Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.
Um número crescente de técnicas de microscopia de super-resolução está ajudando a desvendar os mecanismos que regem o mundo celular nanoescala. Imagem de único-molécula está ganhando força como ele fornece acesso excepcional para a visualização de moléculas individuais em pilhas vivas. Aqui, descrevemos uma técnica que desenvolvemos para executar o rastreamento da único-partícula microscopia de Localização foto-ativado (sptPALM) em larvas de Drosophila . Comunicação sináptica se baseia em proteínas pré-sináptica chaves que atuam por encaixe, primer e promover a fusão do neurotransmissor contendo vesículas com a membrana plasmática. Uma gama de interações proteína-proteína e proteína-lipídio firmemente regula esses processos e as proteínas pré-sináptica, portanto, apresentam alterações na mobilidade associada com cada um desses eventos chaves. Investigar como mobilidade destas proteínas correlaciona-se com sua função fisiológica em um animal vivo intacta é essencial para a compreensão de seu mecanismo preciso de ação. Extração de mobilidade de proteína com alta resolução na vivo requer superar limitações como transparência óptica, acessibilidade e profundidade de penetração. Descrevemos como photoconvertible proteínas fluorescentes marcadas à pré-sináptica proteína Syntaxin-1A pode ser visualizado através de ligeira iluminação oblíqua e rastreadas no terminal do nervo motor ou ao longo do axônio do neurônio motor do terceiro ínstar drosófila larva.
A comunicação baseia-se na liberação de neurotransmissores, que ocorre através da fusão regulamentada de neurotransmissor contendo vesículas sinápticas com a membrana plasmática1. Este processo chamado exocitose2,3,4,5,6 é altamente dinâmico e pode ser de cima – ou para baixo-regulado de acordo com as flutuações da taxa de estimulação7. As proteínas envolvidas nesses processos estão sujeitos a movimento browniano e, portanto, exibir nanoscópico organização capaz de sustentar uma gama de ações que sustentam essas funções fisiológicas de vinculação. Proteínas de membrana plasmática são altamente dinâmicas, permitindo o ajuste de registro lateral de moléculas em nanoclusters na membrana plasmática7,8,9,10,11, 12. Como tal, investigando a mobilidade destas proteínas ajuda a elucidar o seu modo de ação8. Sinápticas proteínas como os solúvel N-proteà fator acessório proteína receptores (armadilhas), por exemplo Syntaxin-1A, são conhecidas por apresentar mobilidade rápida lateral, bem como lateral armadilhas dentro de nanoclusters que possam servir como molecular depósitos e sites para vesículas fusão9,13,14,15.
O desenvolvimento recente de proteínas fluorescentes photoconvertible, tais como monomérico (m) Eos16,17 e Kaede18, permitiu a resolução nanoscópico das proteínas de membrana de plasma neuronal através da utilização de abordagens tais como microscopia Localização foto-ativado (PALM) e reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)14,15,19. Estes desenvolvimentos permitiram investigações sobre a mobilidade e a nanoclustering de proteínas biológicas em culturas de células vivas e os neurônios. Mais recentemente, têm sido realizados estudos para elucidar (em similares em alta resolução) a dinâmica e a organização destas proteínas de membrana nos neurônios de organismos vivos intactos tais Mus musculus, Caenorhabditis elegans e Melanogaster da drosófila14,20,21,22.
Investigar a dinâmica e a organização de uma proteína na vivo requer não só a utilização das ferramentas de imagem recentemente desenvolvido Super-resolução (como fluorophores PALM, tempestade e photoconvertible), mas também a capacidade de superar obstáculos tais como a acessibilidade da proteína e a profundidade de penetração do laser de imagem. Imagem latente proteínas intracelulares em um animal intacto é inerentemente desafiadora como é imagem de proteínas em estruturas incorporadas profundamente dentro de tecidos vivos do animal intacto, tais como o hipocampo de um rato intacto. Portanto, proteínas sobre ou perto da superfície do tecido são mais facilmente fotografadas. Outra dificuldade com imagem latente na vivo é no sentido de garantir reprodutibilidade através de animais. Como a anatomia de uma amostra pode diferir para o outro, selecionar uma estrutura com facilidade de replicação em diferentes amostras animais intactas pode também constituir um desafio. O uso de estruturas estereotipadas, tais como as sinapses, ajudar a superar algumas destas dificuldades.
Estudos recentes têm fotografado mobilidade de proteína em animais com uma epiderme opticamente transparente como Caenorhabditis elegans22, enquanto outras investigações têm fotografado organização de proteína na superfície de um tecido/órgão, por exemplo imagem de actina em neurônios corticais através do crânio de um rato ao vivo21. Em alguns casos, anestésicos têm sido utilizados para manter o animal imóvel; no entanto, anestésicos específicos podem afetar adversamente a proteína de interesse. Meios alternativos para manter animais imóvel durante a imagem latente na vivo , portanto, devem ser explorados para minimizar o erro.
Outra ressalva a Super-resolução de imagem na vivo é que os lasers usados para iluminar as proteínas de interesse poderiam afetar adversamente o tecido circundante, e, portanto, manter a intensidade da excitação mais baixa possível é recomendado. Iluminação do tecido circundante pelo laser também tende a aumentar o sinal de fundo. O uso de intensidade baixa excitação ajuda a reduzir o plano de fundo, a advertência, sendo também pode levar a uma diminuição do rendimento de fóton de proteína fluorescente. Subtração de fundo durante a análise pode ser usada como um meio alternativo reduzir o sinal de fundo antes da análise de imagem.
Drosófila apresenta um organismo ideal para na vivo de imagens que fornece ferramentas de genéticas bem estabelecidas para a investigação da função da proteína específica. A sequência de ativação upstream (UAS)-sistema Gal4 permite a expressão temporal e espacial das proteínas e, portanto, pode ser usado para manipular a neurotransmissão23, tal que estimulação thermo-genética utilizando drosófila transitória família de sub potenciais receptores A1 (dTRPA1)24 ou estimulação opto-genética usando far-vermelhos-desloc CsChrimson25 pode ser combinada com imagem14. Nós superaram muitas das complicações da realização na vivo de imagem único-molécula neste sistema e agora descrever como único-partícula de rastreamento pode ser realizado em Drosophila melanogaster terceiro ínstar larvas.
Este protocolo descreve rastreamento único-molécula de proteínas mEos2-etiquetadas na junção neuromuscular da drosófila terceiro ínstar larva. Para evitar a sobre-expressão da proteína transgénica, Syntaxin-1A-mEos2 expressão foi guiado por promotor endógeno de Syntaxin-1A. Estudos de mobilidade de proteína sináptica na maior parte foram limitados às investigações em vitro de culturas de células e neurônios corticais9,11,12,13. Se estas proteínas apresentam assinaturas semelhantes de mobilidade em um animal vivo é desconhecida. Para visualizar a mobilidade de single-proteína na vivo, limitações, tais como a profundidade de penetração, acessibilidade e transparência óptica têm que ser superados. Dissecando a preparação larval e visualizando as junções neuromusculares incorporadas na superfície do músculo, evitamos a questão da transparência óptica e acessibilidade. Tentativas de mobilidade de único-molécula imagem na configuração normal TIRF provou ser um fracasso. No entanto, o uso de iluminação ligeiramente oblíqua permite para laser de excitação maior profundidade de penetração. Além disso, os pinos de minutien usados para imobilizar a larva ajudaram a evitar qualquer possível efeito adverso do uso anestésico na mobilidade de proteína. É possível usar mais elevados objectivos de ampliação, tais como a 100x objectivos de imersão de óleo, para visualizar moléculas simples em vivo. No entanto, maior ampliação pode aumentar a ocorrência de deriva fora de foco. Além disso, nós usamos uma intensidade mais baixa (~ 30%) 561 nm laser com êxito para moléculas simples de imagem nos terminais do nervo motor. Testes adicionais podem ser obrigado a usar a menor potência de laser.
Este protocolo é apropriado para visualizar a mobilidade das proteínas sinápticas dentro a proximidade da membrana plasmática neuronal. Usando essa abordagem, a mobilidade das proteínas SNARE – Syntaxin-1A e o autophagosome ligado a proteína Atg18a – foram com êxito a imagem em vivo14,26. A mobilidade das proteínas em neurônio motor axônios também podem ser investigado27. No entanto, a investigação da mobilidade de proteínas no cérebro ou cordão nervoso ventral pode revelar-se difícil avaliar devido o sinal de fundo elevado produzido pelo tecido subjacente; Além disso, visualizando a mobilidade de proteína na estrutura do cérebro mesmo exigirá a marcação fluorescente a estrutura do cérebro (para garantir a replicabilidade) e uso de imagem de câmera dupla seria necessário.
Métodos atuais disponíveis para microscopia de super-resolução em Drosophila limitam-se principalmente aos embriões de imagens, em vez do mais desenvolveram de terceiro ínstar larva38,39. O principal problema com estes protocolos é que eles produzem um número baixo de trajetórias na área de criação da imagem e, portanto, evitar a análise aprofundada de mobilidade Estados22,40. Nossa na vivo única molécula protocolo de rastreamento tem a capacidade de gerar um elevado número de trajetórias e, portanto, poderia ser usada em outros modelos animais como Caenorhabiditis elegans e zebrafish. Com efeito, cada cadeia MNJ gerados 2.400 ~ trajetórias, tornando-o adequado para analisar os diferentes Estados móveis e as transições entre esses Estados14,27. Além disso, muitos na vivo estratégias de imagem-única molécula contam com o uso de anestésicos para imobilizar os animais20,22, que pode alterar a função fisiológica, sob a qual a imagem é feita. Aqui nós aperfeiçoamos um protocolo ‘anestesia-free’ para imobilizar as larvas usando pinos minutien.
Um uso potencial do presente protocolo pode ser para poder visualizar a mobilidade das proteínas em três dimensões. Recentes avanços na microscopia de super-resolução permitem mobilidade de proteína ser visualizado em vitro no ‘x’, ‘y’ e ‘z’ dimensões41,42. Nosso método atual não leva em conta a mobilidade das proteínas no eixo ‘z’. Ainda o drosófila terminal nervoso motor é uma estrutura esférica e uma abordagem valiosa do futura será para quantificar a mobilidade de proteína em um volume tridimensional,43. Imagem latente na dimensão z é viável usando uma lente astigmático. Alternativamente, em TIRF modo44,45, o z-resolução também é aumentado. No entanto, em nossos experimentos, nós usamos iluminação ligeiramente oblíqua para visualizar moléculas simples de syntaxin1A-mEos2 sem a lente astigmática.
Em conclusão, a disponibilidade de ambos um transgénico Drosophila voar estoque expressando proteínas marcados com uma proteína photoconvertible, uma base de PDMS para dissecar a larva transgênica, bem como um microscópio TIRF equipado com a possibilidade de mudar o ângulo de iluminação são as mais importantes ferramentas necessárias para visualizar proteínas única conforme descrito neste protocolo.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Jean-Baptiste Sibarita e Daniel Choquet (IINS, CNRS/Universidade de Bordeaux) por seu apoio gentil com a análise de único-molécula. Agradecemos especialmente Nick Valmas e Jessica Mcgaw (QBI, Universidade de Queensland) por sua ajuda com o vídeo, gravação de voz-over, bem como design gráfico de figura. Este trabalho foi financiado pelo projecto de descoberta de Conselho de pesquisa australiano (AR) (DP170100125 a F.A.M.), o Conselho australiano de pesquisa (LIEF Grant LE0882864 a F.A.M.), futuro Fellowship (FT100100725 a B.V.S.), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078 a F.A.M.) e projeto NHMRC conceder (APP1103923 a B.V.S.). F.A.M. é um NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).
PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |