SNAREs), bijvoorbeeld Syntaxin-1A, is nu bekend dat ze vertonen laterale snelle mobiliteit, alsmede zijdelingse overlapping binnen nanoclusters die als moleculaire dienen kan depots en sites voor vesikel fusion9,13,14,15.
De recente ontwikkeling van photoconvertible fluorescerende eiwitten, zoals monomeer (m) Eos16,17 en Kaede18, heeft toegestaan de nanoscopische resolutie van neuronale plasmamembraan eiwitten door het gebruik van benaderingen dergelijke als foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) en stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)14,15,19. Deze ontwikkelingen hebben ingeschakeld onderzoeken naar de mobiliteit en de nanoclustering van biologische eiwitten in gekweekte levende cellen en neuronen. Meer recentelijk, studies zijn verricht ophelderen (bij vergelijkbare hoge resoluties) de dynamiek en de organisatie van deze membraaneiwitten in de neuronen van levende intact organismen dergelijke Mus musculus, Caenorhabditis elegans, en Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Onderzoeken van de dynamiek en de organisatie van een proteïne in vivo vereist niet alleen gebruik van de onlangs ontwikkelde super resolutie beeldvormende instrumenten (zoals PALM, STORM en photoconvertible fluorophores), maar ook het vermogen om dergelijke belemmeringen overwinnen Als de toegankelijkheid van het eiwit en de diepte van de penetratie van de beeldvorming laser. Imaging van intracellulaire eiwitten in een intact dier is inherent uitdagend zoals eiwitten op structuren diep in levende weefsels van het intact dier, zoals de hippocampus intact muizen ingesloten is imaging. Vandaar, eiwitten op of dicht bij het oppervlak van het weefsel zijn gemakkelijker beeld. Een ander probleem met in vivo imaging is bij het waarborgen van reproduceerbaarheid over dieren. Ook de anatomie kan afwijken van één monster naar de andere, het selecteren van een structuur met gemak van replicatie in verschillende intact dierlijke monsters zou kunnen blijken uitdagend. Het gebruik van stereotiepe structuren, zoals synapses, helpen met een aantal van deze moeilijkheden te overwinnen.
Recente studies hebben beeld eiwit mobiliteit bij dieren met een optisch transparante epidermis zoals Caenorhabditis elegans22, terwijl andere onderzoeken hebben bijvoorbeeld eiwit organisatie op het oppervlak van een weefsel/orgel, beeld actin imaging in corticale neuronen via de schedel van een levende muis21. In sommige gevallen, zijn verdoving gebruikt om te houden van het dier immobiel; echter kunnen specifieke verdoving negatief beïnvloeden de proteïne van belang. Alternatieve middelen om te houden van dieren immobiel tijdens in vivo imaging moeten daarom worden onderzocht om te minimaliseren van de fout.
Een andere valkuil super resolutie imaging in vivo is dat de lasers die gebruikt voor het verlichten van de proteïnen van belang het omringende weefsel ongunstig kunnen beïnvloeden, en vandaar de excitatie-intensiteit zo laag mogelijk te houden wordt aanbevolen. Verlichting van het omringende weefsel door de laser ook de neiging om het signaal van de achtergrond. Het gebruik van lage excitatie-intensiteit vermindert de achtergrond, het voorbehoud wordt het kan ook leiden tot een afname van de fluorescente proteïne foton opbrengst. Aftrekken van de achtergrond tijdens de analyse kan worden gebruikt als een alternatief middel om het signaal van de achtergrond voorafgaand aan beeldanalyse.
Drosophila presenteert een ideale organisme voor in vivo imaging aangezien deze gevestigde genetische hulpmiddelen voor het onderzoek van specifieke eiwitfunctie biedt. De upstream activerend volgorde (UAS)-Gal4 systeem kunt temporele en ruimtelijke uitdrukking van eiwitten en kan daarom worden gebruikt om te manipuleren transmissie23, zodanig dat thermo-genetische stimulatie via Drosophila voorbijgaande receptor potentiële subgroep A1 (dTRPA1)24 of opto-genetische stimulatie met behulp van de far-rode-verschoven CsChrimson25 kan worden gecombineerd met imaging14. We hebben veel van de complicaties van het uitvoeren van in vivo single-molecuul imaging in dit systeem overwonnen en nu beschrijven hoe single-deeltje bijhouden kan worden uitgevoerd in Drosophila melanogaster derde instar-larven.
Dit protocol beschrijft één-molecuul bijhouden van mEos2-gelabelde proteïnen in de motorische eindplaat van de Drosophila derde instar larve. Voorkom overmatige expressie van transgene eiwit, werd Syntaxin-1A-mEos2 expressie gedreven door endogene Syntaxin-1A promotor. Studies van synaptic eiwit mobiliteit zijn meestal beperkt tot in vitro onderzoeken bij gekweekte cellen en corticale neuronen9,11,12,13. Of deze proteïnen vergelijkbaar mobiliteit handtekeningen in een levend dier vertonen is grotendeels onbekend. Om te visualiseren single-eiwit mobiliteit in vivo, beperkingen zoals optische diepte van de transparantie, toegankelijkheid en penetratie overwonnen moeten worden. Door de ontrafeling van de larvale voorbereiding en visualiseren van de neuromusculaire kruispunten ingesloten op het oppervlak van de spier, vermijden we de kwestie van de optische transparantie en toegankelijkheid. Pogingen om te afbeelding single-molecuul mobiliteit in normale TIRF configuratie bewezen mislukt. Echter zorgt gebruik van enigszins schuin verlichting voor verhoogde excitatie laser doordringing van diepte. Bovendien hielp de pinnen van de minutien gebruikt voor het immobiliseren van de larve te vermijden van elke mogelijke nadelige effect van verdoving gebruik op eiwit mobiliteit. Het is mogelijk om hogere vergroting doelstellingen, zoals de 100 x olie onderdompeling doelstellingen, gebruiken om te visualiseren van afzonderlijke moleculen in vivo. Grotere vergroting kan echter het voorkomen van driften onscherp toenemen. Daarnaast hebben we een lagere intensiteit (~ 30%) gebruikt 561 nm laser met succes naar de afzonderlijke moleculen van de afbeelding bij motorische zenuw terminals. Aanvullende tests kan worden vereist om lagere laser macht te gebruiken.
Dit protocol is geschikt voor het visualiseren van de mobiliteit van synaptic eiwitten in de nabijheid van de neuronale plasmamembraan. Met behulp van deze aanpak, de mobiliteit van de SNARE-eiwit – Syntaxin-1A en de autophagosome gebonden eiwit Atg18a – geweest met succes verbeelde in vivo14,26. De mobiliteit van eiwitten op motor neuron axonen kunnen ook worden onderzocht27. Onderzoek van de mobiliteit van eiwitten op de hersenen of de ventrale zenuw snoer blijken echter moeilijk in te schatten als gevolg van het signaal van de hoge achtergrond geproduceerd door het onderliggende weefsel; Daarnaast visualiseren van eiwitten mobiliteit op de dezelfde hersenstructuur vergt fluorescently tagging de hersenstructuur (zodat de dupliceerbaarheid), en gebruik van dual-camera imaging nodig zou zijn.
Huidige beschikbare methoden voor super-resolutie microscopie in Drosophila zijn meestal beperkt tot imaging embryo’s, in plaats van de meer ontwikkelde derde instar larve38,39. Het belangrijkste probleem met deze protocollen is dat ze opbrengen van een laag aantal trajecten op het gebied van beeld, en vandaar diepgaande analyse van mobiliteit Staten22,40 voorkomen. Onze in-vivo enkel molecuul volgen protocol heeft de capaciteit voor het genereren van een groot aantal trajecten en kan daarom worden gebruikt in andere dierlijke modellen zoals Caenorhabiditis elegans en zebravissen. Inderdaad, elke keten NMJ gegenereerd ~ 2.400 trajecten makend het geschikt is voor het analyseren van de verschillende mobiele Staten en de overgangen tussen deze Staten14,27. Veel in vivo enkel molecuul imaging strategieën is bovendien afhankelijk van het gebruik van verdoving te immobiliseren van de dieren20,22, waardoor de fysiologische functie, waaronder de beeldvorming wordt gedaan kan worden gewijzigd. We geoptimaliseerd hier een protocol ‘anesthesie-vrij’ om te immobiliseren van de larven met minutien pinnen.
Een mogelijke toepassing van dit protocol kan worden voor het visualiseren van de mobiliteit van eiwitten in drie dimensies. Recente vooruitgang in super resolutie microscopie toestaan eiwit mobiliteit gevisualiseerde in vitro in ‘x’, ‘y’, en ‘z’ afmetingen41,42. Onze huidige methode houdt geen rekening met de mobiliteit van eiwitten in de ‘z’-as. Nog de Drosophila motorische zenuw terminal is een bolvormige structuur en een waardevolle toekomstige aanpak zal te kwantificeren eiwit mobiliteit in een driedimensionale volume43. Beeldvorming in de z-dimensie is haalbaar met behulp van een astigmatic lens. U kunt ook in TIRF modus44,45, is de z-resolutie ook verhoogd. In onze experimenten, hebben wij echter iets schuin verlichting gebruikt om te visualiseren van afzonderlijke moleculen van syntaxin1A-mEos2 zonder de astigmatic lens.
Kortom, beschikbaarheid van zowel een transgene Drosophila vliegen voorraad uiting van eiwitten gelabeld met een photoconvertible eiwit, een basis PDMS te ontleden de transgene larve, evenals een TIRF Microscoop uitgerust met de mogelijkheid van het wijzigen van de hoek van verlichting zijn de belangrijkste instrumenten die nodig zijn voor het visualiseren van één eiwitten zoals beschreven in dit protocol.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Jean-Baptiste Sibarita en Daniel Choquet (IINS, CNRS/Universiteit van Bordeaux) voor hun vriendelijke ondersteuning met de analyse van de single-molecuul. Wij danken vooral Nick Valmas en Jessica Mcgaw (QBI, Universiteit van Queensland) voor hun hulp bij de video opname, voice-over, alsmede figuur van grafisch ontwerp. Dit werk werd gesteund door het Australische onderzoek Raad (AR) ontdekking project (DP170100125 F.A.M.), de Australian Research Council (LIEF Grant LE0882864 F.A.M.), toekomst Fellowship (FT100100725 naar B.V.S.), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078 naar F.A.M.) en NHMRC Project verlenen (APP1103923 naar B.V.S.). F.A.M. is een NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).
PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |